发育过程、光周期调控中发挥的作用，为GmCIB基因的功能研究提 供一定的理论参考。
[0137] 基因组结构分析显示，GmCIB家族基因成员都含有不同数目和长度的外显子和内 含子，以及不同长度的UTR。复杂的基因组结构可能也会产生不同的基因转录后修饰，同时 伴随着不同的基因功能。
[0138] 亚细胞定位分析看出，虽然GmCIB为转录因子但亚细胞定位并不仅仅是位于细胞 核内，GmCIB6和GmCIB7蛋白在细胞核和细胞质中均有表达，暗示了它们可能在细胞质内也 能行使功能。
[0139] GmCIBs不同组织器官的时空表达分析显示各成员在不同组织器官的表达各异，表 达模式也比较复杂。整体上看大部分基因在开花时期的器官中表达量较高，推测可能这一 家族基因在大豆开花调控中起到一定的作用。目前研究显示拟南芥CIBl主要功能是调控 植物开花，可为以上推测提供理论依据。GmCIBs中有些基因在单叶期的组织器官中也有较 高的表达，如GmCIBl/2/3/9在刚刚张开的单叶中表达量很高，可能这些基因除有开花调控 的作用，可能还参与到其他调控途径中。
[0140] 大豆CIB基因不同发育时期表达模式综合分析看，除GmCIB2外，其他基因地上部 分的表达量都较低，大部分基因表达量较高时期主要集中在营养生长后期，生殖生长初期 阶段即开花期，这表明这些基因可能参与到大豆的开花调控。但是也有些基因在生殖生长 初期阶段如单叶时期也有很高的表达量，GmCIBl在单叶期和开花初期的表达量都很高，而 在发育中间阶段表达量却很低。可能该基因在营养生长和生殖生长的初级阶段均起到重要 的调控作用，对发育调控起到双重作用。而GmCIB6的整体表达水平都很低，可能该基因对 发育调控中的作用很小，或者是受某种信号诱导表达的基因。
[0141] 光周期和生物钟分析显示,GmCIB家族成员中这两种表达模式较为复杂。总体上看 大部分基因受光周期和生物钟共同调控，只是两种调控机制所占主导地位不同。纵观所有 成员，GmCIB4在长日照条件的表达有明显的生物钟节律，而在短日照下，生物钟节律明显受 到光周期调控拮抗，当转入连续光照是基因整体表达水平调高而在连续黑暗条件下基因一 直维持在很低的表达水平。暗示了该基因在LD和SD条件下的调控机制有差异，这也可能 由于大豆是严格的短日照植物，在两种光照条件迥异的条件下可能有不同的调控机制。虽 然光周期和生物钟共同调控着基因的表达，对各成员的进一步分析发现，大部分基因（除 GmCIBl和GmCIB9外）在SD和LD条件下，都有明显或不很明显生物钟节律，在一天的表达 中都有峰值和谷值出现，转入LL和DD后生物钟节律被消减，而光周期调控占主导地位，LL 条件下基因的整体表达水平提高，基因在DD条件下一直维持这较低的表达水平。GmCIB2例 夕卜，在LL条件下该基因表达明显受到抑制，而在DD条件下表达量相对较高，说明GmCIB2的 表达受光照的抑制。
[0142] 不同纬度来源大豆品种中GmCIBs表达模式显示，基因的表达模式与纬度间未发 现明确的相关性。整体分析表明，不同纬度来源的品种中，无论在SD或LD环境下基因的表 达都有随光照时间的增加逐渐增加的趋势，在增加过程中，有些基因在某些品种基因的表 达在正午时刻（N)达到峰值后而逐渐降低，而有些会持续增加一直到黑暗来临（E)前达到 峰值。很少一部分基因的表达呈现逐渐降低的模式。
[0143] 将克隆到的GmCIBs构建过表达植物表达载体转化拟南芥，对得到的转基因植株 进行表型分析。在长日和短日条件下，过表达GmCIBl/4/5/6/8的转基因拟南芥表现出早开 花表型，与拟南芥CIBl的功能类似。在过表达GmCIBl的转基因植株中对下游靶基因 AtFT 表达水平检测显示，AtFT的表达水平明显高于野生型，说明外源GmCIBl的表达可提高AtFT 的转录水平从而促进植物早开花。虽然GmCIBl在拟南芥中的功能与CIBl相似，但是大豆 是典型的短日照植物，而拟南芥是长日照植物，两者的调控机理有可能不同，所以需进行大 ?遗传转化进一步研究GmCIB基因在大?中的功能。
[0144] 此外，发明人通过酵母双杂交实验初步验证了 GmC皿与GmCRY2在蓝光下特异的 相互作用。本研究将通过酵母双杂、BiFC以及Co-IP等手段研究GmCRYs与GmCIBl蛋白间 的相互作用；进一步获得GmCRY与GmCIBl基因过表达或RNAi敲除的大豆遗传转化株系，结 合转基因后代的表型分析和ChIP实验来寻找GmCIBl的下游作用靶基因，从而分析大豆中 GmCRY传递蓝光信号的GmCIB信号通路，为大豆光周期和叶片衰老调控的深入研究和种质 创新打下基础。
[0145] 利用农杆菌介导的子叶节转化方法获得GmCRYl-OX，GmCRY2-0X，GmCRY2-RNAi和 GmCIBl-OX转基因大豆，分别对转基因植株进行表型分析；利用酵母双杂交、BiFC以及免疫 共沉淀等手段研究了 GmCRYs和GmCIBl将的相互作用；分析了 GmCIBl与DNA体外相互作用 的位点，并通过ChIP试验初步筛选鉴定GmCIBl的下游作用靶基因。主要得到以下结论：
[0146] GmCRYl-OX，GmCRY2-0X，GmCRY2-RNAi 和 GmCIBl-OX 转基因大豆表型分析结果表 明，在连续光照下，过表达GmCRY2导致植株叶片衰老延迟，而在GmCRYl-OX，GmCRY2-RNAi和 GmCIBl-OX转基因大豆出现叶片提前衰老的表型，初步推测GmCRYl和GmCIBl在叶片衰老调 控过程中起到正调控的作用，而GmCRY2可能抑制叶片的衰老。
[0147] 过表达GmCRYl和GmCRY2敲除转基因大豆表现出提前开花，而过表达GmCRY2、 GmCIBl则导致大豆晚开花，暗示了 GmCRYl促进开花，而GmCRY2和GmCIBl负调控大豆开花。 酵母双杂交和BiFC试验表明，GmCRY2和GmCIBl有蓝光特异的相互作用，且这种相互作用随 着光强的增强和光照时间的增加而增强。GmCRYl和GmCRY2的PHR结构域参与和GmCIBl蓝 光依赖的相互作用。体内（GmCIBl-OX转基因大豆）和体外（昆虫蛋白表达系统）Pull-down 试验进一步验证了 GmCRYl/GmCRY2与GmCIBl间蓝光依赖的相互作用。
[0148] GmCIBl与DNA体外的相互作用结果显示GmCIBl与E-box结合，ChIP试验显示， GmCIBl与拟南芥FT的同源基因 GmFT3和GmFT4染色体区的E-box结合，也能与衰老相关基 因 WRYK53的同源基因 GmWRYK53启动子区核基因组内的E-box结合，并且这种结合没有严 格的蓝光特异性，推测GmCIBl在大豆体内可能通过负调控GmFT的表达抑制开花，促进衰老 相关基因如GmWRYK53的转录进而促进叶片衰老。
[0149] 实施例1、大豆CIB家族基因的克隆与表达模式分析
[0150] 2008年在拟南芥中通过酵母双杂交筛选到第一个与隐花色素 CRY2有蓝光特异相 互作用的蛋白，命名为（：181(0^-丨1^6瓜(^丨1^紐1^1)。（：181是紐1^家族中的一个成员。 在酵母细胞中，CIBl与CRY2的相互作用是蓝光波长特异的，且相互作用的强度随着蓝光强 度的增强和光照时间的增加而增强。CIBl的结构功能研究显示，其N端结构域能够执行与 蛋白相互作用的功能；而含有bHLH基序的C端结构域参与到与DNA的相互作用，从而通过 顺式作用元件调控目的靶基因。拟南芥中CIBl通过与FT启动子区的E-box (CANNTG)的结 合来提高FT的转录水平，从而启动植物开花。
[0151] 本研究从大豆（Glycine max)中克隆到9个CIBl同源基因，分析了其基因结构特 点、不同组织器官和发育时期mRNA的时空表达模式、在不同光周期条件下和不同纬度来源 大豆品种中的mRNA表达模式，并将基因过表达在拟南芥中对其功能进行初步研究，以期研 究GmCIB基因在大豆生长发育过程、光周期调控中发挥的作用，为GmCIB基因的功能研究提 供一定的理论参考。
[0152] 1.材料与方法
[0153] I. 1 材料
[0154] 1.1.1植物材料
[0155] (1)大豆材料：
[0156] 大豆垦农18 (KN18)以及10个其它栽培大豆品种，种植于温室，培养条件为：长日 照（16h光照/8h黑暗）或短日照（8h光照/16h黑暗），培养温度为25-28°C。发育时期和 组织器官样品：将大豆垦农18(KN18)种植于短日条件下，培养温度为25-28°C。
[0157] 当单叶张开前取地上部幼苗；单叶张开期取根、下胚轴、上胚轴、子叶、单叶和茎 尖；在开花期（第四复叶期）取根、茎、单叶、第一复叶、第二复叶、第三复叶和花；在花后 7d，14d和21d取不同发育时期的果荚和种子；分别在单叶期、第一复叶期、第二复叶期、第 三复叶期、第四复叶期（开花期）取地上部分。光照开始后30min取样。
[0158] 光周期样品：大豆垦农18(KN18)分别种植于长日和短日条件下，当单叶刚展开时 每间隔2h取样，各取24个时间点（48h)，随后将幼苗分别转移至连续光照（LL)和连续黑 暗（DD)条件下，每间隔2h取样，各取24个时间点（48h)。
[0159] 不同维度来源大豆品种样品：选用11个栽培大豆品种，即黑河27 (HH27)、绥农 14 (SN14)、垦农 18 (KN18)、长农 13 (CN13)、铁丰 31 (TF31)、冀豆 12 (JD12)、中黄 13 (ZH13)、中 豆31 (ZD31)、浙春3 (ZC3)、福豆I (FDl)和桂早2 (GZ2)，在长日和短日条件下种植，单叶完全 张开时取样，分别在光照开始30min(M)、光照时间中间点（N)、光照结束前30min(E)取样。
[0160] 所有样品取样后立即用液氮冷冻后贮于_80°C备用。
[0161] (2)拟南芥材料：
[0162] 拟南芥野生型Col-Ο,生长温度为21?22°C，光照时间为长日（16h光照/8h黑 暗）和短日照（8h光照/16h黑暗）。
[0163] 1.1. 2菌株及质粒
[0164] 根癌农杆菌菌株GV3101 : :pM90RK由本实验室保存，大肠杆菌菌株DH5a购自全 式金公司。Gateway T载体pGWc来自中国农业大学陈其军副教授实验室。植物表达载体 pLeela、pENSG-YFP-GW 本实验室提供。
[0165] I. L 3酶与试剂盒
[0166] PrimerSTAR 扩增酶、SYBR Green I Kit 购自 TaKaRa 公司，Gateway LR Clonase Enzyme Mix均购自Invitrogen公司，胶回收及质粒小提试剂盒购自Axygen公司，质粒小提 中量试剂盒购自天根公司。
[0167] L 2实验方法
[0168] 1. 2. 1生物信息学分析
[0169] (1)候选基因的确定
[0170] 根据拟南芥CIBl基因的Q)S(code sequence)和氨基酸序列，在http://www. phytozome. net网站中进行Local Blast,筛选出大豆中的同源基因。
[0171] (2)引物设计与PCR扩增
[0172] 根据基因的⑶S序列，基因克隆引物利用Primer Premier5. 0进行设计。 Real-time引物采用Beacon Designer7.0软件进行设计。引物合成由上海生工生物公司完 成。
[0173] (3)基因的染色体定位
[0174] 根据大豆基因组网站Phytozome (http://www. phytozome. net)提供的信息确定 基因在染色体上的位置，按照基因和染色体的长度比例用Adode Illustrator CS3进行绘 制。
[0175] (4)基因结构分析
[0176] 将预测所得的大豆基因组DNA序列与相应的cDNA基因序列在GSDS (http://gsds. cbi.pku.edu. cn)网站中进行比对，确定基因 UTR区、内含子和外显子的位置以及长度。采 用Adode Illustrator CS3序列长度比例进行绘制基因结构模式图。
[0177] (5)同源片段的分析
[0178] 采用生物学软件Clustalx2. 1软件，DNAStar软件包，GeneDoc2. 7软件，MEGA4软 件包，以及http://weblogo. berkeley. edu网站对预测基因的同源片段进行分析。
[0179] 表1克隆基因的引物及序列
[0180]
【主权项】
1. 一种分离的基因，其具有如下的核苷酸序列： (1) SEQ ID NO :1或3所示的序列或其互补序列； (2) 在严格杂交条件下与SEQ ID NO :1或3杂交的序列； (3) 与SEQ ID N0:1或3具有至少85%、90%、95%或99%同一性的序列，其调控叶子 衰老和开花；或 (4) 由SEQ ID NO :1或3所示的序列通过其中一个或多个核苷酸的缺失、置换、插入或 添加而衍生所得到的序列。
2. -种分离的DNA分子，其包含权利要求1所述的基因及其变体，该DNA分子具有 GmCIBl基因或GmCRY2基因的生物学功能。
3. -种重组载体，其包含如权利要求1所述的基因或如权利要求2所述的DNA分子。
4. 一种分离的蛋白质，其具有如下的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO :2或4所示的氨基酸序列； (2) 由权利要求1所述的基因编码的序列；或 (3) 包含一个或几个氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加的SEQ ID NO :2或4所 不的氣基酸序列，该蛋白质具有调控植物叶子哀老和开花的功能。
5. -种宿主细胞，其包含如权利要求1所述基因、如权利要求2所述的DNA分子、如权 利要求3所述的重组载体或如权利要求4所述的蛋白质。
6. -种转基因植物，其包含如权利要求1所述基因、如权利要求2所述的DNA分子、如 权利要求3所述的重组载体或如权利要求4所述的蛋白质。
7. 如权利要求5所述的转基因植物，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选 为拟南芥或大豆。
8. 权利要求1所述的基因、如权利要求2所述的DNA分子、如权利要求3所述的重组载 体或如权利要求4所述的蛋白质在调控植物叶子衰老和开花中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟 南芥或大豆。
10. -种培育转基因植物的方法，包括将权利要求1所述的基因引入目的植物以获得 转基因植物，从而调控所述转基因植物的叶子衰老和开花。
11. 如权利要求10所述的方法，进一步包括获得所述转基因植物的种子。
12. 如权利要求10所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟 南芥或大豆。
13. -种调控植物叶子衰老的方法，包括将权利要求1所述的基因或权利要求3所述的 载体引入所述植物中以使其在植物中表达。
14. 如权利要求13所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟 南芥或大豆。
15. -种调控植物开花的方法，包括将权利要求1所述的基因或权利要求3所述的载体 引入所述植物中以使其在植物中表达。
16. 如权利要求15所述的方法，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟 南芥或大豆。
17. -种生产转基因植物的方法，所述转基因植物包含引入的如权利要求1所述的基 因、如权利要求2所述的DNA分子或如权利要求3所述的重组载体，或者其重组表达如权利 要求4所述的蛋白质，包括获得所述转基因植物的种子，并种植所述种子以获得转基因植 物。
【专利摘要】本发明公开了大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因及其调控开花及衰老的用途。具体地，本发明涉及具有SEQ？ID？NO：1或3所示的序列大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因、包含该基因的DNA分子、载体、该基因编码的蛋白质及相关的转化细胞和转基因植物，还涉及所述基因在调控植物叶子衰老和开花中的应用和培育相关转基因植物的方法。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-29, C12N5-10, C12N1-21, C07K14-415, C12N15-84
【公开号】CN104561023
【申请号】CN201310490925
【发明人】李宏宇, 孟颖颖, 刘斌, 赵涛, 刘军, 林辰涛
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月12日