一种提高胶原蛋白乳化稳定性的糖基化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质的壳寡糖修饰技术领域，具体涉及一种提高胶原蛋白乳化稳定性的糖基化方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是一种含有三螺旋结构的蛋白，常见类型为I型、π型、m型、V型和?型，其具有良好的生物相容性、生物降解性以及生物活性。食用级胶原蛋白外观通常为白色，味道清淡，口感柔和，易于消化。常用作食品领域的营养成分和功能物质，可以作为保健食品和包装材料，也可以作为食品添加剂应用在肉制品改良、冷冻食品、饮料、糕点以及乳制品等方面。
[0003]蛋白质的乳化特性对食品乳状液的形成和稳定具有重要作用，较大程度上影响食品的品质和货架期。目前，食品领域中蛋白质糖基化最常用的技术手段是美拉德反应，已经得到充分的研究和开发。通过还原糖分子与蛋白质侧链之间的羰-胺缩合反应，美拉德反应将糖基引入蛋白质分子之中。食品蛋白质的美拉德反应糖基化改造，提高蛋白质的表面性质(乳化性质和起泡能力)，增加了其亲水性能(胶凝性质和流变学性质)等，蛋白质的整体功能性质得到改善。
[0004]虽然美拉德反应进行蛋白质的糖基化、揭示糖基化与功能性质之间的关系的研究很多，但是应用美拉德反应于蛋白质的修饰时，反应过程复杂，除了所希望发生的蛋白质_糖缩合反应外，还存在其他的副反应，导致食品安全问题。例如，可能产生致诱变物质(食品安全性问题)，或者产生褐色物质(感官质量问题)。另外，美拉德反应发生的优先位点是蛋白质分子中的赖氨酸残基，会导致赖氨酸的生物利用率下降，影响蛋白质的营养价值。因此，有必要探寻反应条件相对温和、副反应少、安全性高的其他途径。
[0005]壳寡糖是自然界中唯一含有正电荷的碱性氨基寡糖，具有绿色、天然、无副作用的特点。作为新型的生理活性物质，除了具有抗肿瘤抗癌，增强免疫，降血压，降血糖，降低胆固醇，加速体钙、铁的吸收及关节组织的修复等功能外，还具有调节人体PH值，防腐抑菌等作用。鉴于水产胶原蛋白独特的优越性和其他替代材料无可比拟的特点，寻找一种适用于水产胶原蛋白的壳寡糖修饰就显得尤为重要，这对于解决美拉德反应进行蛋白质的糖基化修饰时产生的问题，改善水产胶原蛋白的功能特性，为食品工业开发出具有特殊功能性质的蛋白质配料，提供新的理论依据和技术方法都具有重要的意义。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明提供了一种水产胶原蛋白的糖基化修饰方法，能够显著改善其功能特性，例如乳化稳定性，从而弥补了现有技术的不足。
[0007]为实现上述目的，本发明采用转谷氨酰胺酶(TG酶)实现胶原蛋白的壳寡糖修饰，不仅能改善其功能特性(包括吸水性、凝胶性以及热稳定性等)，使其具有一定生理活性(包括增强免疫，降血压，降血糖，降低胆固醇等)，而且解决了美拉德反应进行蛋白质的糖基化修饰时产生的问题，为食品工业开发出具有特殊功能性质的蛋白质配料，提供新的理论依据和技术方法。
[0008]本发明的技术方案采用了一种提高胶原蛋白乳化稳定性的糖基化方法，采用壳寡糖对水产胶原蛋白进行糖基化修饰，得到改性的糖基化胶原蛋白。
[0009]具体由以下步骤组成:
[0010](I)制备鱼皮明胶:将鱼皮浸泡在碱性溶液中，然后用清水冲洗至中性，再将鱼皮浸泡在酸性溶液中，浸泡结束后用清水洗至PH5.0-5.5，在水中进行提取;再离心取上清液，超滤、冷冻干燥后得到鱼皮明胶；
[0011](2)制备糖基化蛋白:鱼皮明胶溶于柠檬酸钠溶液制备成蛋白质浓度为3%_6%溶液，壳寡糖溶于相同的柠檬酸钠溶液制备成质量分数为3 %~6%溶液，然后将明胶溶液和壳寡糖溶液按1:3体积比例混合，使反应体系中蛋白质酰基供体与酰基受体壳寡糖的摩尔比为1:3;调节混合溶液pH为7.5，加入转谷氨酰胺酶，在37-47°C恒温水浴反应3.5-5.5h后，于80°C灭酶终止反应；
[0012](3)纯化、收集:利用(NH4)2S04溶液沉淀步骤(2)的反应产物，离心后沉淀备用;将离心后沉淀复溶于水，超滤，将滤液冷冻干燥收集，即为改性的糖基化胶原蛋白。
[0013]作为优选，所述步骤(I)中所用鱼皮为鳕鱼皮或大西洋鲑鱼皮。
[0014]作为优选，所述步骤(I)中的碱性溶液为0.05mol/L的NaOH溶液。
[0015]作为优选，所述步骤(I)中的酸性溶液为0.02mol/L的梓檬酸溶液。
[0016]作为优选，所述步骤(I)中将鱼皮浸泡在酸性溶液中，用清水冲洗后，在55_65°C的水中进行提取3-6h，得到平均分子量10kDa的鱼皮明胶;超滤采用截留分子量30kDa超滤，得到分子量大于30kDa的鱼皮明胶。
[0017]作为优选，所述步骤(2)中柠檬酸钠溶液为质量分数0.3%的溶液，pH为7.0。
[0018]作为优选，所述步骤(2)中壳寡糖为的分子量为1000_2000Da，脱乙酰度为90%。
[0019]作为优选，所述步骤(3)中超滤时使用截留分子量为2000Da_4000Da的超滤膜。
[0020]作为优选，所述步骤(3)中(NH4)2SO4溶液的浓度为40%。
[0021]—种用上述糖基化方法得到的改性的糖基化胶原蛋白，其乳化能力基本无变化，乳化稳定性是未乳化胶原蛋白的6.8-15.0倍。
[0022]—种上述改性的糖基化胶原蛋白的用途，可以作为具有特殊功能性质的食品蛋白质配料，增加产品乳化稳定性。
[0023]本发明的优点在于:
[0024]1.本发明制备得到的鱼皮明胶平均分子量为lOOkDa，便于制备高乳化稳定性的产品O
[0025]2.本发明选用柠檬酸钠作为明胶和壳寡糖的溶剂，制备出的糖基化胶原蛋白其乳化稳定性显著提高。
[0026]3.本发明的糖基化方法，用转谷氨酰胺酶(TG酶)实现胶原蛋白的壳寡糖修饰，不仅能改善其功能特性(包括吸水性、凝胶性以及热稳定性等)，使其具有一定生理活性(包括增强免疫，降血压，降血糖，降低胆固醇等)，而且解决了美拉德反应进行蛋白质的糖基化修饰时产生的问题，为未来食品工业开发出具有特殊功能性质的蛋白质配料，提供新的理论依据和技术方法，为食品业的未来发展以及新产品的开发，提供理论和技术支撑。
[0027]4.本发明制备的糖基化胶原蛋白其乳化稳定性显著提高。乳化性是指油和水混合在一起形成乳状液的性能，对食品品质的改善和货架期的延长有重要作用。
[0028]3.本发明将能够服务于国家战略需要，产生蛋白质糖基化新技术和一种绿色加工途径，所生产的糖基化蛋白可以作为具有特殊功能性质的食品蛋白质配料。
【具体实施方式】
[0029]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域其他人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030]实施例1:
[0031]利用转谷氨酰胺酶制备得到糖基化胶原蛋白，获得一种基于壳寡糖的水产胶原蛋白糖基化方法，显著改善其乳化稳定性。
[0032]具体由以下步骤组成:
[0033](I)制备鱼皮明胶:冷冻大西洋鲑鱼皮流水解冻，去肉、去鳞；将鱼皮剪碎，于0.05mol/L NaOH溶液(1:6，v/v)常温浸泡40min，水洗中性;然后用0.02moVL柠檬酸溶液(料液比为1/6)浸泡40min，水洗至pH5.3;在60°C恒温水浴中提取5h(料液比1/2)，过滤去除鱼皮，离心取上清液，用截留分子量30kDa超滤膜超滤，冷冻干燥收集产物即为大西洋鲑鱼皮明胶。
[0034](2)制备糖基化蛋白:上述大西洋鲑鱼皮明胶溶于柠檬酸钠溶液(质量分数为0.3%, pH为7.0)制备成蛋白质浓度为6 %溶液，将壳寡糖(分子量为1000-2000Da，脱乙酰度为90% )溶于相同的柠檬酸钠溶液制备成质量分数为6%溶液，明胶溶液和壳寡糖溶液按1:3体积比例混合，使反应体系中蛋白质酰基供体与酰基受体壳寡糖的摩尔比为1:3;调节混合溶液PH固定为7.5，加入酶活力为2440kU/kg的转谷氨酰胺酶，其添加量为1500kU/kg蛋白质，在45°C恒温水浴反应3.5h后，样品于80°C水浴灭酶5min，冷却。
[0035](3)纯化、收集:用浓度为40 %的(NH4)2S04(w/v)固体颗粒沉淀步骤(3)修饰产物，冰浴中静置25min后，4°C下4000r/min离心lOmin，得到沉淀;将沉淀复溶于水后，用膜截留分子量为3000Da的超滤膜抽滤除去(NH4)2SO4和反应体系中未结合的壳寡糖;冷冻干燥收集糖基化产物，该糖基化产物的壳寡糖导入量为98.16g氨基葡萄糖/kg蛋白质。
[0036]—种用上述糖基化方法得到的改性的糖基化胶原蛋白，其乳化能力基本无变化，乳化稳定性是未乳化胶原蛋白的8.2-14.9倍。
[0037]其中乳化能力评价步骤为:称取一定量的样品，分别配成质量分数为0.1%、
0.5%、1.0%、2.0%、3.0%(即分别为1、5、10、20、3011^/1^)的溶液，调节口!1至7.0，取不同质量分数的溶液，在室温下同玉米油按l:l(v/V)比例混合，于高速分散器中以1400r/min的转速乳化30s，然后5000r/min离心7min，记