专利名称：：一种恶臭假单胞菌株及其在制备羟基乙酸中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种恶臭假单胞菌株，以及酶法制备羟基乙酸的方法。
背景技术：
：羟基乙酸(乙醇酸)是一种重要的中间体，广泛用于日用品、工业清洗剂、聚合物的单体及医药领域等。传统制备羟基乙酸的方法是通过化学合成，但通常化学合成需要高温、高压，且纯度难以满足需求。目前工艺较为成熟的化学法制备羟基乙酸的方法主要有氯乙酸碱性水解法。但该方法存在的缺陷是反应效率低、产物容易产生聚酯或者交酯等问题。生物法制备羟基乙酸受到普遍关注，主要有腈水解酶水解羟基乙腈法和乙二醇不对称氧化法。这些方法所使用的原料羟基乙腈和乙二醇都较贵，且羟基乙腈和制备过程中使用的氢氰酸都是剧毒品，因此用来生产羟基乙酸具有一定的限制。卤代乙酸脱卤酶是一类可以水解氯乙酸的酶，该酶来源广泛，已经在假单胞菌属、根瘤菌属、伯克霍尔德菌属等发现。卤代乙酸脱卤酶目前主要用于污水或工业废水中的氯乙酸的环境治理，至今没有人用来生产制备羟基乙酸。因此开发从氯乙酸酶法制备羟基乙酸的方法，一方面可以在治理环境中变废为宝，也可以用来直接以氯乙酸为原料制备羟基乙酸。
发明内容本发明所解决的技术问题是提供一种新的恶臭假单胞菌株及其在制备羟基乙酸中的应用。发明人首次分离纯化到一株能快速降解氯乙酸的菌株。经过16SrRNA和生理生化鉴定，该菌株为恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)，命名为恶臭假单胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15)。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2009年9月7日，保藏号为CGMCCNo.3267。本发明解决其技术问题所采取的技术方案是该菌株为恶臭假单胞菌株CA15，菌种保藏号为CGMCCNo.3267。本发明的恶臭假单胞菌株CA15为生物催化剂的应用，以用于制备羟基乙酸。本发明使用恶臭假单胞菌株CA15制备羟基乙酸的方法是主要包括如下步骤(1)添加诱导剂对恶臭假单胞菌CA15进行诱导培养，离心获得细胞或者在获得细胞后进一步经过破胞提取粗酶；(2)以获得的静息细胞或者粗酶液为催化剂，在缓冲溶液中添加氯乙酸盐作为底物进行反应，然后从反应液中收集羟基乙酸。进一步地，本发明在步骤(1)中，所述诱导培养的培养条件如下所述诱导剂为1070mM的氯乙酸钠；培养温度为2050°C。进一步地，本发明所述培养温度为2540°C。进一步地，本发明在进行诱导培养时还添加辅助碳源，所述辅助碳源为0.510g/L的蔗糖或甘油。进一步地，本发明在步骤(2)中，所述缓冲溶液的pH为5ll，反应温度为2050°C。进一步地，本发明所述缓冲溶液的pH为8IO，反应温度为2535°C。本发明的恶臭假单胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15)在发酵培养基中添加诱导剂氯乙酸钠诱导培养，离心获得细胞或者进一步经过破胞提取粗酶。以获得的静息细胞或者破胞粗酶液为催化剂，在缓冲溶液中，通过一次或多次添加氯乙酸钠，然后从反应液中收集羟基乙酸。与现有技术相比，本发明的优点有(1)采用新的酶法，水解氯乙酸获得羟基乙酸，在环境治理中，可以变废为宝。(2)相比于化学碱性水解氯乙酸制备羟基乙酸，本发明工艺简单，反应条件温和，且产物纯度高，可以达99%以上，满足大多数的医药需求。(3)发明所使用的原料氯乙酸相比于羟基乙腈，价格较低，来源广泛，具有较大的经济价值。(4)恶臭假单胞菌CA15具有较强的脱卤能力，制得的粗酶活力高。图1是羟基乙酸和氯乙酸的高效液相分析的标准谱图；实验分析条件如下Agilent1100系统，有机酸分析柱Bio-RadHPX-87H(30cmX7.8mm)，流动相为5mM硫酸水溶液，流速为0.6ml/min，室温下测定紫外(UV)210nm下吸收值；氯乙酸和羟基乙酸在此条件下的保留时间分别为15.392min和12.154min。图2是底物为不同氯乙酸钠浓度时的酶活图。图3是反应产物的高效液相谱图；分析条件同图1的条件，其出峰时间为12.156min，与羟基乙酸的出峰时间相同。生物材料样品的保藏信息保藏的生物材料样品恶臭假单胞菌CA15(pseudomonasputidaCA15);保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC);保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编100101);保藏日期2009年9月7日；保藏登记号CGMCCNo.326具体实施例方式本发明采用的酶活力单位定义为每分钟水解氯乙酸产生lPmol羟基乙酸所需要的酶量。本发明采用的种子培养基组成3.2g的十二水磷酸氢二钠，1.5g的磷酸二氢钾，0.0980.2g的硫酸镁，0.20.5g的酵母抽提物，0.51.0g的硫酸铵，加水至1L，灭菌。本发明采用的发酵培养基组成在种子培养基基础上，添加通过过滤灭菌的诱导剂，或者为提高产酶量，进一步添加辅助碳源。氯乙酸和羟基乙酸的分析方法见附图1。[OO37](—)菌种筛选及鉴定本发明从垃圾场附近土壤、许多含氯化合物的化工厂附近土壤或活性淤泥共8处土壤，在种子培养基中，添加30mM氯乙酸为唯一碳源富集培养，通过稀释培养挑取单菌落至96深孔板中，培养24h后测定氯离子含量，挑取脱氯能力较强的进行复筛，提取粗酶检测活性并验证脱卤产物，最后挑取并通过16SrRNA和生理生化实验鉴定该菌株为恶臭假单胞菌株Pseudomonasputida命名为恶臭假单胞菌CA15。[OO39](二)脱卤酶菌株的培养条件的确定培养温度的确定在含有80ml的种子培养基的250ml的摇瓶中，添加30mM的氯乙酸钠为诱导剂，在温度分别为2(TC、25t:、3(rC、4(rC或5(rC条件下振荡培养24h，测定酶活。结果显示，3(TC时的酶活为177.8U/L，2(TC、25t:、4(rC、5(rC下的活性分别对应为30°C时的酶活的22%、65%、78%、50%，因此较佳的培养温度为2540°C。诱导剂浓度的确定在含有80ml的种子培养基的250ml的摇瓶中，分别添加10mM、20mM、30mM、50mM、70mM的氯乙酸钠为诱导剂，3(TC下培养24h，测定0D550考察细菌的生长过程和测定酶活考察最终的产酶量，发现以10mM及20mM的氯乙酸钠为诱导剂时，细胞较早的进入凋亡期，酶活分别为30mM诱导剂浓度时的产生的酶活(由上可知，其中30mM的氯乙酸钠的酶活为177.8U/L)的34%和47%;当诱导剂浓度为3050mM的氯乙酸钠时，菌体生长相差不大，50mM的氯乙酸钠为诱导剂所产的酶是30mM的诱导剂浓度时产生的酶活的93%;诱导剂浓度为70mM时的所得到菌体的最大0D550值为30mM时的最大0D550的70%。因此较佳的诱导剂浓度为3050mM。辅助碳源的影响在含有80ml的种子培养基的250ml的摇瓶中，添加30mM的氯乙酸钠为诱导剂的基础上，继续添加10g/L蔗糖、10g/L葡萄糖或10g/L甘油为辅助碳源。3(TC下振荡培养24h，结果如表1。如从表1中所示添加蔗糖所产生的酶活是不添加辅助碳源时的酶活的1.5倍。表1:辅助碳源种类对酶活及菌体it的影响辅助碳源OD550酶活U/L葡萄糖2.826.9蔗糖0.991268.9甘油2.40341.1不加辅助碳源0.999177.8辅助碳源浓度的影响在含有80ml的种子培养基的250ml的摇瓶中，添加30mM的氯乙酸钠为诱导剂，继续添加如表2所示的不同浓度的蔗糖或甘油。从表2可得以0.5g/L的甘油、10g/L或5g/L的蔗糖为辅助碳源时，所产的酶活均超过450U/L。而以5g/L的蔗糖为辅助碳源时所产的菌体量和酶活相对最高。表2:辅助碳源浓度对酶活及菌体量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(三)利用静息细胞为催化剂水解氯乙酸在250ml摇瓶内，含有80ml的种子培养基的250ml的摇瓶中，添加30mM的氯乙酸钠为诱导剂基础上，继续添加5g/L蔗糖，3(TC培养24h后，在离心力为4000g的条件下离心收集细胞，用0.lmol的pH7.5的10.0的磷酸缓冲溶液分别清洗及离心两次，获得细胞。取培养后所获的静息细胞，以每克湿细胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氢氧化钠缓冲溶液的量溶解并混匀，在细胞悬液中添加30mM氯乙酸钠为底物，在3(TC振荡反应，反应5h时，底物刚好反应完全，羟基乙酸浓度为12.3mM。取培养后所获的静息细胞，细胞以每克湿细胞添加10ml的O.lmol的pH10.0的甘氨酸/氢氧化钠缓冲溶液的量溶解并混匀，在细胞悬液中添加30mM的氯乙酸钠为底物，在2(TC振荡反应12h时，底物刚好反应完全，此时的羟基乙酸浓度为6.2mM。取培养后所获的静息细胞，细胞以每克湿细胞添加10ml的0.lmol的pH9.0的甘氨酸/氢氧化钠缓冲溶液的量溶解并混匀，在细胞悬液中添加30mM的氯乙酸钠为底物，30。C振荡反应5h时，底物消耗了26.lmM，此时的羟基乙酸浓度为9.3mM。取培养后所获的静息细胞，细胞以每克湿细胞添加10ml的0.lmol的pH8.0的磷酸缓冲溶液的量溶解并混匀，在细胞悬液中添加50mM的底物，3(TC振荡反应，5h时，底物消耗了20mM，此时的羟基乙酸浓度为10.8mM。取培养后所获的静息细胞，细胞以每克湿细胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氢氧化钠缓冲溶液的量溶解并混匀，在细胞悬液中添加110mM的氯乙酸钠为底物，在3(TC振荡反应12h时，底物刚好反应完全，此时的羟基乙酸浓度为40.7mM。取培养后所获的静息细胞，细胞以每克湿细胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸/氢氧化钠缓冲溶液的量溶解并混匀，在细胞悬液中添加110mM的氯乙酸钠为底物，在5(TC振荡反应8h时，底物刚好反应完全，此时的羟基乙酸浓度为30.2mM。取培养后所获的细胞，细胞以每克湿细胞添加10ml的0.lmol的pH10.0的甘氨酸6/氢氧化钠缓冲溶液的量溶解并混匀，在细胞悬液中添加llOmM的氯乙酸钠为底物，在35°C振荡反应9h时，底物刚好反应完全，此时的羟基乙酸浓度为37.7mM。取培养后所获的细胞，细胞以每克湿细胞添加10ml的0.lmol的pH5.0的乙酸/氢氧化钠缓冲溶液的量溶解并混匀，在细胞悬液中添加30mM的氯乙酸钠为底物，在3(TC振荡反应12h时，底物消耗了3.2mM，此时的羟基乙酸浓度为2.lmM。(四)利用粗酶为催化剂水解氯乙酸制备羟基乙酸在250ml摇瓶内，含有80ml的种子培养基的250ml的摇瓶中，添加30mM的氯乙酸钠为诱导剂的基础上，继续添加5g/L蔗糖，3(TC培养24h后，在离心力为4000g的条件下离心收集细胞，再用O.lmol的pH7.5的磷酸缓冲溶液清洗及离心两次，获得细胞。以每克湿细胞添加10ml的0.02M的pH7.5的Tris-硫酸缓冲溶液中，400kHz的超声频率，超声10min，4。C下以12000g的离心力离心20min，取上清液为粗酶。以该粗酶为催化剂，考察底物浓度的影B向，具体过程如下取1ml的粗酶液，分别添加底物浓度为10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或llOmM的氯乙酸钠，继续添加水至2ml的反应体系，3(TC振荡反应0.5h，添加200ul的10X硝酸沉淀所有的蛋白质以终止反应，HPLC检测产物的量，作底物与对应的初始速率的图，如图2。从图2中可得，当底物浓度超过30mM时，初始速率随底物浓度升高反而下降，因此较佳的底物浓度为30mM。缓冲溶液pH值和反应温度的确定配制两组不同pH缓冲溶液的反应体系，每组体系的配制方法如下，取lml的上述提取的粗酶，分别添加500ul的pH5、6、7、8、9、9.5、10或11的缓冲溶液，其中一组添加直接30mM的氯乙酸钠为底物，分别在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、50°C下测定其酶活，另一组预先在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、50°C对应的温度下放置24h后，再分别添加30mM的氯乙酸钠为底物，并加水至2ml，然后在各自对应的温度下测定其残余酶活，数据见表3。从表3可见，虽然在各种pH条件下，温度为50°C时的酶活最高，但是放置24h后残余酶活几乎为零。而温度为25t:35t:虽然活性并不是最高，但是放置24h后残余酶活较高，于是综合考虑活性及稳定性，较佳的pH和温度分别为8.010.0和25°C35°C。表3:缓冲溶液pH值和反应温度对酶活的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(注表3中的"前"指酶不经过预先放置而直接进行反应，"后"指酶先预先放置24h后再测定酶活。)—次性添加底物法制备羟基乙酸取上述所提取的粗酶10ml，添加50mM的氯乙酸钠为底物，添加5ml的0.2mol的pH10.0的甘氨酸/氢氧化钠缓冲溶液，继续加水至总体积为20ml，3(TC振荡反应12h，添加2ml的10%硫酸沉淀蛋白，HPLC检测分析结果如见图3，从图中可见，反应产物中只有羟基乙酸，没有其他杂质。该产物的浓度为49.7mM，产率达99.4%。多次添加底物法制备羟基乙酸先取上述所提取的粗酶50ml，置250mlpH可控的摇瓶(NCBIOsHpH-6，上海国强)中，添加25ml的0.2mol的pH10.0的甘氨酸/氢氧化钠缓冲溶液，在3(TC振荡反应，初始底物为30mM的氯乙酸钠，每个半小时取样，并通过HPLC检领"当底物浓度低于15mM时，添加15mM的底物使其继续反应，经过15h，中间共添加8次，最后得到羟基乙酸浓度为148mM，回收率为98%以上，纯度为99%以上。权利要求一种恶臭假单胞菌株，其特征是该菌株命名为恶臭假单胞菌株CA15，菌种保藏号为CGMCCNo.3267。2.—种权利要求1的恶臭假单胞菌株作为生物催化剂的应用，其特征是该恶臭假单胞菌用于制备羟基乙酸。3.—种使用权利要求l的恶臭假单胞菌株制备羟基乙酸的方法，其特征是包括如下步骤(1)添加诱导剂对恶臭假单胞菌CA15进行诱导培养，离心获得细胞或者在获得细胞后进一步经过破胞提取粗酶；(2)以获得的静息细胞或者粗酶液为催化剂，在缓冲溶液中添加氯乙酸盐作为底物进行反应，然后从反应液中收集羟基乙酸。4.如权利要求3所述的制备羟基乙酸的方法，其特征是在步骤(1)中，所述诱导培养的培养条件如下所述诱导剂为1070mM的氯乙酸钠；培养温度为2050°C。5.如权利要求4所述的制备羟基乙酸的方法，其特征是所述培养温度为2540°C。6.如权利要求3或4所述的制备羟基乙酸的方法，其特征是在进行诱导培养时还添加辅助碳源，所述辅助碳源为0.510g/L的蔗糖或甘油。7.如权利要求3或4所述的制备羟基乙酸的方法，其特征是在步骤(2)中，所述缓冲溶液的pH为5ll，反应温度为2050°C。8.如权利要求7所述的制备羟基乙酸的方法，其特征是所述缓冲溶液的pH为810，反应温度为2535°C。全文摘要本发明公开了一种恶臭假单胞菌株及其在制备羟基乙酸中的应用，该菌株命名为恶臭假单胞菌株CA15，可用于制备羟基乙酸。本发明使用恶臭假单胞菌株CA15制备羟基乙酸的方法主要包括如下步骤添加诱导剂对恶臭假单胞菌CA15进行诱导培养，离心获得细胞或者在获得细胞后进一步经过破胞提取粗酶；以获得的静息细胞或者粗酶液为催化剂，在缓冲溶液中添加氯乙酸盐作为底物进行反应，然后从反应液中收集羟基乙酸。本发明得到的产物羟基乙酸的转化率在99％以上，纯度可达99％以上。本发明方法具有反应条件温和、无污染且工艺简单等显著特点。文档编号C12P7/42GK101705196SQ20091015412公开日2010年5月12日申请日期2009年11月5日优先权日2009年11月5日发明者吴坚平,徐刚,杨立荣,林春娇申请人:浙江大学