专利名称：一种透明质酸键合聚乙烯亚胺共聚物、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚合载体材料，属于生物医学材料领域，具体涉及一种透明质酸键合聚乙烯亚胺的共聚物、其制备方法及应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象的发现与研究，为基因治疗带来新的契机，它正以飞快地速度发展成为基因治疗主要手段。由21-23个碱基对构成的双链小干扰核糖核酸(small interference RNA, siRNA) [1’2]，可在动物细胞质中特异性降解与其碱基对互补的信使RNA(mRNA)，从而阻断mRNA编码蛋白质的表达，实现基因沉默[3’4]，即RNA干扰。但是，siRNA在机体内会被快速酶解，而且细胞对siRNA的摄取量很少，所以体内siRNA 的基因沉默效率很低[5_7]。为了解决这些问题，人们探究了许多种能以静电形式与siRNA结合形成缩聚毫微粒的阳离子高分子材料，在促进细胞内传递的同时也增加了酶攻击的稳定性[8’弋阳离子高分子材料中的聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)被广泛用于凝聚 DNA质粒、siRNA和反义链脱氧核苷酸(ODN) [1°_12]。带有正电荷PEI与siRNA形成了带有正电荷的复合物体，经内吞等方式进入细胞后先形成内涵体，通过PEI质子海绵吸附作用 (proton sponge effect)，导致复合物从内涵体逃逸后直接进入细胞质，来实现靶向基因沉默。但是该过程中，由于正电荷表面特征siRNA/PEI复合物能引起补体活化[13]、血细胞凝固[14]以及血清蛋白的自我聚集[15]。此外，PEI固有的细胞毒性限制了它在活体基因治疗中的应用[16]。为了缓解这些问题，常采用各种多聚阴离子在不破裂siRNA/PEI复合物结构的同时将其外包[15’16]，增加siRNA/PEI复合物转移率。我们选择了具有无毒无免疫原性、靶向细胞表面 CD44 (Cluster determinant 44) [10]> LYVE-I (lymphatic vessel endothelial hyaluronan rec印tor_l)[17]受体的透明质酸(Hyaluronic Acid, HA)作为 PEI 聚合物的轭合物能够减少PEI对细胞毒性、增加血清稳定性以及通过HA受体介导的细胞内吞作用维持内涵体脱离的能力，促进siRNA/PEI-HA复合物被细胞摄取，进而提高对靶向基因沉默效率。
发明内容
本发明涉及一种透明质酸(Hyaluronic Acid, HA)键合聚乙烯亚胺 (Polyethyleneimine, PEI)的聚合载体材料、制备方法及其应用，该聚合载体材料以HA作为骨架，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylamin0pr0pyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC 'HCl]作为交联剂，嫁接到 PEI 上，形成HA-PEI
聚合载体材料，所述HA-PEI化合物的制备过程用结构式表示如下
权利要求
1.一种透明质酸键合聚乙烯亚胺的聚合载体材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤a.将浓度为0.5 ％ig/mL的透明质酸溶液溶解于同体积的聚乙烯亚胺溶液中，用HCl 调PH值到6. 5，其中，所述聚乙烯亚胺溶液浓度是透明质酸溶液浓度的20倍；b.向体积百分比为50%的二甲基亚砜溶液中按Iml 68. 9mg的比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-苯并-三氮唑的混合物，所述混合物中1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与1-羟基-苯并-三氮唑的质量比为 40. 4 28. 5 ；c.将步骤b所得溶液按1 20的体积比加入到步骤a所得溶液中，在常温下搅拌混合 24小时之后，用NaOH调pH到7. 0 ；d.将步骤c所得溶液经过分离纯化和浓缩后制得聚合载体材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的透明质酸的平均分子量为200 道尔顿 300万道尔顿，所述的聚乙烯亚胺的平均分子量为200道尔顿 25，000道尔顿。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述的透明质酸的平均分子量为132，300道尔顿，所述的聚乙烯亚胺的平均分子量为25，000道尔顿。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤d所述的分离纯化方法为在 IOOmmol/L NaCl溶液中透析2天，在25wt%的乙醇中透析1天，纯化水中透析1天；步骤d 所述的浓缩方法为冷冻干燥法。
5.如权利要求1或4所述的制备方法制备的透明质酸键合聚乙烯亚胺的共聚物载体材料。
6.如权利要求1所述的制备方法制备的透明质酸键合聚乙烯亚胺的共聚物载体材料作为基因载体、制备生物医药中的应用。
7.根据权利要求6所述的共聚物载体材料作为基因载体的应用，其特征在于共聚物载体材料与能在真核细胞内沉默血管生成因子的基因、癌基因和报告基因的siRNA形成复合物，并转染动物来源的内皮细胞、上皮细胞及癌细胞。
8.根据权利要求7所述的共聚物载体材料作为基因载体的应用，其特征在于共聚物载体材料与siRNA形成的复合物的平均粒径小于lOOnm。
9.根据权利要求8所述的共聚物载体材料作为基因载体的应用，其特征在于共聚物载体材料与siRNA形成的复合物的平均粒径为20nm。
10.根据权利要求6所述的共聚物载体材料在制备医药中的应用，其特征在于共聚物载体材料与siRNA形成复合物，通过局部给药、口腔吸附给药的途径，应用于肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗。
全文摘要
本发明涉及一种透明质酸键合聚乙烯亚胺的聚合载体材料、制备方法及其应用，该聚合载体材料以透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)作为骨架，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)作为交联剂，嫁接到聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)上，形成的HA-PEI聚合载体材料，本聚合载体材料能够提高基因/阴离子蛋白质在细胞内的靶向性，降低对细胞的毒性、以及提高靶向基因的转化效率，具有广泛的应用前景。
文档编号C08B37/08GK102408498SQ201110276350
公开日2012年4月11日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者冯晓娜, 王慧国, 董爽, 蒋革 申请人:大连大学