专利名称：神经系统发育相关蛋白及其编码序列和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码人神经系统发育相关蛋白hOLF50的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术：
分泌蛋白是一类功能非常重要的蛋白，在多细胞生物的生长、发育、细胞分化增殖、凋亡、细胞通讯、信号转导中发挥着重要作用。人体中分泌蛋白占人类蛋白质组的十分之一，它们参与了信号途径、血液凝固、免疫防御、癌症发生等多种过程，如消化酶、胞外基质与血浆中的很多主要因子，以及激素、神经肽、细胞因子等都是分泌蛋白。一些分泌蛋白具有潜在的临床应用价值，并已在实际上得到了广泛的应用，如生长激素、干扰素和白细胞介素等。
分泌蛋白是由信号肽(signal peptide)介导，进入内质网，然后分泌到细胞外。蛋白质分子中的信号肽研究开始于20世纪60年代，这方面的工作是在研究分泌蛋白的基础上进行的，当时的研究旨在了解，在核糖体上合成的新生肽链是通过何种途径被分泌到细胞外的。德裔美国科学家布洛贝尔(G.Blobel)，因对蛋白质分子中信号肽的开创性研究，获得了1999年度诺贝尔生理学或医学奖。
布洛贝尔的信号肽假说提出在一些新生肽链的N末端，有一段长度不等的肽段，通常由20～30个氨基酸残基组成。它们的存在，决定了含有这类肽段的新生肽链能被分泌到细胞外，而在已被分泌到细胞外的成熟蛋白质中，则不再含有这类肽段。含有这类肽段的肽链通常被些与细胞外相通的细胞器(包括内质网、高尔基体和溶酶体等)内的信号，因而也被称为信号肽。正在合成的新生肽链中的信号肽和信号肽识别颗粒(SRP)结合，然后SRP和其受体结合，以及核糖体和核糖体受体结合。当信号肽将新生肽链引导进入内质网腔内后，在信号肽酶复合物的作用下，已完成使命的信号肽被切除，被切除信号肽的肽链在内质网腔和高尔基体内，进一步经过各种类型的翻详后加工，包括肽链的折叠、一些残基的修饰(例如糖基化等)、前体的激活等，最终成为有特定结构和功能的蛋白质，并被定位到机体中的特定部位行使其功能。
分泌蛋白唯一共有的最普遍的特征就是氨基端的信号肽，信号肽在各个蛋白中都不相同，但有一些较类似的性质。起始的甲硫氨酸后是一些多为亲水的带正电荷的残基，该区为n区，然后是7-15个残基的疏水区h区，该区富含亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸，最后的c区包含信号肽蛋白酶的剪切位点。在剪切位点的-1和-3多倾向为丙氨酸或其他带短侧链的氨基酸，而在-4和-6位则为有助于剪切的脯氨酸。
鉴于神经系统发育相关蛋白与某些细胞的正常发育相关，因此本领域迫切需要开发新的神经系统发育相关蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人神经系统发育相关蛋白hOLF50蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的hOLF50多肽，它包含具有SEQID NO2或3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2或3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进PC-12细胞形成突触的功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述人hOLF50多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中286-1686位的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO1中391-1686位的核苷酸序列；(c)具有SEQ IDNO1中1-2741位的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有人hOLF50蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达人hOLF50蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人hOLF50蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的人hOLF50多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-2741个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人hOLF50多肽活性的化合物，以及抑制人hOLF50多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人hOLF50多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在hOLF50蛋白的方法，它包括将样品与hOLF50蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在hOLF50蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与人hOLF50多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。尤其是本发明的的hOLF50蛋白可用于在体外和体内促进神经细胞的生长，还可用制备促进神经细胞生长的组合物。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人hOLF50多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗神经系统方面的病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1A显示了本发明hOLF50基因的核苷酸(SEQ ID NO1)；其中基因全长为2741bp；编码区是286到1686。
图1B显示了本发明的人hOLF50蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO2)。该蛋白全长为467个氨基酸，pI＝6.68，Mw＝54KDa。其中，信号肽为第1-35位(黑体区域)，去除了信号肽的成熟蛋白示于SEQ ID NO3。OLF结构域位于第210-460位(下划线区域)。N-糖基化位点用方框内标出，共有7个，位置分别是第85，169，270，289，376，413，455位。
图2显示了对hOLF50进行PCR扩增的电泳图。
图3显示了对hOLF50进行Western印迹的结果。
图4显示了对hOLF50进行Northern印迹的结果。
图5显示了hOLF50在CHO细胞中的表达结果，分子量约为60KDa。
图6显示了hOLF50在大肠杆菌中的表达结果，GST-hOLF50的N端片段的融合蛋白的分子量约为60KDa。
图7显示了hOLF50对神经细胞PC-12生长的促进作用，其中空白对照为不加入任何物质；阴性对照为加入CHO细胞培养液，hOLF50培养上清液为表达hOLF50的CHO的培养上清液。
具体实施例方式
本发明首次从人中分离出了一个神经系统发育相关蛋白-hOLF50蛋白，并证明了它具有促进神经细胞形成神经突的功能，在此基础上完成了本发明。本发明蛋白在人体正常大脑组织(更多地在海马Hippocampus)特异性表达，hOLF50蛋白在中枢神经系统发育的后期和成熟神经元功能的维持中起了重要作用，具有潜在的药物开发潜力。
在本发明中，术语“hOLF50蛋白”、“hOLF50多肽”或“神经系统发育相关蛋白hOLF50”可互换使用，都指具有人神经系统发育相关蛋白hOLF50的全长氨基酸序列(SEQ ID NO2)或成熟氨基酸序列(SEQ ID NO3)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的神经系统发育相关蛋白hOLF50。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的hOLF50蛋白或多肽”是指hOLF50多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化hOLF50蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。hOLF50多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人hOLF50蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人hOLF50蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人hOLF50多肽”指具有人hOLF50蛋白活性的SEQ IDNO2或3序列的多肽。该术语还包括具有与人hOLF50蛋白相同功能的、SEQ IDNO2或3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人hOLF50蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人hOLF50 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hOLF50多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人hOLF50多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人hOLF50多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hOLF50多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人hOLF50蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人hOLF50多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人hOLF50蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2或3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表 1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2或3的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2或3的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列1以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEO ID NO2或3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码hOLF50蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的人hOLF50核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或hOLF50蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的hOLF50多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人hOLF50多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人hOLF50多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人hOLF50编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人hOLF50蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为约物治疗hOLF50蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗hOLF50蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人hOLF50蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人hOLF50蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人hOLF50 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人hOLF50基因产物或片段。较佳地，指那些能与人hOLF50基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人hOLF50蛋白的分子，也包括那些并不影响人hOLF50蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人hOLF50基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人hOLF50基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人hOLF50蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人hOLF50蛋白功能的抗体以及不影响人hOLF50蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人hOLF50基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人hOLF50基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人hOLF50蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人hOLF50蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人hOLF50蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人hOLF50蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人hOLF50蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人hOLF50蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人hOLF50蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与hOLF50蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于神经退行性疾病方面的治疗。在使用本发明hOLF50蛋白时，还可同时使用其他治疗剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明hOLF50多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的hOLF50蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
人hOLF50蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于hOLF50蛋白的无表达或异常/无活性的hOLF50蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的hOLF50蛋白，以抑制内源性的hOLF50蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将hOLF50基因转移至细胞内。构建携带hOLF50基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人hOLF50基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
抑制人hOLF50 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
能与人hOLF50蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人hOLF50蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人hOLF50蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人hOLF50蛋白水平，可以用作解释人hOLF50蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断hOLF50蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在hOLF50蛋白的方法是利用hOLF50蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与hOLF50蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在hOLF50蛋白。
hOLF50蛋白的多聚核苷酸可用于hOLF50蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，hOLF50蛋白的多聚核苷酸可用于检测hOLF50蛋白的表达与否或在疾病状态下hOLF50蛋白的异常表达。如hOLF50 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断hOLF50蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用hOLF50蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测hOLF50蛋白的转录产物。
检测hOLF50基因的突变也可用于诊断hOLF50蛋白相关的疾病。hOLF50蛋白突变的形式包括与正常野生型hOLF50 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明hOLF50蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人下丘脑cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID N01所示，它包含的多核苷酸序列全长为2741个碱基，其开放读框位于286-1686位，编码全长为467个氨基酸的人hOLF50蛋白(SEQ IDNO2)。可为治疗神经退行性疾病等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1hOLF50蛋白cDNA的克隆1.组织分离(Tissue isolation)下丘脑来源于5个正常成年男性供体，在死后四小时内取出下丘脑组织，立即置于液氮中冷冻保存。
2.mRNA的分离(mRNA isolation)取出组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。用带Oligo d(T)的纤维素柱分离总RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文库的构建(Construction of cDNA library)以mRNA为模板，合成双链cDNA，反转录引物见SEQ ID NO.1。补平末端后，加含EcoRI切点的接头，接头序列分别见SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性内切酶消化1.5小时，再进行片段分离。过柱筛选长度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，无菌水溶解，连接至Uni-ZAP XR载体(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)进行包装，宿主菌使用XL 1-Blue MRF′(Stratagene，CA9203，USA)细菌。涂板并测定滴度。
4.测序及数据库建立(Seqencing and Database Constructing)挑选文库中有外源片段插入的克隆，扩增后抽提质粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作为3′端和5′端的通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行EST大规模测序。测序结果用FACTURA软件去除载体序列，传输到SUN Ultra 450 Server上进行下一步的处理。所有的序列信息再用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，将无同源性或同源性低于95％的序列视为新基因建立数据库。
5.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基础上，进行cDNA全长克隆，分两阶段进行(1)“电子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作为探针搜寻dbEST数据库，将重叠序列＞50bp，同源性在98％以上的表达序列标签(Expressed Sequence Tag，简称“EST”)序列认为同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER软件进行拼接，部分EST可以延伸探针序列。再用STRIDER软件分析被延伸的序列是否具有完整的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜寻Genbank或SwissProt以确定该序列在核苷酸和氨基酸水平上是否与其他物种有同源性，以帮助判别所得到的基因全长完整性如何。通过电子克隆的方法，通常可获取hOLF50基因的全长序列。
(2)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通过“电子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全长，则在已有序列的5′或3′端设计引物，在人类下丘脑Marathon-Ready cDNA文库(Clontech Lab，Inc，USA)中进行长距离PCR反应。然后对PCR产物克隆、测序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER软件分析被延长的序列有无完整的ORF，如无，重复上述过程直至获得全长。
(3)RT-PCR对于5′和3′端已知的序列，如果中间尚有一段间隙(gap)无法从已有的公共数据库或自身数据库获得，可考虑采用RT-PCR的方法。在序列5′端设计引物，3′端引物采用Oligo-dT，在下丘脑总RNA库中进行扩增。然后对产物进行克隆、测序。最后拼接并获得全长。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的人hOLF50蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物HOFL50-F5′GCTCTAGACCTGCATGCCAGGTCGTT 3′(SEQ ID NO4)为正向引物，寡核苷酸引物HOFL50-R5′CGGAATTCTCAACTCGTCGGAGCGGAT 3为反向引物，以下丘脑组织的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR条件为94℃，4分钟，随之以94℃，30秒、54℃，30秒和72℃，1分钟30秒进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1423bp(见图2，含完整的ORF，对应于SEQ ID NO1中第286-1689位)。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、构建入购买的pcDNA3.1/Myc-His(-)A(购自Invitrogen公司)，命名为pcDNA-hOLF50测序验证序列和阅读框正确无误。
同时对ORF上游和下游的序列也用类似方法进行了测序，最终获得了SEQ IDNO1所示的序列。hOLF50 cDNA为2741bp(图1A和SEQ ID NO1)，含有完整的开放性读框，编码含467个氨基酸残基的全长多肽(图2B和SEQ ID NO2或3)。分析结果，已表明hOLF50蛋白含有35个氨基酸残基组成的信号肽，成熟的多肽分子由432个氨基酸残基组成(SEQ ID NO3)。
实施例2hOLF50基因的序列信息与同源性分析将hOLF50的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索和结构域分析。结果发现(1)染色体定位map＝9q34.3，含有6个外显子(exon)。
(2)蛋白功能结构域(Domain)1-35 信号肽210-460Olfactomedin样结构域464-467ER-Target基序Olfactomedin家族成员主要存在于中枢神经系统，在嗅觉、神经分泌和神经发育中起重要作用，目前已经发现的家族成员有olfactomedin、Noelin-1、latrophilin-1和TIGR等。
此外，hOLF50与小鼠AAC04320基因的相似性高达97％，小鼠的同源基因Pancortin-3，相似性高达97％，这两个基因均没有做任何功能研究，系功能未知基因。非常有意思的是在亲缘关系较远的鸡中发现了同源基因NOELIN-2，相似性高达95％，NOELIN-2的功能是在2000年8月才被Barembaum M，Moreno TA(NatCell Biol.2000 Apr；2(4)219-25，Barembaum M，Moreno TA，LaBonne C，Sechrist J，Bronner-Fraser M.)等揭示的，他们发现在鸡的中枢神经早期发育中，分泌蛋白NOELIN-2能促进神经管(neural tube)产生神经嵴(neural crest)细胞，对早期胚胎发育，特别是早期的中枢神经系统的发育起了关键作用。
本发明的人hOLF50除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人hOLF50还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人hOLF50蛋白的N端与大鼠eIF2a蛋白的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人hOLF50的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人hOLF50核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人hOLF50的表达水平或者抑制人hOLF50的过度表达。本发明的人hOLF50蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人hOLF50缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
由于本发明的人hOLF50蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种(如大鼠)的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
实施例3HOLF的瞬时表达用脂质体方法把实施例1中制备的质粒pcDNA-hOLF5转染入COS-7细胞中，培养三天后，取细胞培养上清做Western blot检测。
把质粒pcDNA-hOLF50瞬间转染COS-7细胞，用Western blot检测细胞上清和细胞裂解物，同设置h-GH(生长激素)为阳性对照，空载pcDNA3.1-A为阴性对照。
结果表明，hOLF50基因是一个分泌蛋白基因(图3)。
实施例4hOLF50的组织表达谱通过常规方法，用购自Clontech公司的正常成人12组织膜(MTN)，以hOLF50的编码区片段为模板，制备cDNA同位素标记探针，进行标准的Northern印迹分析。
结果表明，hOLF50基因专一性的表达与大脑中(图4)。
实施例5hOLF50的真核表达用脂质体方法把质粒pcDNA-HOLF5转染入COS-7细胞中，培养三天后，换用含有G418的培养基继续培养，从而筛选阳性克隆(含有插入hOLF50基因的细胞，获得了用来大量生产真核产品hOLF50蛋白的CHO稳定表达细胞株(共9个细胞株)。
Western blot检测结果如图5所示，表明这些转化的CHO细胞株大量表达hOLF50(分子量约60KDa)。
实施例6hOLF50的原核表达合成以下引物正向引物HOLF50-GSTF-F(EcoRIG\AATTC)对应位置是SEQ IDNO1中的391-409位5′GGAATTC ACCAACCCTGAGGAGAGCT 3′(SEQ ID NO6)反向引物HOLF50-FR300-R(Not IG\CGGCCGC)对应位置是SEQ IDNO1中的1290-1273位5′AAATATGCGGCCGC CGAGTGGCCACCCCAGGC 3′(SEQ ID NO7)以质粒pcDNA-HOLF5或反转录的下丘脑mRNA形成的cDNA为模板，获得扩增产物(对应图1A和SEQ ID NO1中的第391-1290位，编码hOLF50基因的N端300个氨基酸)，EcoRI和Not I酶切后构建入原核表达载体pGEX-5x-1，转化导入BL21细菌，用IPTG诱导约3到5小时，离心收菌，超声裂解细胞。分离获得GST-hOLF50N端片段的融合蛋白(分子量约60Kda)。
结果如图6所示。带+者为有IPTG诱导，从而表达出阳性对照，和hOLF50蛋白片段，而不加IPTG者不表达。
实施例7hOLF50对神经细胞生长的促进作用试验方法将实施例5制备的表达hOLF50的细胞株CHO的培养上清(含5％的小牛血清)加入PC-12细胞培养基中，按常规方法培养。
结果约7天可看到PC-12细胞(大鼠嗜铬瘤细胞，一种神经系统研究的模型细胞)长出突触样的突起，而空白(不加任何物质)和阴性(加对照CHO细胞培养上清)对照均无此现象。这表明，本发明蛋白hOLF50具有促进神经细胞生长和形成神经突的功能(图7)。
实施例8抗人hOLF50抗体的制备1.免疫小鼠和脾细胞的制备将实施例5和实施例6中获得的hOLF50蛋白用层析法进行分离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾细胞制备见鄂征主编，《组织培养和分子细胞学技术》，北京出版社，第210页。
2.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第630页中的方法，制备饲养细胞。
3.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第213页中的方法，进行细胞融合。
4.抗体的检测在细胞融合10-15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长，就应用hOLF50蛋白做抗体活性的初步筛选，常用的方法有免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后，立刻进行克隆培养，并分离出抗体。
讨论从药物治疗的角度看，分泌蛋白占据了蛋白药物治疗的绝大部分，例如一些组织特异的纤溶酶原激活因子、红细胞生成素、蛋白激素和消化酶等。这些蛋白药物在激素调节、疼痛减轻、血液凝固、免疫反应、癌症发生、血管生成等许多领域有重要意义。
hOLF50蛋白是本发明人筛选到的一个新的分泌蛋白，非常有意义的是它只专一性的在人大脑组织大量表达，并更多的表达于海马(Hippocampus)。在中枢神经系统发育和维持中起着重要的作用，在神经退行性疾病治疗和学习记忆方面有潜在的开发价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>神经系统发育相关蛋白及其编码序列和用途<130>034758<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2741<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(286)..(1686)<223>
<400>1gcgcggggga gccattagga ggcgaggaga gaggagggcg cagctcccgc ccagcccagc 60cctgcccagc cctgcccgga ggcagacgcg ccggaaccgg gacgcgataa atatgcagag120cggaggcttc gcgcagcaga gcccgcgcgc cgcccgctcc gggtgctgaa tccaggcgtg180gggacacgag ccaggcgccg ccgccggagc cagcggagcc ggggccagag ccggagcgcg240tccgcgtcca cgcagccgcc ggccggccag cacccagggc cctgc atg cca ggt cgt297Met Pro Gly Arg1tgg agg tgg cag cga gac atg cac ccg gcc cgg aag ctc ctc agc ctc 345Trp Arg Trp Gln Arg Asp Met His Pro Ala Arg Lys Leu Leu Ser Leu5 10 15 20ctc ttc ctc atc ctg atg ggc act gaa ctc act caa gtg ctg ccc acc 393Leu Phe Leu Ile Leu Met Gly Thr Glu Leu Thr Gln Val Leu Pro Thr25 30 35aac cct gag gag agc tgg cag gtg tac agc tct gcc cag gac agc gag 441Asn Pro Glu Glu Ser Trp Gln Val Tyr Ser Ser Ala Gln Asp Ser Glu40 45 50ggc agg tgt atc tgc aca gtg gtc gcc cca cag cag acc atg tgt tca 489Gly Arg Cys Ile Cys Thr Val Val Ala Pro Gln Gln Thr Met Cys Ser55 60 65cgg gat gcc cgc aca aaa cag ctg agg cag cta ctg gag aag gtg cag 537Arg Asp Ala Arg Thr Lys Gln Leu Arg Gln Leu Leu Glu Lys Val Gln70 75 80aac atg tct caa tcc ata gag gtc ttg gac agg cgg acc cag aga gac 585Asn Met Ser Gln Ser Ile Glu Val Leu Asp Arg Arg Thr Gln Arg Asp85 90 95 100ttg cag tac gtg gag aag atg gag aac caa atg aaa gga ctg gag tcc 633Leu Gln Tyr Val Glu Lys Met Glu Asn Gln Met Lys Gly Leu Glu Ser105 110 115aag ttc aaa cag gtg gag gag agt cat aag caa cac ctg gcc agg cag 681Lys Phe Lys Gln Val Glu Glu Ser His Lys Gln His Leu Ala Arg Gln120 125 130ttt aag gcg ata aaa gcg aaa atg gat gaa crt agg cct ttg ata cct 729Phe Lys Ala Ile Lys Ala Lys Met Asp Glu Leu Arg Pro Leu Ile Pro135 140 145gtg ttg gaa gag tac aag gcc gat gcc aaa ttg gta ttg cag ttt aaa 777Val Leu Glu Glu Tyr Lys Ala Asp Ala Lys Leu Val Leu Gln Phe Lys
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<221>misc_feature<223>引物<400>7aaatatgcgg ccgccgagtg gccaccccag gc 3权利要求
1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2或3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进PC-12细胞形成突触的功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中286-1686位的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO1中391-1686位的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID NO1中1-2741位的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出人hOLF50蛋白。
9.一种能与权利要求1所述的人hOLF50蛋白特异性结合的抗体。
10.一种权利要求1所述多肽的用途，其特征在于，用于促进神经细胞的生长。
全文摘要
本发明提供了一种新的神经系统发育相关蛋白－hOLF50蛋白，编码hOLF50蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种hOLF50蛋白的方法。本发明还公开了编码这种hOLF50蛋白的多核苷酸的用途。hOLF50蛋白具有促进神经细胞形成神经突的功能。
文档编号C07K14/435GK1618805SQ200310108758
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者曾令春, 韩泽广 申请人:上海人类基因组研究中心