禽类的糖基化的制作方法
【专利说明】禽类的糖基化
[0001] 本申请是2009年1月7日提交的同名发明专利申请200980102076. 2的分案申请。 [0002]【相关申请信息】
[0003] 本申请要求2008年1月7日提交的美国临时申请号61/010, 207的权利，并将其 整体纳入作为参考。
[0004] 【背景】
[0005] 某些具有潜在商业用途的蛋白质需要翻译后修饰，这些修饰可由哺乳动物细胞有 效产生。然而，哺乳动物细胞，如工业标准中国仓鼠细胞（CH0)，在GMP条件下难以生长，如 果繁殖至商业目的所需规模需要大量资源。基于动物的反应器系统因为其低成本、低维护 且易于规模化，是具有吸引力的基于CH0和其它哺乳动物细胞的系统的替代品。然而，治疗 性蛋白质的翻译后修饰，尤其是糖基化，与哺乳动物细胞如CH0细胞相比，在某些动物和植 物中执行方式不同。转基因禽类，部分因其高效产卵和产生蛋白质的能力，已成功用作治疗 性蛋白质的生物反应器。在一些例子中，发现与禽类如鸡的输卵管产生的并存储于卵的蛋 白质相连接的糖分子（即寡糖或糖基化结构）具有CH0和人类蛋白质相似的基本结构。然 而，输卵管中产生的某些蛋白质中并不出现某些结构性糖元件，这些结构性糖元件对于蛋 白质在病人中的生物反应性和生物利用度至关紧要。
[0006] 当卵黄在输卵管（哺乳动物输卵管的禽类等价物）中行进时在其周围形成卵清。 输卵管中卵清形成的部分叫做输卵管膨大部（magnum)，由专门负责合成并分泌卵清蛋白质 的称作管状腺细胞（TGC)的细胞聚集而成。
[0007] 蛋白质中的两类主要的糖基化结构，N-和0-连接的寡糖，由不同的酶的集合合 成。对于产蛋母鸡的输卵管膨大部产生并存储于卵清中的0-连接的寡糖（也称作0-聚 糖），寡糖产生所用的酶机器似乎与人〇-聚糖产生所用的类似，因为在人和禽类输卵管中 产生的寡糖结构中出现完全相同的糖和连接。
[0008] 母鸡卵清N-连接寡糖（也称作N-聚糖）具有与人中那些某种程度相似的结构， 但通常缺少末端的半乳糖和唾液酸糖。对于某些治疗性蛋白，末端的半乳糖和唾液酸也许 对于病人中的生物利用度以及因此产生的效果至关紧要。
[0009] 末端的唾液酸残基在母鸡输卵管产生的N-聚糖结构中很少出现或根本不出现， 它掩盖N-聚糖不被各种凝集素（识别糖分子的受体）识别。末端具有Gal的蛋白质可被 肝脏中表达的凝集素结合并从病人的血液循环中清除（Ashwell和Morell.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 41:99-128,1974)。具有含末端GlcNAc的N-聚糖的蛋白质，通常 如母鸡输卵管产生的蛋白质，或者含末端甘露糖的N-聚糖的蛋白质被巨嗜细胞上表达的 凝集素结合，并导致清除（Schlesinger等，Biochem J 192 :597-606，1980)。这些结果可导 致蛋白半衰期缩短，并降低效果。
[0010] 有趣的时，鸡的其它器官中产生的N-聚糖，如血液中的那些，通常以Gal和 / 或唾液酸结尾（Ito 等，Rapid Commun Mass Spectrom 20 :3557_65, 2006 ;Raju 等， Glycobiology 10 :477-86.，2000)。因此显然鸡的基因组中包含合成完全唾液酸化N-聚糖 所需的酶的编码基因。
[0011] 对于来自鸡卵清的N-聚糖，一小部分的侧链被Gal占据，这些Gal中的一小部分 带有唾液酸帽子。对于卵清〇-聚糖，绝大部分的侧链带有唾液酸帽子。在卵清蛋白质中 有相当数量的半乳糖和唾液酸，主要是因为〇-聚糖修饰的卵清蛋白质的丰度（Feeney等， J Biol Chem 235:2633-7,1960 ;Feeney等，J Biol Chem 235:2307-11，1960 ;Robinson和 Monsey. Biochem J 147 :55-62,1975)。N-和0-聚糖合成通路共享相同的Gal和唾液酸库 (Varki，等，《糖生物学纲要》(Essentials of Glycobiology)，纽约普莱恩维尤，冷泉港实验 室出版社（Plainview，NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)。因此在 TGC 中 用于聚糖合成的Gal和唾液酸水平很高，并不是限制因素。
[0012] 卵清N-聚糖的结构以及已知有关哺乳动物中相关酶的信息提供了关于产生卵清 N-聚糖结构的细胞机制的线索。在哺乳动物中，N-聚糖合成开始于内质网中多萜醇寡糖前 体的合成，包括GlcNAc残基和多个甘露糖和葡萄糖残基。该复合物与靶蛋白的天冬酰胺相 连接。多种糖苷酶将前体修剪为3个甘露糖和2个GlcNac残基（称为核心五糖）。然后 糖苷转移酶将GlcNac、Gal和唾液酸残基依次加入。在此阶段N-聚糖结构的多样性变得明 显，可能是由于各种糖基转移酶的胞内水平以及糖基转移酶间对于生长的N-聚糖侧链上 自由接受位点的竞争（Varki，等《糖生物学纲要》（Essentials of Glycobiology)，纽约普 莱恩维尤，冷泉港实验室出版社（Plainview, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1999)〇
[0013] 从GlcNac开始，至少有6种N-乙酰葡糖胺基转移酶（GnTs)负责将GlcNAc加入 到N-聚糖的三甘露糖基。卵清N-聚糖的高水平分支表明所有6种GnTs可在母鸡输卵管 细胞中某种程度表达。
[0014] 半乳糖基转移酶（如，0 1，4半乳糖基转移酶），本文称为GalT，是一个具有至少 7个成员的家族，它们在N-和0-聚糖形成中扮有独特以及重叠的角色。GalTl(l型）被 认为负责将Gal加入到N-聚糖上所有连接的GlcNac残基中（Lee等，J Biol Chem 276: 13924-34, 2001)。该家族的其它成员，尤其是2型和3型，被认为能够催化这种转移，尽管 它们在N-聚糖合成中的实际作用看起来很小。GalTl在所有细胞类型中广泛表达，尽管水 平不同。
[0015] 唾液酸转移酶（SialT)家族催化唾液酸加入到Gal或N-乙酰基半乳糖胺 (GalNac)(在0-连接聚糖的情况下）以及其它受体中。关于N-和0-聚糖，通过a 2, 3或 a 2, 6连接加入唾液酸，取决于所参与的具体SialT。人N-聚糖可具有a 2, 3和a 2, 6连 接之一或二者兼有。CH0-产生的N-聚糖仅具有a 2, 3连接，因为缺少a 2, 6SialT的表达 (Lee等，J Biol Chem 264 :13848-55,1989)。卵清N-聚糖和0-聚糖也似乎仅通过a 2, 3 连接进行连接。
[0016] a 2, 3SialT家族有6个成员。1和2型参与0-聚糖合成，因为它们使用Gal-GalNAc 链作为受体。3、4和6型显然将唾液酸加入到Gal-GlcNac链末端，可能参与N-聚糖和0-聚 糖合成。5型似乎不参与0-聚糖或N-聚糖合成，但是可能参与将唾液酸加入到含神经酰 胺的化合物中（Harduin-Lepers 等，Biochimie 83:727_37,2001)。除了在鸡胚中对于 1 型（SialTl)进行表达分析外，对于禽类a2,3SialT家族所知甚少（Kurosawa等，Biochim Biophys Acta 1244 :216_22,1995)。
[0017]目前估计在卵清聚糖最后（即末端）或次末（即，倒数第二）位置的Gal水平少 于约10%和末端唾液酸的水平少于约2%。所需的是在输卵管组织如输卵管膨大部组织中 产生糖基化蛋白质的鸟类，在该部位大量半乳糖和/或唾液酸加入到N-连接寡糖中。 【
【发明内容】
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[0018] 已发现TGC中不表达参与Gal转移到N-聚糖的关键酶。这一点尤为显著，因为 唾液酸仅通过Gal残基与N-聚糖连接。已发现表达将唾液酸转移至N-聚糖上Gal的酶， 但是其水平似乎避免了有效的唾液酸化。这些发现部分导致了产生治疗性蛋白质（如，人 治疗性蛋白质）的转基因禽类的发明，所述治疗性蛋白具有含更完整的末端唾液酸残基和 Gal (如次末Gal)残基的补充物的寡糖结构（如N-连接的寡糖结构）。本文中通常将这些 鸟类称为"转基因-增强糖基化"鸟类。
[0019] 本发明包括基因组中含有转基因的转基因禽类（如转基因鸡），所述基因组包含 所表达的糖基转移酶编码序列。本发明还包括产生转基因禽类的方法。所述输卵管组织， 例如转基因禽类的输卵管膨大部组织（如管状腺细胞）可产生蛋白质（如，外源性蛋白质， 例如治疗性蛋白质），所述蛋白质含有与至少一种转基因不存在时不会出现的糖相连接的 N-连接寡糖。本发明还包含具有本文所公开的修饰的寡糖形式的蛋白质。
[0020] 在一个实施方式中，所述糖基转移酶是N-乙酰葡糖胺基转移酶，例如，N-乙酰葡 糖胺基转移酶3,并且糖是N-乙酰葡糖胺。
[0021] 在另一实施方式中，所述糖基转移酶是半乳糖基转移酶（如，1型半乳糖基转移 酶），并且糖是半乳糖。在一个实施方式中，在转基因-增强半乳糖基转移酶（如1型半乳 糖基转移酶）鸟类的输卵管中产生的外源性蛋白质（如治疗性蛋白质）可作为加入唾液酸 的底物。例如，使用熟知的体外方法将唾液酸连接于通过输卵管中重组或外源性半乳糖基 转移酶加入的Gal上。
[0022] 在另一实施方式中，所述糖基转移酶是唾液酸转移酶（如3型唾液酸转移酶），并 且糖是唾液酸。
[0023] 在一个实施方式中，本发明转基因禽类的输卵管组织的细胞在卵清存在时分泌蛋 白质。
[0024] 在一个实施方式中，本发明的转基因包括至少一个输卵管特异性启动子和至少一 部分逆转录病毒，如LTR。
[0025] 本发明的一个方面涉及分离或纯化具有改变的寡糖形式的蛋白质。
[0026] 在一个具体的实施方式中，本发明涉及产生蛋白质的方法，其中所述蛋白质对于 禽类是外源性的。该方法包含产生编码糖基转移酶的转基因的转基因禽类，其中所述禽类 的输卵管组织产生第二转基因编码的外源性蛋白质，并且具有N-连接寡糖。N-连接寡糖具 有与其连接的半乳糖和唾液酸中的至少一个，其中所述寡糖在编码糖基转移酶的转基因不 存在时不与半乳糖和/或唾液酸连接。
[0027] 本发明包括含有转基因的转基因禽类，所述转基因具有合成寡糖结构所涉及的酶 的编码序列，所述寡糖结构在鸡输卵管组织如膨大部分（管状腺细胞）中出现的量相对较 低。例如，在输卵管组织中所述酶出现的量少于鸟类其它组织中出现的量。例如，该酶在输 卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约90%，或者例如， 该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约80%，或 者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约 70%，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均 含量的约60%，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组 织中平均含量的约50%，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如 肝和肾组织中平均含量的约30%，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其 它组织如肝和肾组织中平均含量的约20%，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小 于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约10%。
[0028] 本发明还包括含有本发明转基因的载体。根据本发明所使用的载体设计为将本发 明的转基因整合入鸡的基因组中，并在产生卵清蛋白质的输卵管细胞中表达酶。可使用任 何有用载体产生本发明的禽类，如转基因-增强糖基化禽类。一些有用的载体包括病毒载 体，如能变成禽类基因组部分（即整合入基因组）的逆转录病毒载体和腺病毒载体，质粒和 其它核苷酸序列。
[0029] 其它有用载体如非感染性核酸载体也在本文使用范围内。例如，根据本发明定点 DNA整合、整合酶介导的整合和人工染色体也在本文使用范围内。
[0030] 考虑用于本发明的禽类逆转录病毒的例子包括但不限于，禽白血病病毒（ALV)，例 如但不限于狀￥-0、狀￥-1、狀￥-2 ;禽肉瘤病毒仏3￥);禽肉瘤/急性白血病病毒仏31^)，包 括但不限于劳氏肉瘤病毒（RSV);弗吉纳米肉瘤病毒（FSV);禽类成髓细胞血症病毒（AMV); 禽骨髓成红血细胞增多症病毒（AEV);禽类髓细胞瘤病病毒（MCV)，例如但不限于MC29 ;网 状内皮组织增殖病毒（REV)，例如但不限于，脾坏死病毒（SNV)。本发明也考虑使用鼠白 血病病毒（MLV);莫罗尼（Moloney)鼠肉瘤病毒（MMSV);莫罗尼（Moloney)鼠白血病病毒 (MMLV);和慢病毒（如人体免疫缺陷病毒（HIV)、马感染性贫血病毒（EIAV)、猫免疫缺陷病 毒（FIV)、牛免疫缺陷病毒（BIV)和猿免疫缺陷病毒（SIV)和这些逆转录病毒的复制缺陷形 式。通常，本发明所用逆转录病毒载体是复制缺陷型。
[0031] 还可使用其它方法产生转基因-增强糖基化禽类，其中无需使用感染性DNA产生 种系传递，如de Lavoir等，2006年6月8日的Nature第441卷，766-769中所报道的，将 其公开内容整体纳入本文作参考。
[0032] 在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组 中包含GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的编码转基因，并在输卵 管组织，如输卵管膨大部组织（例如管状腺细胞）中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白质，所 述蛋白质含有末端位置被半乳糖完全或基本覆盖的N-聚糖。例如，本发明产生的外源性蛋 白质（如治疗性蛋白质）具有末端位置约30%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外 源性蛋白质具有末端位置约40%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具 有末端位置约50%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约 60%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约70%被半乳糖 占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约80%被半乳糖占据的N-聚糖 结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约90 %被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例 如，外源性蛋白质具有末端位置约95%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋 白质具有末端位置约1〇〇 %被半乳糖占据的N-聚糖结构。
[0033] 在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组 中包含一种或多种GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的编码转基因， 并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织（例如管状腺细胞）中产生重组蛋白质，如治疗性蛋 白质，所述蛋白质含有次末位置被半乳糖完全或基本覆盖的N-聚糖。例如，本发明产生的 外源性蛋白质（如治疗性蛋白质）具有次末位置约30%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者 例如，外源性蛋白质具有次末位置约40%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性 蛋白质具有次末位置约50%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次 末位置约60 %被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约70% 被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约80%被半乳糖占据 的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约90%被半乳糖占据的N-聚糖结 构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约95%被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如， 外源性蛋白质具有次末位置约100%被半乳糖占据的N-聚糖结构。
[0034]在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组 中包含一种或多种GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的编码转基因， 并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织（例如管状腺细胞）中产生重组蛋白质，如治疗性 蛋白质，所述蛋白质含有末端位置被唾液酸完全或基本覆盖的N-聚糖。例如，外源性蛋白 质具有末端位置约30%被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位 置约40 %被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约50 %被 唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约60 %被唾液酸占据的 N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约70 %被唾液酸占据的N-聚糖结构， 或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约80%被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外 源性蛋白质具有末端位置约90%被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具 有末端位置约95%被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约 100 %被唾液酸占据的N-聚糖结构。
[0035]在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组 中包含一种或多种GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和GalT7的编码转基因并在 输卵管组织，如输卵管膨大部组织（例如在管状腺细胞中）中产生重组蛋白质，如治疗性蛋 白质，其中寡糖中三分之一的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中三分 之二的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中三分之三的GlcNac残基附连 有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中四分之一的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例 如，其中寡糖中四分之二的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中四分之 三的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖