CRY2过表达植株在连续照下衰老相关的表型，其中（A-C):野生型 和GmCRY2-0X转基因植株中不同生长时期的单叶或子叶根据衰老状况可划分为三类（如图 12所示），每类所占的比例即该类的数目与植株总数的比值（η > 10)。（D-F，H):不同衰老 阶段植株单叶或子叶的表型。（G):野生型和两个GmCRY2-0X转基因植株中GFP-GmCRY2表 达水平的免疫印迹分析。总蛋白提取物用于10% SDS-PAGE分析，GmCRY2抗体用于免疫杂 交。NS, GmCRY2抗体非特异条带用于标示上样量对照；GmCRY2-0X，GFP-GmCRY2过表达在野 生型KN18中。
[0102] 图14显示了 GmCRY2-RNAi在连续照下衰老相关的表型，其中（A-C):野生型和 GmCRY2-RNAi转基因植株中不同生长时期的单叶或子叶根据衰老状况可划分为三类（如图 12所示），每类所占的比例即该类的数目与植株总数的比值（η > 10)。（D-H):不同衰老阶 段植株单叶或子叶的表型。（I):野生型和两个GmCRY2-RNAi转基因植株中GmCRY2表达水 平的免疫印迹分析。总蛋白提取物用于10% SDS-PAGE分析，GmCRY2抗体用于免疫杂交。 NS, GmCRY2抗体非特异条带用于标示上样量对照；GmCRY2-RNAi，GmCRy2RNA干扰植株。
[0103] 图15显示了 GmCIBl过表达植株在连续照下衰老相关的表型，其中（A-C):野生型 和GmCIBl-OX转基因植株中不同生长时期的单叶或子叶根据衰老状况可划分为三类（如图 12所示），每类所占的比例即该类的数目与植株总数的比值（η > 10)。（D-H):不同衰老阶 段植株单叶或子叶的表型。（I):野生型和两个GmCIBl-OX转基因植株中YFP-GmCIBl表达水 平的免疫印迹分析。总蛋白提取物用于10% SDS-PAGE分析，GFP抗体用于免疫杂交。NS， GFP抗体非特异条带用于标示上样量对照；GmCIBl-OX，GFP-GmCIBl过表达在野生型ΚΝ18 中。
[0104] 图16显示了野生型和转基因植株中叶绿素含量、光合速率以及衰老相关基因的 表达情况，其中（A):野生型和各转基因株系中四周大的单叶中总叶绿素含量（白色柱） 和叶绿素 a : b比率的测定（黑色柱）。FW:鲜重。标准误差如图所示（η = 10)。（B):叶片 生长进程中光合成变化趋势。选择种植于连续光照下的第二复叶作为测定对象，用LI-6400 仪器对播种后31天到43天的植株进行测定，每两天测定一次。PSR :光合速率。（C):野生 型和各转基因株系中四个衰老相关基因（GmAPGL5，Gm WRKY53，GmSA GL12和GmA GL12)的 RNA表达情况，所选材料为连续光照下即将变黄的单叶。标准误差如图所示（η = 10)。（D): 野生型和各转基因株系中叶绿素降解相关基因的GmPaO蓝光处理下的RNA表达情况。材料 处理为：黑暗下生长12天的幼苗，转入蓝光下（?22 μ mol m-2s-l)处理6小时，分别在黑 暗下，蓝光光照1小时、3小时和6小时取材（BI，B3和B6)。标准误差如图所示（η = 3)。
[0105] 图 17 显示了 GmCRYl-OX，GmCRY2-0X，GmCRY2-RNAi 和 GmCIBl-OX 转基因植株中的 开花表型，其中（A):开花时间测定；(B):开花时的叶片数。植株种植在连续光照下（LL)，当 野生型第七复叶出现时，将所有的植株包括个各转基因植株转入到短日照（SD)条件下（8 小时光照/16小时黑暗）。标准误差如图所示（η > 15)。
[0106] 图18显示了 GmFTs和GmTFLs在不同基因型中mRNA表达水平，其中（A) :WT和 GmCRYl-OX转基因植株中GmFTs和GmTFLs mRNA表达水平；(B) :WT和GmCRY2-0X转基因植株 中 GmFTs 和 GmTFLsmRNA 表达水平；（C) :WT 和 GmCRY2-RNAi 转基因植株中 GmFTs 和 GmTFLs mRNA表达水平；(D) :WT和GmCIBll-OX转基因植株中GmFTs和GmTFLs mRNA表达水平；测 定的材料为图17中描述的植株从连续光照转到短日照生长3天后，取第1七复叶。标准误 差如图所示（η = 3)。
[0107] 图19显示了酵母双杂交试验GmCRYl，GmCRY2及AtCRYl与GmCIBs间的相互作用， 其中㈧：组氨酸营养缺陷分析显示GmCRYl和GmCIBs间没有互相作用。（B):组氨酸营养 缺陷分析显示GmCRY2和GmCIBl间有蓝光依赖的互相作用。（C):组氨酸营养缺陷分析显示 AtGmCRYl和GmCIBl、GmCIB4、GmCIB8间分别有蓝光依赖的互相作用。含有编码所示蛋白的 酵母细胞在黑暗或蓝光下（?22 μ mol m-2s-l)生长三天分别用于（A-C)中组氨酸营养缺 陷分析。（+):酵母细胞生长在缺少色氨酸和亮氨酸，但含有组氨酸的培养基中。（-):酵母 细胞生长在缺少色氨酸、亮氨酸，和组氨酸的培养基中。（D) : β -半乳糖苷酶活性检测来分 析蓝光（?3〇11111〇1111-28-1)或黑暗下6111〇^2和6111(：18 8间的相互作用。过夜培养表达所 示蛋白的酵母细胞并按1/5χ稀释，稀释液黑暗培养至0D600 = 0. 3-0. 4后转移至蓝光下培 养。标准误差如图所示（η = 3)。
[0108] 图20显示了 GmCRY2与GmCIBl蓝光依赖的相互作用，其中（A) : β -半乳糖苷酶 活性显示红光（R30,?30 μ mol m-2s-l)、蓝光（Β30,?30 μ molm-2s-l)或黑暗处理2小 时GmCRY2和GmCIBl间的相互作用。（B):表达所示蛋白的酵母细胞红光（R30,?30 μ mol m-2s-l)、蓝光（B30,?30μπι〇1πι-28-1)或黑暗不同处理时间时的β-半乳糖苷酶活性。 (〇:不同蓝光强度（30?7(^111〇1111-28-1)和光照时间处理下，6111〇^2和6111(：181相互作用 时的β_半乳糖苷酶活性。（A-C)酵母细胞所表达的蛋白如图所示。标准误差如图所示（η =3)。（D) :BiFC试验表明GmCRY2和GmCIBl体内的相互作用。长日照下生长四周的拟南 芥幼苗的叶肉细胞的原生质体被分离用于共转化表达图中所示蛋白的质粒。共转化后黑暗 培养12-14小时后蓝光（?22 μ mol m-2s_l)处理30分钟或仍放置于黑暗中用作对照。a 列：YFP荧光；b列：自发荧光；c列：明场；d列：a、b、c叠加；标尺为20 μ m. (E):在蓝光（? 22 μ mol m-2s-l)和黑暗处理下，显微镜视野中共转化表达nYFP-GmCIBl和cCFP-GmCRY2 质粒的一百个细胞中含有YFP荧光的细胞的比值。（F) :C〇IP试验表明在烟草体内能够形 成蓝光依赖的GmCRY2-GmCIBl的复合体。利用含有编码所示蛋白质粒的农杆菌注射烟草叶 片。WT和已注射植物黑暗中放置三天后，转移到蓝光（?22 μ mol m-2s-l)下或留在黑暗 中。MYC抗体用于总蛋白和MYC-凝胶产物的免疫杂交，将该蛋白膜剥去抗体后用Flag抗体 再免疫杂交。
[0109] 图21显示了 GmCRY2N端结构域与GmCIBl蓝光依赖的相互作用，其中（A) :GmCYR2 和GmCIBl蛋白结构示意图。GmCYR2和GmCIBl相互作用的结构域被标示出来（粉色阴影）。 (B):营养缺陷试验表明了 GmCRY2N和GmCIBl间蓝光依赖的相互作用。结构域的命名采用 (A)图所示。表达所示蛋白的酵母细胞在图19A中所述培养基上生长，分别置于黑暗或蓝 光（?25μπιο1 m-2s-l)下。（C) :GmCRY2N 或 GmCRY2C结构域与 GmCIBl 作用时的 β-半 乳糖苷酶活性。表达所示蛋白的酵母细胞置于黑暗或蓝光（25μπι〇1 m-2s-l)下（左），或 者进行不同蓝光强度（B30到B70, 30?70 μ mol m-2s-l)和光照时间的处理（右）。
[0110] 图22显示了 GmCRYlPHR结构域与GmCIBl蓝光依赖的相互作用，其中（A) :GmCYRl 和GmCIBl蛋白结构示意图。GmCYRl的PHR结构域（GmCRYlN485)和GmCIBl相互作用的结 构域用粉色阴影标示出来。（B):营养缺陷试验显示GmCRYl各个结构域和GmCIBl间相互 作用情况。结构域的命名采用（A)图所示。表达所示蛋白的酵母细胞在图3. 8A中所述培 养基上生长，分别置于黑暗或蓝光（?25以111〇1111-28-1)下。（〇:6111〇^謂或6111〇^1(：结 构域与GmCIBl作用时的β-半乳糖苷酶活性。表达所示蛋白的酵母细胞置于黑暗或蓝光 (25ymol m-2s-l)下（左），或者进行不同蓝光强度（Β30到Β70,30?70μπιο1 m-2s-l) 和光照时间的处理（右）。（D) :BiFC试验显示GmCRYl或GmCRY2的不同结构域与GmCIBl 在原生质体中的相互作用情况。表达所示蛋白的质粒通过图3. 9(D)所述方法共转化原生 质体。蓝光（22 μ mol m-2s_l)处理30分钟后在突光显微镜下观察。标尺为10 μ m。
[0111] 图23显示了 GmCIBlN端结构域与GmCRY2蓝光依赖的相互作用，其中（A):营养缺 陷试验显示 GmCIBlN (GmCIBlN217)或 GmCIBlC (GmCIBlC218-420)与 GmCRYl 或 GmCRY2 间相 互作用情况。表达所示蛋白的酵母细胞在图19A中所述培养基上生长，分别置于黑暗或蓝 光（?25以111〇1111-28-1)。出） ：8丨？(：试验显示6111(：18謂与6111〇^2相互作用情况。（(：-0): GmCIBl不同结构域与GmCRYl或GmCRY2作用时的β -半乳糖苷酶活性。表达所示蛋白的 酵母细胞置于黑暗或蓝光（25μπι〇1 m-2s-l)下（C)，或者进行不同蓝光强度（Β30到Β70， 30?70 μ mol m-2s-l)和光照时间的处理（D)。
[0112] 图24显示了 GmCIBl与GmCRYl/GmCRY2在大豆体内的相互作用，其中（A，B) :C〇-IP 试验显示大豆体内蓝光特异的GmCRY2-GmCIBl或GmCRYl-GmCIBl复合体的形成WT (KN18) 和35S : =YFPGmCIBl转基因植株分别种植于短日照条件下生长三周。幼苗转入黑暗下处理 18小时后进行蓝光（B，22ymol m-2s-l)处理，处理时间为（D，0分钟；B30,30分钟；B60,60 分钟B120,120分钟）。YFP抗体用于总蛋白（Input)和GFP-凝胶产物（FP-IP)的免疫杂 交，将该蛋白膜剥去抗体后用GmCRY2 (A)或GmCRYl (B)抗体再免疫杂交。
[0113] 图25显示了 GmCIBl与GmCRYl/GmCRY2体外蓝光依赖的相互作用，其中（A):体 外pull-down实验表明GmCRY2和GmCIBl蓝光特异的相互作用。含有Flag抗体的凝胶与 分别表达GmCIBl-flag和GmCRY2蛋白的昆虫细胞裂解物的混合在一起。混合物在蓝光 (B，22ym 〇l m-2s-l)和黑暗下处理，处理时间如图所示。结合的蛋白漂洗后洗脱下来用 Flag(GmCIBl-Flag)抗体进行免疫杂交，剥去该抗体后用GmCRY2再免疫杂交。（B):体外 pull-down实验表明GmCRYl和GmCIBl蓝光特异的相互作用。试验方法如图（A)所述，结合 的蛋白漂洗后洗脱下来用Flag(GmCIB3-Flag)抗体进行免疫杂交，剥去该抗体后用GmCRYl 再免疫杂交。
[0114] 图26显示了 GmCIBl-DNA体外的相互作用。RBSS试验结果显示GmCIBl蛋白结合 的DNA序列以及列在底部的保守序列。底部序列为GmCIBl蛋白结合的DNA序列，底部为比 对后的CANNTG。
[0115] 图 27a-e 显示了 GmCIBl 与 GmFT3、GmFT4、GmTFLl、GmTFL3 和 GmWRKY53 染色体 的相互作用，其中上图显示了所选基因（图27a-GmFT3、图27b-GmFT4、图27c-GmTFLl、图 27d-GmTFL3、图27e-Gm WRKY53)的启动区（箭头），5' UTR(黑线），外显子（灰色方框）， 内含子（黑色方框），3' UTR(黑线）。黑色圆圈表示E-box(CANNTG)所在的位置。黑线所 示的DNA区域是所设引物能够扩增到或扩增不到的区域。下图显示ChIP-qPCR结果。选 择野生型（WT)或YFP-GmCIBl过表达植株（GmCIBl-OX)的幼苗作为分离染色体片段（? 500bp)的材料，植株生长21天后黑暗下放置18小时，转入蓝光（Blue, 22 μ mol m-2s_l)下 处理（左）或继续放置在黑暗（Dark)(右）下，用GFP抗体进行免疫沉淀，得到的DNA沉淀 用于qPCR的引物。％ Input :1%起始染色体片段的量用于Input。标准误差如图所示（η =3)。
[0116] 图28显示了酵母细胞中响应于蓝光的GmCRY2a与GmCIBl的相互作用。（A) β-半 乳糖苷酶（β-gal)分析表明在蓝光（30 μ mol HT2iT1)或暗处理的酵母细胞中GmCRY2a与 GmCIBl和GmCIBl同源物的相互作用。（B) β -gal分析表明在红光（R30, 30 μ mol nT2s_1)、 蓝光（B30, 30 μ mol HT2s-1)或暗（D)处理2小时的酵母细胞中GmCRY2a与GmCIBl的相互 作用。示出了表达各种诱饵和猎物的酵母细胞。显示三个独立重复的平均值和标准差（A， B)。（C) β-gal分析表明在所示时间段内响应于不同能流率的蓝光（D，暗；Β30,30μπι〇1 m 2s 1 ;B50, 50 μ mol m 2s 1 ;B70, 70 μ mol m 2s O 的GmCRY2a与 GmCIBl 的相互作用。各处理的 β -gal活性在照射时随时间线性提高，且代表β -gal活性的点与线性回归曲线拟合。（D) 不同能流率的线性回归曲线的斜率如（C)中所示。图中显示了三个独立重复的平均（土SD) (通过SPSS程序进行的Jonckheere-Terpstra趋势分析，P = 0· 003, η = 3)，表明结合动 力学的量度取决于光强度。（E)显示GmCRY2a-GmCIBl相互作用所需的GmCRY2a和GmCIBl 的结构域（土黄色阴影）的示意图。
[0117] 图29显示了体外和植物细胞中响应于蓝光的GmCRY2a与GmCIBl的相互作用。 (A)pull-down分析表明了蓝光依赖性的GmCRY2a-GmCIBl体外相互作用。偶联抗Flag抗 体（α-Flag)的琼脂糖珠与表达 6His-GmCIBl-Flag(GmCIBl)和 6His-GmCRY2a(GmCRY2a) 的昆虫细胞的裂解物混合。混合物进行蓝光（B，22 μ mol HT2iT1)或暗处理所示的时间。结 合的蛋白质在洗涤后洗脱，并通过抗Flag抗体（a-Flag)的免疫印迹进行分析、分条和用 抗-GmCRY2a抗体（a -GmCRY2a)再次检测。（B)BiFC分析表明了用编码nYFP-GmCIBl和 cCFP-GmCRY2a的质粒共转染的拟南芥原生质体中蓝光依赖性的GmCRY2a-GmCIBl相互作 用。长日（LD，16h光/8h暗）条件下生长的4周龄植物的叶肉原生质体用编码所示蛋白质的 质粒共转化，黑暗中温育12小时并随后转移到蓝光（22ym 〇l HT2iT1)中30分钟，之后进行 共焦显微分析。A栏，YFP突光；b栏，自发突光；c栏，明视场；d栏，a、b和c栏的合并.棒， 10 μ m。（C)对显示BiFC荧光信号的原生质体的数目进行计数。各样品包含至少50个原 生质体。显示了平均值和标准差（η = 3)。P = 0. 00026 (Student' st检验）。（D)活体外 Co-IP分析表明了烟草（Nicotiana benthamiana)中GmCRY2a_GmCIBl复合体的蓝光依赖性 的形成。如所示的，嫩叶以携带编码GmCIBl-Flag(GmCIBl)或GmCRY2a-Myc(GmCRY2a)的质 粒的农杆囷渗透，在黑暗中保持3天，并随后暴露于监光（B，22 μ mol Hi2SOl小时或保持 在黑暗（D)中。蛋白质提取物与偶联有抗-Myc抗体的琼脂糖一起在4°C下温育60分钟。 收集珠并洗涤3次，随后洗脱IP产物。总蛋白质提取物（Input)和IP产物的免疫印迹使 用抗HVIyc抗体（a -Myc)和抗-Flag抗体（a -Flag)顺序地进行。（E) Co-IP分析表明大豆 中GmCRY2a-GmCIBl复合体的蓝光依赖性的形成。野生型（WT)大豆KN18和过表达35S :: YFP-GmCIBl转基因的大豆转基因系（系2) (GmCIBl-