专利名称：毛形属线虫免疫核糖核酸制备方法及医用用途的制作方法
技术领域：
本发明公开一种毛形属线虫免疫核糖核酸制备方法，尤其是公开了毛形属线虫免疫核糖核酸在防治人和动物免疫功能低下引起的疾病如肿瘤等的用途，属于生物制药技术领域。
背景技术：
在长期的生物进化过程中，毛形属线虫(Trichinella)在人和动物体内生存，能产生许多天然物质(很可能类似肿瘤的抗原)，虽然目前我们尚未搞清楚其确切的结构和功能，但它们确实具有增强人和动物的免疫功能如防治肿瘤病，这一点已被我们前时的试验所证实。免疫核糖核酸具有传递免疫信息功能，能将供体对某些抗原的特异性免疫信息传递给受体的T细胞和B细胞，使之产生特异性致敏淋巴细胞和抗体，从而提高受体的免疫功能。达到防治肿瘤等免疫缺陷疾病的目的。目前已广泛用于治疗肺癌、慢性肾炎等免疫缺陷病等，因而用毛形属线虫免疫动物后提取免疫核糖核酸防治人和动物的肿瘤病等是切实可行的。
发明内容
本发明公开一种毛形属线虫免疫核糖核酸制备方法。
本发明还公开了毛形属线虫免疫核糖核酸在防治人和动物免疫功能低下引进疾病的医用用途，同时提供了相应的药物制剂。
本发明的技术方案如下1、毛形属线虫免疫核糖核酸制备(1)、动物免疫将旋毛形线虫免疫一岁龄羊或马、猪、牛等动物，检查无传染病后加福氏佐剂(羊毛脂一份，液体石蜡一份混合高压灭菌，4℃保存备用)制成乳化的油包水状，于淋巴结内每只注射1ml，12-14天处死，取肝、脾、心、肺和肾等，进行免疫核糖核酸提取。
(2)免疫核糖核酸提取①采用肝脏免疫核糖核酸制备方法将羊或马、猪、牛等动物肝用生理盐水洗净，切成小块，加入1-2倍体积0.1mol/L氯化钠，0.05mol/L枸橼酸三钠Triton-100，用组织捣碎机制成匀浆，离心3500r/min 20min，得离心上清液。取上清液加入等体积0.2mol/L三乙醇胺、10g/L十二烷基硫酸钠、0.002mol/L乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀后，加等体积90％苯酚、等体积氯仿，于室温下震荡30min，离心3500r/min，20min，得提取物上清液，再加入等量氯仿振摇，反复2-3次，至中间层界面无明显蛋白层为止，离心除去蛋白，收集上清液。将上清液加入1/10体积200g/L乙酸钾和2倍体积-20℃的无水乙醇于0℃放置1小时，离心，得白色沉淀。将沉淀溶解于含有0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.01mol/L乙酸钠溶液中，加等体积2.5mol/L磷酸氢二钾，于不断搅拌下再加等体积的乙二醇甲醚，0℃放置30min，离心，得上清液。将上清液在0℃不断搅拌下，加入等体积0.2mol/L乙酸钠液和1/4体积10g/L溴化十六烷基三甲基铵，0℃放置30min，离心取沉淀，用0.1mol/L乙酸钠液、70％乙醇反复洗涤5次，至无泡沫为止。沉淀溶解于0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠，除菌过滤，测定含量，无菌灌装，冷冻干燥，即得免疫核糖核酸制品。将该制剂免疫动物后，观察其防治肿瘤等疾病的效果。
②采用脾免疫核糖核酸制备。
将免疫动物马(羊、猪、牛等动物)的脾脏去除脂肪组织，称重，剪碎，加入用等量含5g/L十二烷基硫酸钠、0.14mol/L氯化钠，0.2％吐温-80和1g/L皂土的0.01mol/L乙酸缓冲液，置组织捣碎机中制成匀浆，以3000r/min离心分离，上清液加等体积含5g/L十二烷基硫酸钠，0.14mol/L氯化钠和0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠的0.01mol/L的乙酸缓冲液，搅拌15min，加等体积的80％苯酚搅拌10min，以3000r/min离心20min，吸取上层水相，加1/2体积用上述乙酸缓冲液配成的90％苯酚，搅拌5min，离心3000r/min、20min。吸取上层水相，加入氯化钠至0.1mol/L，在搅拌下加入2.5倍体积预冷至-20℃的95％乙醇，于-10℃以下冷库沉淀，离心2000r/min、10min。收集沉淀物溶于适量的0.14mol/L氯化钠溶液中，加入等体积氯仿，振摇10min，离心3000r/min、15min。吸取水相，搅拌下加入2.5倍体积，冷至-20℃的95％乙醇洗涤，离心2000r/min、共10min，6号垂熔漏斗过滤，无菌分装冷冻干燥，即获得脾免疫核糖核酸制剂。将该制剂免疫动物后，观察其防治肿瘤等疾病的效果。
适应症主要用于肿瘤病、早期癌症、性功能低下和病毒病等免疫功能低下或缺陷引起的疾病的预防和治疗，兼有保健功能。
使用方法皮下注射于淋巴引流区域，每周一次，每次2-4mg，连用1-3个月，其剂量和次数视人和动物的病情、年龄、体质和防治的目的而定。
下述药理实验证实了本发明药物制剂在预防和治疗人和动物免疫功能低下引起的疾病的医用用途。
将健康纯系BALB/C(雌雄各半，体重18-20g)随即分为四组，每组10只，除第一组注射生理盐水100μl外，其余3组分别给予羊脾免疫核糖核酸0.006mg、0.008mg和0.01mg，间隔一周重复免疫一次，连续3次。各组小鼠于第二次免疫后分别以100μl含1×106个SP2/0骨髓瘤细胞于鼠的左后肢皮下注射，最后一次免疫后，解剖小鼠观察免疫核糖核酸的抗肿瘤效果(见表1)。由表1可以看出，不同剂量的毛形属线虫免疫核糖核酸接种BALB/C鼠后，无论从肿瘤大小、重量和无瘤生长小鼠比率看均与对照组有明显差异。
表1 免疫核糖核酸抗SP2/0肿瘤效果
**代表试验组与对照组相比差异极显著本发明的积极效果在于毛形属线虫免疫核糖核酸医疗效果好、适用于工业化制备，生产成本低，制剂安全、作用范围广，可用于预防和治疗人和动物免疫功能低下引起的疾病医药用途。
图1为免疫核糖核酸电泳结果图。
具体实施例方式
实施例11)、动物免疫将100mg旋毛形线虫免疫一岁龄羊，检查无传染病后加福氏佐剂(羊毛脂一份，液体石蜡一份混合高压灭菌，4℃保存备用)制成乳化的油包水状，于淋巴结内每只注射1ml，12-14天处死，取肝、脾、心、肺和肾等，进行免疫核糖核酸提取。
肝脏免疫核糖核酸提取将羊肝用生理盐水洗净，切成小块，加入1-2倍体积0.1mol/L氯化钠，0.05mol/L枸橼酸三钠Triton-100(PH＝7)，用组织捣碎机制成匀浆，离心3500r/min 20min，得离心上清液。取上清液加入等体积0.2mol/L三乙醇胺、10g/L(1％)十二烷基硫酸钠、0.002mol/L乙二胺四乙酸二钠(PH＝9)，搅拌均匀后，加等体积90％苯酚、等体积氯仿，于室温下震荡30min，离心3500r/min，20min，得提取物上清液，再加入等量氯仿振摇，反复2-3次，至中间层界面无明显蛋白层为止，离心除去蛋白，收集上清液。将上清液加入1/10体积200g/L乙酸钾和2倍体积-20℃的无水乙醇于0℃放置1小时，离心，得白色沉淀。将沉淀溶解于含有0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.01mol/L乙酸钠溶液中，加等体积2.5mol/L磷酸氢二钾，于不断搅拌下再加等体积的乙二醇甲醚，0℃放置30min，离心，得上清液。将上清液在0℃不断搅拌下，加入等体积0.2mol/L乙酸钠液和1/4体积10g/L溴化十六烷基三甲基铵，0℃放置30min，离心取沉淀，用0.1mol/L乙酸钠液、70％乙醇反复洗涤5次，至无泡沫为止。沉淀溶解于0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠，除菌过滤，测定含量，无菌灌装，冷冻干燥，经电泳鉴定可以观察到两条典型的18S和28S条带，如附图所示。即得免疫核糖核酸制品。将该制剂免疫动物后，观察其防治肿瘤等疾病的效果。
实施例21)、动物免疫将200mg旋毛形线虫免疫一岁龄马，检查无传染病后加福氏佐剂(羊毛脂一份，液体石蜡一份混合高压灭菌，4℃保存备用)制成乳化的油包水状，于淋巴结内每只注射1ml，12-14天处死，取肝、脾、心、肺和肾等，进行免疫核糖核酸提取。
2)、脾免疫核糖核酸制备。
将免疫动物马的脾脏去除脂肪组织，称重，剪碎，加入用等量含5g/L十二烷基硫酸钠、0.14mol/L氯化钠，0.2％吐温-80和1g/L皂土的0.01mol/L乙酸缓冲液(PH5)，置组织捣碎机中制成匀浆，以3000r/min离心分离，上清液加等体积含5g/L十二烷基硫酸钠，0.14mol/L氯化钠和0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠的0.01mol/L的乙酸缓冲液(PH0.5)，搅拌15min，加等体积的80％苯酚搅拌10min，以3000r/min离心20min，吸取上层水相，加1/2体积用上述乙酸缓冲液配成的90％苯酚，搅拌5min，离心3000r/min、20min。吸取上层水相，加入氯化钠至0.1mol/L，在搅拌下加入2.5倍体积预冷至-20℃的95％乙醇，于-10℃以下冷库沉淀，离心2000r/min、10min。收集沉淀物溶于适量的0.14mol/L氯化钠溶液中，加入等体积氯仿，振摇10min，离心3000r/min、15min。吸取水相，搅拌下加入2.5倍体积，冷至-20℃的95％乙醇洗涤，离心2000r/min、共10min，6号垂熔漏斗过滤，无菌分装冷冻干燥，经电泳鉴定可以观察到两条典型的18S和28S条带，如附图所示。即获得脾免疫核糖核酸制剂。将该制剂免疫动物后，观察其防治肿瘤等疾病的效果。
实施例3取脾免疫核糖核酸2mg加入1ml注射用水溶解后制成注射液。其他选项符合《中华人民共和国药典2000版》注射液项下要求。
权利要求
1.一种毛形属线虫免疫核糖核酸制备方法，包括以下步骤1)毛形属线虫免疫核糖核酸制备(1)、动物免疫将旋毛形线虫免疫一岁龄羊或马、猪、牛等动物，检查无传染病后加福氏佐剂制成乳化的油包水状，于淋巴结内每只注射1ml，12-14天处死，取肝、脾、心、肺和肾等，进行免疫核糖核酸提取；(2)免疫核糖核酸提取①采用肝脏免疫核糖核酸制备方法将羊或马、猪、牛等动物肝用生理盐水洗净，切成小块，加入1-2倍体积0.1mol/L氯化钠，0.05mol/L枸橼酸三钠Triton-100，用组织捣碎机制成匀浆，离心3500r/min 20min，得离心上清液；取上清液加入等体积0.2mol/L三乙醇胺、10g/L十二烷基硫酸钠、0.002mol/L乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀后，加等体积90％苯酚、等体积氯仿，于室温下震荡30min，离心3500r/min，20min，得提取物上清液，再加入等量氯仿振摇，反复2-3次，至中间层界面无明显蛋白层为止，离心除去蛋白，收集上清液；将上清液加入1/10体积200g/L乙酸钾和2倍体积-20℃的无水乙醇于0℃放置1小时，离心，得白色沉淀；将沉淀溶解于含有0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.01mol/L乙酸钠溶液中，加等体积2.5mol/L磷酸氢二钾，于不断搅拌下再加等体积的乙二醇甲醚，0℃放置30min，离心，得上清液；将上清液在0℃不断搅拌下，加入等体积0.2mol/L乙酸钠液和1/4体积10g/L溴化十六烷基三甲基铵，0℃放置30min，离心取沉淀，用0.1mol/L乙酸钠液、70％乙醇反复洗涤5次，至无泡沫为止；沉淀溶解于0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠，除菌过滤，测定含量，无菌灌装，冷冻干燥，即得免疫核糖核酸制品；②采用脾制备免疫核糖核酸将免疫动物马或羊、猪、牛等动物的脾脏去除脂肪组织，称重，剪碎，加入用等量含5g/L十二烷基硫酸钠、0.14mol/L氯化钠，0.2％吐温-80和1g/L皂土的0.01mol/L乙酸缓冲液，置组织捣碎机中制成匀浆，以3000r/min离心分离，上清液加等体积含5g/L十二烷基硫酸钠，0.14mol/L氯化钠和0.001mol/L乙二胺四乙酸二钠的0.01mol/L的乙酸缓冲液，搅拌15min，加等体积的80％苯酚搅拌10min，以3000r/min离心20min，吸取上层水相，加1/2体积用上述乙酸缓冲液配成的90％苯酚，搅拌5min，离心3000r/min、20min；吸取上层水相，加入氯化钠至0.1mol/L，在搅拌下加入2.5倍体积预冷至-20℃的95％乙醇，于-10℃以下冷库沉淀，离心2000r/min、10min；收集沉淀物溶于适量的0.14mol/L氯化钠溶液中，加入等体积氯仿，振摇10min，离心3000r/min、15min；吸取水相，搅拌下加入2.5倍体积，冷至-20℃的95％乙醇洗涤，离心2000r/min、共10min，6号垂熔漏斗过滤，无菌分装冷冻干燥，即获得脾免疫核糖核酸制剂。
2.毛形属线虫免疫核糖核酸在用于治疗人和动物免疫功能低下引起的疾病的医药用途。
全文摘要
本发明公开一种毛形属线虫免疫核糖核酸制备方法，将旋毛形线虫免疫一岁龄羊或马、猪、牛等动物，检查无传染病后加福氏佐剂制成乳化的油包水状，于淋巴结内每只注射1ml，12－14天处死，取肝、脾、心、肺和肾等，进行免疫核糖核酸提取。本发明还公开了毛形属线虫免疫核糖核酸在防治人和动物免疫功能低下引进疾病的医用用途，同时提供了相应的药物制剂。主要用于肿瘤病、早期癌症、性功能低下和病毒病等免疫功能低下或缺陷引起的疾病的预防和治疗，兼有保健功能。毛形属线虫免疫核糖核酸医疗效果好，制剂安全、作用范围广，适用于工业化制备，生产成本低。
文档编号A61P37/04GK1923208SQ20051001708
公开日2007年3月7日 申请日期2005年8月29日 优先权日2005年8月29日
发明者张西臣, 李建华 申请人:张西臣