一种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核 酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM)是发病率高居血液系统第二位的恶性肿 瘤，目前仍无法治愈，严重威胁国民的生活与健康。常规化疗乃至新药在降低肿瘤负荷的同 时，对维持自我更新的骨髓瘤干细胞收效甚微，被认为是MM最终进展复发的关键。因此，迫 切需要针对MM复发的源头进一步研宄，开发新的更安全有效的靶向治疗，真正改善MM患者 的生存和预后。
[0003] Wnt基因属原癌基因，是多种肿瘤发生的关键，也是肿瘤干细胞发育过程中的重 要调节信号。我们早期的研宄显示：1)骨髓瘤细胞中fct信号转导途径高度激活，与骨 髓瘤细胞的增殖及耐药相关；2)经典Wnt途径中的关键效应蛋白β-catenin通过泛素 蛋白酶体途径降解，降低β -catenin水平可抑制骨髓瘤细胞增殖，促进其凋亡，提示Wnt/ β -catenin途径的激活对MM的进展十分重要，针对该途径进一步深入研宄，有望找到避免 丽复发的关键。
[0004] 理论上，β-catenin的泛素化降解，应该还受到其他作用的牵制与调节；事实上， 研宄也已经发现：作为继磷酸化、泛素化后的又一大蛋白翻译后修饰体系，细胞内的小泛素 相关修饰物SUMO (small ubiquitin-related modifier)可通过竞争一些底物蛋白的泛素 化结合位点，阻止其蛋白酶体途径降解，影响下游信号转导。大量蛋白被证实同时受到泛素 化及SUMO化修饰的调节，包括一些重要信号通路蛋白，如IKB、Smad4、Huntingtin等都通 过SUMO化修饰避免泛素化降解，保持自身稳定，参与肿瘤发生。SUMO化修饰在骨髓瘤中的 研宄不多，仅有一篇Blood最新报道显示：所有检测的骨髓瘤细胞系及原代细胞都高表达 SUMO化修饰所必须的关键酶，其高表达程度与预后不良相关，提示SUMO化修饰过度激活促 进丽的进展，但机制不清。
[0005] 目前，通过干扰Wnt/ β -catenin途径的SUMO化修饰是否可以影响骨髓瘤细胞生 物学活性，进而影响MM的临床疗效和预后，国内外未有报道。是继泛素化后又一大蛋白修 饰体系，可拮抗底物蛋白的泛素化降解。早期的研宄表明：Wnt途径激活促进多发性骨髓瘤 (MM)细胞增殖耐药；其关键效应蛋白β-catenin通过泛素蛋白酶体系统降解。预实验又 进一步证实：SUMO可直接修饰调节β -catenin蛋白水平。目前已知SUMO化修饰过度激活 与MM预后不良相关，但具体机制不清。
[0006] SUM0-1 基因 ，GENBANK 号 7341 (参见网址：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ gene/7341)，目前尚没有SUM0-1基因高表达或抑制SUM0-1基因的表达与多发性骨髓瘤相 关的文献报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核酸，本发明的另一目 的在于提供该小干扰核糖核酸在制备预防或治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
[0008] 本发明要解决的技术问题是：针对目前在多发性骨髓瘤的治疗中缺乏有效治疗分 子靶标的问题，提供一种有效的解决方法，即将一种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核酸的 靶标多核苷酸，将所述靶标多核苷酸在制备或筛选抗多发性骨髓瘤药物中的应用。
[0009] 本发明人发现SUMO化修饰是通过保护β -catenin免受泛素化降解，促进Wnt途 径激活，最终导致多发性骨髓瘤进展的关键信号通路。发明人在体外以MM细胞系及原代细 胞为研宄对象，通过siRNA干扰，比较不同SUMO水平下Wnt途径活性及丽细胞增殖凋亡比 例变化；然后调节β -catenin蛋白表达，观察其对SUMO化修饰作用的影响，明确了 SUMO化 修饰是通过fct/ β -catenin途径影响骨髓瘤细胞增殖凋亡活性的。本发明开发了新的骨 髓瘤的治疗靶标，可以显著改善MM患者的预后。发明人通过针对以下几方面进行研宄，最 终完成了本发明：
[0010] (1)通过SiRNA干扰多发性骨髓瘤细胞SUM0-1表达，检测Wnt途径下游分子表达 及骨髓瘤细胞增殖凋亡比例变化；（2)明确了干扰多发性骨髓瘤细胞中SUM0-1基因的表达 对β -catenin表达水平的影响关系；（3)构建并转染β -catenin质粒，转染SUM0-1干扰 组细胞，观察SUM0-1被抑制情况下，提高β -catenin表达水平对多发性骨髓瘤细胞增殖凋 亡的影响；(4)检测了多发性骨髓瘤细胞系中SUM0-1基因和β -catenin蛋白之间的内在 作用。
[0011] 通过分析所得实验结果，发明人惊喜地发现：（1) β -Catenin蛋白的SUMO化修饰 是促进Wnt激活的革El点；（2)通过革El向调控Wnt/ β -catenin途径的SUMO化修饰可减少多 发性骨髓瘤细胞的增殖，并促进肿瘤细胞凋亡，可显著降低多发性骨髓瘤细胞的增殖速度， 最终完成了本发明。
[0012] 因此，为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种抗多发性骨髓瘤 的小干扰核糖核酸的靶标多核苷酸，所述靶标多核苷酸是序列表中SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3中任一所示序列的多核苷酸。
[0013] 本发明所述的靶标多核苷酸，较佳地由SUM0-1基因编码区序列上的连续10?30 个核苷酸构成的多核苷酸，更佳地为15?27个核苷酸构成的多核苷酸；最佳地是序列表中 SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3中任一所示序列的多核苷酸。
[0014] 本发明所述的靶标多核苷酸还包括与所述的靶标多核苷酸在严紧杂交条件下杂 交的多核苷酸，或者与其互补的多核苷酸。其中所述杂交条件根据测量杂交时所用条件的 严紧性程度来分类。严紧性程度可以核酸结合复合物或探针的解链温度Tm为依据，或者以 杂交液的盐或离子强度条件为依据。所述杂交较佳地在标准条件下进行；更佳地，多聚核 苷酸杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标 记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0. lwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、 加入1/20的稀释抑制剂以及2?8XSSC。20XSSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的 溶液。杂交温度为50?70°C。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温 度较佳地为室温，优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成较佳地为6 X SSC+0. 1% SDS(Wt)溶 液，优选为5 X SSC+0. 1% SDS(Wt)。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或 RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。具体实验步骤请参照"分子克 隆"中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学部分中记载 的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology) 〇
[0015] 本发明所述靶标多核苷酸的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为通过人工 合成的方式或者通过从基因组中扩增的方式制备。
[0016] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案之二是：一种抗多发性骨髓瘤的小干扰 核糖核酸（siRNA)，所述的小干扰核糖核酸包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义 RNA片段如SEQ ID NO :4所示，所述反义RNA片段如序列表中SEQ ID NO :5所示。
[0017] 本发明所述小干扰核糖核酸是一种寡聚RNA分子，其长度较佳地为21?25个核 苷酸，所述小干扰核糖核酸的主要功能是激发与之互补的目标mRNA的沉默。
[0018] 本发明所述小干扰核糖核酸较佳地包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义 RNA片段和反义RNA片段通过彼此间互补碱基的互补配对作用形成双链RNA区域。当正义 RNA片段和反义RNA片段位于不同的RNA链时，形成双链RNA分子；当正义RNA片段和反义 RNA片段位于同一条RNA链时，则形成具有颈环结构的单链RNA分子，所述单链RNA分子可 以包含超过一个以上的颈环结构。
[0019] 本发明所述的小干扰核糖核酸长度为较佳地为8?50个核苷酸，其正义片段和反 义片段之间互补区域的碱基对较佳地为15?18个碱基对。其中所述正义RNA片段较佳地 如SEQ ID NO :4所示，所述反义RNA片段较佳地如序列表中SEQ ID NO :5所示。
[0020] 本发明中所述的小干扰核糖核酸的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为通 过人工合成的方式或者通过从基因组扩增的方式制备而得。
[0021] 本发明所述小干扰核糖核酸更佳地是人工合成的双链干扰RNA (dsRNA)，转染细胞 后在细胞内通过Dicer酶系统加工获得的siRNA ;通过人工合成直接获得的siRNA ;或者通 过构建相应的慢病毒载体，在靶标细胞内持续表达获得的siRNA。
[0022] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案之三是：一种抗多发性骨髓瘤的小干扰 核糖核酸，所述的小干扰核糖核酸包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段如 SEQ ID NO :6所示，所述反义RNA片段如序列表中SEQ ID NO :7所示。
[0023] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案之四是：一种抗多发性骨髓瘤的小干扰 核糖核酸，所述的小干扰核糖核酸包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段如 SEQ ID NO :8所示，所述反义RNA片段如序列表中SEQ ID NO :9所示。
[0024] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案之五是：一种治疗多发性骨髓瘤的药物 组合物，其包含如上所述的小干扰核糖核酸以及药学上可接受的载体。
[0025] 本发明所述药物组合物中药学上可接受的载体为本领域常规载体，所述药学上可 接受的载体较佳地为赋形剂，悬浮剂，填充剂和稀释剂。本发明所述药物组合物的剂型为本 领域常规剂型，较佳地为水溶液，悬浮剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物，乳液，可喷洒溶液，水性 分散系，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。
[0026] 本发明所述药物组合物至少包括一种本发明所述的小干扰核糖核酸作为活性成 分和一种药学上可接受的载体。其中所述的药物组合物制备方法较佳地采取本领域常规的 方法，将本发明所述小干扰核糖核酸作为活性成分，与药学上可接受的载体制成各种剂型。 其中所述的药学上可接受的载体是本领域常规的药用载体，如填充剂、悬浮剂、稀释剂和赋 形剂等。在各种制剂中，较佳地为水溶液，所述水溶液的浓度较佳地为80-120nM，更佳地为 IOOnM0
[0027] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案之六是：一种如上所述的靶标多核苷酸 在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应用。
[0028] 本发明所述应用较佳