专利名称：一种糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及膜表面改性制备亲和膜的方法，尤其涉及一种糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法。
背景技术：
任何物质之间的作用都始于表面，表面性能在应用中的重要性是其它性能所不可替代的。目前，对不同的材料进行表面改性，得到了广泛的关注和长足的发展。其中，对应用领域越来越广的膜分离材料，采用表面改性技术可优化膜分离材料的表面性能而又不会破坏它的本体性能，拓宽了膜分离材料的使用范围，提高了膜分离材料的使用效率，延长了膜分离材料的使用寿命。膜分离材料表面改性的方法主要包括表面等离子体处理(CN1539550，CN1546214)、紫外光辐照接枝改性(CN1618509)、γ-射线辐射改性(CN1569934)、臭氧接枝改性(CN1640533)和表面活性剂涂敷改性(CN1257747)等。经特定的改性过程，膜分离材料可被赋予不同的表面特性，具备诸如亲水性、亲和性、p小时响应性、温度响应性、生物相容性、抗污染性等功能，被广泛应用于污水处理、印染、生物制药、精细化工等领域。
蛋白质、核酸和糖是构成生物体的主要组成部分，在生命活动中发挥着及其重要的生物功能，对众多的生理过程有着深刻的影响，因此，对它们的研究与表征日益重要。在自然界中，糖以糖肽、糖脂、糖胺聚糖、蛋白聚糖或其它糖缀合物等形式存在，研究发现，糖除了储存能量与组建结构，还广泛参与了生命活动中许多生理过程，包括病毒侵入、信号传输、发炎、细胞—细胞相互作用、细菌—宿主相互作用、受精、发育等。事实上，糖涉及从胚胎发育到免疫系统控制的每一件事情，糖结构的微小差异就可能对生物功能产生重大影响。相比于蛋白质和核酸，糖是多羟基醛或多羟基酮的化合物，可以直链或环型存在，通过糖苷键或者分支，或者呈线性相连，其可能的结构更复杂繁多，相应的生物作用在生命科学里发挥着不可替代的作用。由于糖在生物学上的独特地位，自20世纪80年代末，糖生物学成为继基因组学和蛋白组学之后的又一门新兴的前沿学科——糖组学，得到了越来越多的关注和应用。
近年来，将糖基引入材料中，利用糖的生物相容性与识别作用，在食品、医药、临床诊断、化妆品、蛋白质分离等领域取得了一定成效。CN1450907发明了一种通过β聚糖增加细胞中活化素诱导的信号传导的方法，该方法可用于治疗许多病理情况，包括生殖、反应、皮肤、骨骼、肝脏、造血和中枢神经系统疾病。CN1417347将糖等配体以一定距离共价联接于基质表面，用于鉴定病源微生物及其毒性蛋白。CN1460524制备了α～烯丙基葡糖苷表面修饰的人工晶状体，这种白内障囊外摘除术的人工晶状体光学部和袢的外表面均带有α～烯丙基葡糖苷单体的分子层，提高了人工晶状体的生物相容性，且制法科学、医用移植安全可靠。CN1030005将具有酸性官能团的二乙胺乙基葡聚糖包被在二氧化硅颗粒上，通过吸附和洗脱从乳清中选择性地提取金属蛋白质，尤其是固定铁的金属蛋白，例如乳铁传递蛋白、乳过氧化物酶和铁传递蛋白。CN1130375将多糖衍生物(多糖的酯或氨基甲酸酯衍生物)负载于有用有芳烷基的甲硅烷基化剂处理过的表面硅烷醇基团的硅胶颗粒上制成旋光异构体分离剂，作为反相液相色谱的填充材料，把旋光异构体从外消旋化合物中分离出来。CN1763126以罗望子胶或沙蒿胶与壳聚糖为原料，四氧化三铁为磁流体，戊二醛为交联剂，对氨基苯磺酸为胺化剂制备的具有一定磁响应性的磁性微球，是一种溶胀体积小、耐酸性较好、成本低的复合生物多糖磁性微球。WO2004040308提供了用于固化至少一种碳水化合物分子的方法，包括将表面与至少一种单体的等离子体接触来提供等离子聚合体包被的带有氨基的表面，及将所述聚合体表面接触不同的天然多糖溶液诸如透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角质素等，将多糖通过静电作用被动吸附到聚合体表面，固化的多糖在表面有充分的结合强度，并保留了天然的生物活性。这种糖结合表面可用于生物传感器、治疗载体、细胞培养、医疗装置、亲和纯化基质和芯片等方面。
发明内容
本发明经过长期研究试验后认为糖基引入聚丙烯微滤膜的表面，可使糖的生物功能与聚丙烯优良的物理化学性能结为一体。由于聚丙烯微滤膜孔隙率高，比表面积大，大大提高了糖基在膜表面的结合量，糖的集簇效应易于实现，显著增强了糖基对蛋白质的选择性吸附。利用不同糖基对特定蛋白质的选择性识别作用，糖基化聚丙烯亲和膜可以分别将蛋白质吸附分离开来。这种糖基化聚丙烯亲和膜作为高效液相色谱的固定相可实现蛋白质的高效、快速分离，这是由于固定相不存在溶质在颗粒内部孔隙的质量传递，溶质仅在固定相表面有短的扩散路程，因此对具有低扩散性的生物大分子，可实现快速的质量传递，从而缩短滞留时间，并利于保持生物大分子高的生物活性和回收率(LC～GC Int，1996，9(10)650；9(11)741；JC小时ro摩尔/升atogr.A，1995.7053)。同时，这种糖基化聚丙烯亲和膜作为一类亲和表面，还可用于质谱鉴定微生物(Anal.C小时e摩尔/升.2001，73751～757)，由于膜表面具有高的比表面积，这种膜的亲和表面比金的表面具有更高的微生物俘获能力，此外，糖基优良的亲水性和生物相容性使得膜的污染得到控制。聚丙烯微滤膜经糖基化后，可用于不同蛋白质及微生物的分离、浓缩和靶向清除，在色谱分离和质谱鉴定蛋白质或微生物、细胞培养、医疗装置等方面有广阔的应用前景。
本发明的目的是提供一种糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法及其应用领域。
方法步骤如下1)将聚丙烯微滤膜浸入含有复合光引发剂和带羟基的丙烯酸酯类单体的溶液中，通氮气，经紫外光辐照接枝聚合后，洗涤、烘干，得到羟基化聚丙烯微滤膜，接枝率为0～150克/平方米膜；2)将上述膜浸入不同的经乙酰化保护的单糖或多糖溶液中，在氮气保护下加入催化剂，并在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时，洗涤、烘干后得到表面结合糖基的聚丙烯微滤膜；3)将此膜浸入甲醇钠的甲醇溶液中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团，得到脱保护的糖基化聚丙烯亲和膜，固定率为0～45克/平方米膜。
本发明的优点在于1)糖不局限于列出几种，任何乙酰基保护的糖(单糖、二糖、三糖等)均可使用。同时，糖基上的保护基团(乙酰基)可以方便地脱除，且可通过重量法快速计算出聚丙烯微滤膜上结合的糖基含量。
2)通过调节紫外辐照接枝聚合条件，聚丙烯微滤膜上接枝的甲基丙烯酸羟乙酯的接枝率可在很宽的范围内调节(0～150克/平方米膜)；利用不同甲基丙烯酸羟乙酯接枝率的聚丙烯微滤膜，进而可得到不同糖基化程度的聚丙烯亲和膜(0～45克/平方米膜)，可实现膜表面糖基的集簇效应，显著增强了糖基对蛋白质的选择性吸附；同时，这种不同糖基化程度的聚丙烯亲和膜可适用于一系列从低浓度到高浓度的蛋白质溶液(0.1克/升～20克/升)的分离和浓缩，使用范围广。
3)反应在室温下进行，操作简单，经济可行。
4)采用本方法得到的糖基化聚丙烯亲和膜是通过聚甲基丙烯酸羟乙酯将糖基固定在膜表面，在吸附蛋白质时空间位阻小，且糖基与蛋白质易于形成多价结合，使聚丙烯亲和膜吸附蛋白质的能力提高。
5)采用本方法得到的糖基化聚丙烯亲和膜由于是化学法结合糖基，在使用过程中性能稳定，糖基不会脱落，用于蛋白质的选择性分离、浓缩或靶向清除时，可通过吸附、洗脱的循环方式重复使用，且能避免产物的污染，大大降低了生产成本。
6)采用本方法得到的糖基化聚丙烯亲和膜具有良好的机械强度、优良的化学稳定性与热稳定性及其低廉的成本，适用范围广。
图1-图7分别为葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜、半乳糖糖基化聚丙烯亲和膜、甘露糖糖基化聚丙烯亲和膜、岩藻糖糖基化聚丙烯亲和膜、麦芽糖糖基化聚丙烯亲和膜、乳糖糖基化聚丙烯亲和膜及蔗糖糖基化聚丙烯亲和膜的分子结构示意图。
具体实施例方式
本发明中采用的光引发剂为复合光引发剂，即二苯甲酮和三氯化铁的复合物，其目的在于提高甲基丙烯酸羟乙酯在聚丙烯微滤膜上的接枝率；本发明中接枝率采用重量法计算；本发明中糖基化聚丙烯亲和膜对蛋白质的吸附分离采用紫外—可见光分光光度计检测。
以下实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
一、糖基化聚丙烯亲和膜的制备实例实例1称取适量的三氯化铁(FeCl3)溶解到丙酮与水的混合溶剂(体积比为3∶1)中，配成浓度0.0007摩尔/升的光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为20％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.2微米，孔隙率为85％，膜厚160微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照25分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为1.52克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升五乙酰基葡萄糖(五乙酰基葡萄糖为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到五乙酰基葡萄糖改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为0.65克/平方米膜。
实例2称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为20％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为2微米，孔隙率为40％，膜厚500微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照25分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为11.48克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升五乙酰基葡萄糖(五乙酰基葡萄糖为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到五乙酰基葡萄糖改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为3.05克/平方米膜。
实例3称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.033摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为20％的单体溶液；将聚丙烯中空纤维微滤膜(孔径为0.1微米，孔隙率为45％，膜外径为500微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照25分钟，然后取出聚丙烯中空纤维微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为2.38克/平方米膜的羟基化聚丙烯中空纤维微滤膜。取上述羟基化聚丙烯中空纤维微滤膜置入20毫升五乙酰基葡萄糖(五乙酰基葡萄糖为聚丙烯中空纤维微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到五乙酰基葡萄糖改性的聚丙烯中空纤维微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为0.72克/平方米膜。
实例4称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将聚丙烯中空纤维微滤膜(孔径为0.1微米，孔隙率为60％，膜外径为250微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照25分钟，然后取出聚丙烯中空纤维微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为11.13克/平方米膜的羟基化聚丙烯中空纤维微滤膜。取上述羟基化聚丙烯中空纤维微滤膜置入20毫升五乙酰基葡萄糖(五乙酰基葡萄糖为聚丙烯中空纤维微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到五乙酰基葡萄糖改性的聚丙烯中空纤维微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为2.87克/平方米膜。
实例5称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.2微米，孔隙率为75％，膜厚160微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照60分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为31.54克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升五乙酰基葡萄糖(五乙酰基葡萄糖为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到五乙酰基葡萄糖改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为11.50克/平方米膜。
实例6称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.8微米，孔隙率为70％，膜厚240微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照25分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为11.26克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升五乙酰基葡萄糖(五乙酰基葡萄糖为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的5倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到五乙酰基葡萄糖改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为1.48克/平方米膜。
实例7称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.2微米，孔隙率为85％，膜厚160微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照300分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为145.68克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升五乙酰基葡萄糖(五乙酰基葡萄糖为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到五乙酰基葡萄糖改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为42.79克/平方米膜。
实例8称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.2微米，孔隙率为85％，膜厚160微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照60分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为32.35克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升甘露糖五乙酸酯(甘露糖五乙酸酯为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到甘露糖五乙酸酯改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到甘露糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为11.79克/平方米膜。
实例9称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.2微米，孔隙率为85％，膜厚160微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照60分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为30.87克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升半乳糖五乙酸酯(半乳糖五乙酸酯为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到半乳糖五乙酸酯改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到半乳糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为11.26克/平方米膜。
实例10称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.2微米，孔隙率为85％，膜厚160微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照60分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为30.14克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升岩藻糖四乙酸酯(岩藻糖四乙酸酯为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到岩藻糖四乙酸酯改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到岩藻糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为10.23克/平方米膜。
实例11称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.2微米，孔隙率为85％，膜厚160微米)膜放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照60分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为31.88克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升麦芽糖八乙酸酯(麦芽糖八乙酸酯为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到麦芽糖八乙酸酯改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到麦芽糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为13.29克/平方米膜。
实例12
称取适量的二苯甲酮(BP)和三氯化铁(FeCl3)溶解到以等体积混合的丙酮与水的混合溶剂中，配成浓度分别为0.033摩尔/升和0.0007摩尔/升的复合光引发剂溶液，再加入甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，配成体积浓度为5％的单体溶液；将直径为4.2厘米的聚丙烯平板微滤膜(孔径为0.2微米，孔隙率为85％，膜厚160微米)放入10毫升该单体溶液中浸泡1小时，紫外光(UV)辐照60分钟，然后取出聚丙烯微滤膜，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到HEMA接枝率为32.58克/平方米膜的羟基化聚丙烯微滤膜。取上述羟基化聚丙烯微滤膜置入20毫升乳糖八乙酸酯(乳糖八乙酸酯为聚丙烯微滤膜表面接枝的HEMA的20倍当量)的二氯甲烷溶液中，并于氮气氛下加入100倍当量的三氟化硼乙醚络合物，密封，在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时；停止反应，用丙酮洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到乳糖八乙酸酯改性的聚丙烯微滤膜。将该膜浸入甲醇钠的甲醇溶液(浓度为0.5摩尔/升)中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团乙酰基，用水洗涤，放入40℃烘箱，真空干燥24小时，得到乳糖糖基化的聚丙烯亲和膜，糖基化率为13.58克/平方米膜。
二、糖基化聚丙烯亲和膜应用的实例1、葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜对伴刀豆球蛋白(Con A)的吸附分离取上述实例中制备的葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜(糖基化率为2.87克/平方米膜)4张浸入10毫升无水乙醇中预浸润，再以磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.01摩尔/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的浓度为1克/升，PNA的浓度为1克/升，溶液中CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，NaCl的浓度为0.1摩尔/升。在25℃下恒温30分钟后，取出葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜，并以1摩尔/升的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液冲洗，即可将吸附在膜上的伴刀豆球蛋白洗脱，从而实现将伴刀豆球蛋白从蛋白质的混合溶液中分离的目的。
取上述实例中制备的葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜(糖基化率为11.50克/平方米膜)4张浸入10毫升无水乙醇中预浸润，再以磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.01摩尔/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的浓度为5克/升，PNA的浓度为5克/升，溶液中CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，NaCl的浓度为0.1摩尔/升。在25℃下恒温30分钟后，取出葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜，并以1摩尔/升的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液冲洗，即可将吸附在膜上的伴刀豆球蛋白洗脱，从而实现将伴刀豆球蛋白从蛋白质的混合溶液中分离的目的。
取上述实例中制各的葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜(糖基化率为42.79克/平方米膜)4张浸入10毫升无水乙醇中预浸润，再以磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.01摩尔/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的浓度为20克/升，PNA的浓度为20克/升，溶液中CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，NaCl的浓度为0.1摩尔/升。在25℃下恒温30分钟后，取出葡萄糖糖基化聚丙烯亲和膜，并以1摩尔/升的葡萄糖磷酸盐缓冲溶液冲洗，即可将吸附在膜上的伴刀豆球蛋白洗脱，从而实现将伴刀豆球蛋白从蛋白质的混合溶液中分离的目的。
2、甘露糖糖基化聚丙烯亲和膜对伴刀豆球蛋白(Con A)的吸附分离取上述实例中制备的甘露糖糖基化聚丙烯亲和膜4张浸入10毫升无水乙醇中预浸润，再以磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.01摩尔/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的浓度为5克/升，PNA的浓度为5克/升，溶液中CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，NaCl的浓度为0.1摩尔/升。在25℃下恒温30分钟后，取出甘露糖糖基化聚丙烯亲和膜，并以1摩尔/升的甘露糖磷酸盐缓冲溶液冲洗，即可将吸附在膜上的伴刀豆球蛋白洗脱，从而实现将伴刀豆球蛋白从蛋白质的混合溶液中分离的目的。
3、半乳糖糖基化聚丙烯亲和膜对花生凝集素(PNA)的吸附分离取上述实例中制备的半乳糖糖基化聚丙烯亲和膜4张浸入10毫升无水乙醇中预浸润，再以磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.01摩尔/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的浓度为5克/升，PNA的浓度为5克/升，溶液中CaCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，MnCl2的浓度为0.1毫摩尔/升，NaCl的浓度为0.1摩尔/升。在25℃下恒温30分钟后，取出半乳糖糖基化聚丙烯亲和膜，并以1摩尔/升的半乳糖磷酸盐缓冲溶液冲洗，即可将吸附在膜上的花生凝集素洗脱，从而实现将花生凝集素从蛋白质的混合溶液中分离的目的。
上述例1～12糖基化聚丙烯亲和膜的制备条件及结果如表1所示；例4、5、7、8以及9对伴刀豆球蛋白/花生凝集素混合溶液的分离效果如表2所示；不同糖基及与其识别的蛋白质对照表如表3所示。
表1
a参比物为聚丙烯微滤膜上接枝的HEMA的摩尔数。
表2
表3
权利要求
1.一种糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征如下1)在光引发剂作用下将带羟基的丙烯酸酯类单体紫外辐照接枝聚合到聚丙烯微滤膜表面；2)在催化剂作用下将糖单体结合到上述聚丙烯微滤膜表面的羟基上；3)脱去糖基上的保护基团，得到糖基化聚丙烯亲和膜。
2.按权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征在于1)将聚丙烯微滤膜浸入含有复合光引发剂和带羟基的丙烯酸酯类单体的溶液中，其中光引发剂浓度为0～0.033摩尔/升，单体在溶液中的体积百分数为5～30％；通氮气10分钟后，紫外光辐照接枝聚合，紫外光辐照时间为10～300分钟将膜取出并洗涤、烘干，得到羟基化聚丙烯微滤膜，接枝率为0～150克/平方米膜；2)将上述膜浸入糖单体溶液中，在氮气保护下加入催化剂，催化剂浓度为糖的5倍；在冰水浴中振荡反应2小时，然后将反应体系移至室温下继续振荡反应20小时，洗涤、烘干后得到表面固定糖基的聚丙烯微滤膜；3)将此膜浸入脱去糖基保护基团的试剂中，室温下振荡，脱去糖基上的保护基团，得到脱保护的糖基化聚丙烯亲和膜，固定率为0～45克/平方米膜。
3.按权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征在于所说的聚丙烯微滤膜是平均孔径为0.1～2微米、孔隙率为40～85％、膜厚为15～200微米的平板膜或中空纤维膜，其中中空纤维膜的外径为250～500微米。
4.按权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征在于所说的光引发剂为复合光引发剂，即三氯化铁和二苯甲酮的复合物，其比例为0～1。
5.按权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征在于所说的带羟基的丙烯酸酯类单体为甲基丙烯酸羟乙酯。
6.按权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征在于所说的紫外光辐照接枝聚合的溶剂是丙酮和水的混合物，比例为0.25～4。
7.按权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征在于所说的糖为葡萄糖五乙酸酯，甘露糖五乙酸酯，半乳糖五乙酸酯，岩藻糖四乙酸酯，麦芽糖八乙酸酯，乳糖八乙酸酯，蔗糖八乙酸酯中的一种或几种糖的溶剂为二氯甲烷。
8.按权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征在于所说的催化剂为三氟化硼乙醚络合物。
9.按权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法，其特征在于所说的脱去糖基上的保护基团的试剂为甲醇钠的甲醇溶液，其浓度为0.5摩尔/升，脱去的基团为乙酰基。
10.权利要求1所述的糖基化聚丙烯亲和膜的应用，利用糖基化聚丙烯亲和膜具有对蛋白质的选择性识别，用作蛋白质的分离、浓缩或靶向清除。
全文摘要
本发明公开了一种糖基化聚丙烯亲和膜的制备方法及其应用。特征是以聚丙烯微滤膜为载体材料，以丙酮和水的混合物为溶剂，以二苯甲酮和三氯化铁为光引发剂，在紫外光辐照下接枝甲基丙烯酸羟乙酯，得到羟基化的聚丙烯微滤膜；再在催化剂三氟化硼乙醚络合物催化下，将乙酰基保护的糖结合到此膜表面的羟基上；然后把上述乙酰基保护的糖基化聚丙烯微滤膜浸入甲醇钠/甲醇溶液中，脱去乙酰基，得到糖基化的聚丙烯亲和膜。利用它进行选择性分离、纯化蛋白质。本发明将糖基结合在膜表面，可直接用于蛋白质的分离、浓缩或靶向清除，糖基稳定存在于膜表面，易于回收并可重复使用。
文档编号B01D71/82GK1935342SQ20061005352
公开日2007年3月28日 申请日期2006年9月22日 优先权日2006年9月22日
发明者徐志康, 胡梦欣, 黄小军 申请人:浙江大学