对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0015] 实施例1:舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因全长克隆 舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因核酸序列750 bp，开放阅读框600 bp，编码199个氨基酸， 分子量大小为22. 84 kDa，理论等电点PI为5. 50,为一酸性蛋白。
[0016] 提取舞毒蛾总RNA，使用反转录试剂盒PrimeScript?RT reagent Kit (TaKaRa) 合成cDNA第一条链，再以cDNA第一链为模板，根据舞毒蛾幼虫转录组序列在基因非 编码区序列的两侧设计引物(正向引物：5' -CAGTAAACAGTATTCGAAG-3' ；反向引物：5' -AGGCGAAAGAAACAAGCACT-3,。
[0017] 反应体系：5XPrimeScript buffer 2 μ L、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0· 5 μ L、Oligo d (T) primer (50 μ M) 0.5 μ L、Random 6 mers (100 μ M) 0.5 μ L、Total RNA 0.5 yg RNase Free ddH20 补足 10 μ LuPCR 扩增程序如下：94°C 3 min ;94°C 30 s，60°C 30s，72°C I min，35个循环；72°C延伸10 min。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电 泳检测，用胶回收试剂盒回收750 bp的条带，见图3。将回收得到的条带与pMDlS-T载体连 接过夜，将连接产物转化DH5a感受态细胞。通过菌液PCR检测的阳性克隆菌液，送至北京 华大生物技术有限公司测序以验证读码框。
[0018] 实施例2:舞毒蛾Hsp23基因 dsRNA的合成 根据实施例1中所克隆的舞毒蛾Hsp23基因全长，设计合成Hsp23基因 dsRNA正向引 物（5 ' -ATGTCGTTAATTCCTTACATGTA-3 '）和反向引物（5 ' - CTAATTAGATTCTTCAATTGTCG-3 '）， 扩增得到片段长度为516bp的序列，通过体外dsRNA合成试剂盒获得Hsp23基因的dsRNA。
[0019] 具体地合成过程是，在每条特异性引物的Y端加有一段20 bp左右的T7启动子 序列，用GFP作为对照组。通过PCR法扩增目的条带，反应程序为：94°C 3 min ;94°C 30 s，60°C 30 s，72°C I min，35个循环；72°C 7 min，扩增产物经电泳检测确认后作为模板 合成dsRNA (参照MEGAscript RNAi Kit试剂盒说明书)，于紫外分光光度计检测dsRNA浓 度，并取〇. 5 PL dsRNA于1%琼脂糖凝胶电泳检测确认，-80°C保存备用。
[0020] 实施例3:舞毒蛾Hsp23基因沉默效果的检测 将实施例2合成的Hsp23基因和GFP基因的dsRNA (1 μ g)，微注射入舞毒蛾3龄幼 虫，分别于6、24、48、96、144 h选取活泼的3龄幼虫，采用RNeasy Mini动物组织总RNA提 取试剂盒（Qiagen)提取总RNA，采用PrimeScript?RT试剂盒（TaKaRa)合成cDNA第一条 链，以此为模板，运用荧光定量RT-PCR检测注射后Hsp23基因的表达量。注射dsRNA舞毒 蛾3龄幼虫Hsp23基因表达水平如图2所示。结果表明，外源对照基因 GFP的dsRNA注入 舞毒蛾幼虫体内会影响Hsp23基因的表达。与对照GFP基因相比，Hsp23基因沉默效果高于 对照。注射6h时，dsRNAHsp23的沉默效果是dsRNAGFP沉默的1. 82倍，随着时间的增加， dsRNAHsp23的沉默效果有所下降，处理4d时，沉默效果最差，为对照的76. 08%，在处理第5d 时，沉默效应最佳，为对照组的6. 78倍（内参基因为Actin、EFl a、TUB，引物见表1)。
[0021] 表I RNAi干扰中的相关引物
【主权项】
1. 舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因，其特征在于所述Hsp23基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因，其特征在于所述Hsp23基因编 码氨基酸的序列如SEQ ID No. 1所示。
3. 根据权利要求1所述的舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因，其特征在于所述Hsp23编码氨 基酸序列的引物对为： 正向引物 LdHsp23F: 5 ' -ATGTCGTTAATTCCTTACATGTA-3 ' ； 反向引物 LdHsp23R:5' - CTAATTAGATTCTTCAATTGTCG-3'。
4. 权利要求1所述舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因 dsRNA，其特征在于所述dsRNA的核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所示。
5. 权利要求4所述舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因 dsRNA在防治舞毒蛾生长发育中的应 用。
6. 根据权利要求5所述的舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因 dsRNA在防治舞毒蛾生长发育中 的应用，其特征在于所述舞毒蛾为亚洲型舞毒蛾。
7. 根据权利要求5所述的舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因 dsRNA在防治舞毒蛾生长发育中 的应用，其特征在于所述Hsp23基因 dsRNA的注射剂量为1 μ g。
【专利摘要】本发明公开了一种舞毒蛾热激蛋白Hsp23基因及其dsRNA在无公害防治中的应用。所述Hsp23基因的核苷酸序列和编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，由该基因部分序列片段合成dsRNA，其序列如SEQ ID No.2所示。Hsp23基因dsRNA可应用在防治舞毒蛾生长发育中。实验结果表明：当舞毒蛾幼虫注射Hsp23基因dsRNA后，与对照（注射ddH2O和GFP基因dsRNA）相比均有较强的沉默效果，致使舞毒蛾幼虫生长发育受到抑制。因此发明提出可利用Hsp23的沉默技术来防治林木重要害虫舞毒蛾及具有相似结构域的鳞翅目害虫，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。
【IPC分类】C12N15-113, A01P7-04, A01N57-16, C12N15-12, C12N15-89
【公开号】CN104561018
【申请号】CN201510054280
【发明人】曹传旺, 王超, 孙丽丽, 邹传山, 刘鹏
【申请人】东北林业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年2月3日