新颖的fsh糖基化突变体d3n的制作方法

专利名称：：新颖的fsh糖基化突变体d3n的制作方法
技术领域：
：本发明涉及人类生殖领域。更具体地说，本发明涉及生育治疗。
背景技术：
：促性腺激素卵泡刺激素(FSH)是促性腺激素家族的一员，促性腺激素在人类生育中起着关键作用。促性腺激素，也包括黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)，是异源二聚体，每个分子由一个共有的a-亚基(92个氨基酸)和一个特有的P-亚基(FSH是111个氨基酸)组成。成熟型FSHa-亚基和|3-亚基的氨基酸序列分别如SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示。已经从垂体和绝经后尿液中分离出人FSH(EP322,438)并在哺乳动物细胞中重组生产(US5,639,640、US5,156,957、US4,923,805、US4,840,896、US5,767,251、EP211,894禾BEP521,586)。后者文献中也公开了人FSH卩-亚基基因。US5,405,945公开了一种只含有一个内含子的修饰人a-亚基基因。Liu等人，JBiolChem1993,15;268(2):21613-7,Grossmann等人，MolEndocrinol199610(6):769-79,RothandDias(MolCellEndocrinol19951;109(2):143-9，Valove等人，Endocrinology1994;135(6):2657-61,Yoo等人，JBiolChem199325;268(18):13034-42),US5,508,261和Chappel等人，1998,HumanReproduction,13(3):1835公丌了FSH各种结构-功能关系研究，并且鉴定了参与受体结合和激活以及二聚作用的氨基酸残基。促性腺激素在辅助生殖技术中的应用促性腺激素在生殖周期中起着关键作用，在外源性治疗中使用促性腺激素对于辅助生殖技术(ART)也是必不可少的，这些辅助生殖技术例如体外授精(IVF)、IVF联合胞浆内精子注射(IVF/ICS1)和胚胎移植(ET)以及排卵诱导(01)，OI用于进行自然体内授精或宫腔内人工授精的无排卵患者。US4,589,402和US4,845,077公开了纯化的不含LH的人FSH及其在体外授精中的应用。EP322438公开了一种基本上没有LH活性，具有至少6200U/mgFSH活性的蛋白，其中FSHct-亚基和P-亚基，可能分别是其野生型或截短型。为了获得治疗效果需要长期治疗，通常，为了刺激女性卵泡发生需要连续S-IO天，有时高达21天，而对于低促性腺激素的男性，诱导精子发生需要高达18个月。重组hFSH通常是每天肌肉注射(i.m.)或皮下注射(s.c.)给药，伴生不适并可能产生局部注射部位反应。减少给药频率可促进治疗，使促性腺腺激素给药更方便、更易耐受、更为患者至上。FSH糖基化促性腺激素是糖蛋白，每个亚基含有天冬酰胺连接(N-连接)寡糖侧链，该寡糖侧链对于体内活性和功能非常重要。多肽的糖添加(糖基化)是翻译后事件，能使糖链特异性地添加到天冬酰胺(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸(0-连接)上。和糖蛋白的蛋白部分不变的氨基酸序列相比，糖结构是可变的，这种特性称之为微异质性。例如，同一蛋白的各个N-糖基化位点可以含有不同的糖结构。而且，即便在某一蛋白的同一糖基化位点，也可能有不同的糖结构。这种异质性是糖非模板引导合成的结果。蛋白的N-糖基化特异性地发生在一致型模式天冬酰胺-Xaa-丝氨酸/苏氨酸(Asn-Xaa-Ser/Thr)，较少发生在一致型模式天冬酰胺-Xaa-半胱氨酸(Asn-Xaa-Cys)，其中Xaa可以是任何氨基酸残基。然而，一致型三肽的存在并不足以保证天冬酰胺残基糖基化。例如，天冬酰胺-脯氨酸-丝氨酸/苏氨酸(Asn-Pro-Ser/Thr)序列比其他一致型模式Asn-Xaa-Ser/Thr发生N-糖基化率低50倍。人FSH含有4个N-连接糖基化位点2个在共有的a-亚基的52位和78位，2个在卩-亚基的7位和24位。附加到FSHa-亚基的糖对于二聚体的组装、整合、分泌和信号转导非常关键，而(3-亚基糖对于二聚体聚合、分泌和异源二聚体从循环中清除则非常重要。Galway等人，Endocrinology1990;127(1):93-100证实，N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-ICHO细胞系或唾液酸运输缺陷的CHO细胞系产生的FSH突变体，和野生型细胞分泌的或纯化的垂体FSH具有相同的体外活性，但是却没有体内活性，推测是由于糖基化不良的变异体在血清中清除非常迅速。D'Antonio等人，HumanReprod1999;14(5):160-7描述了血循环中不同的FSH同工型(isoform)。这些同工型具有相同的氨基酸序列，但翻译后修饰程度不同。据发现，和酸性同工型相比，酸性较弱的同工型体内清除更快，可能是由于同工型间的唾液酸含量不同。另外，Bish叩等人Endocrinology1995;136(6):2635-40总结，循环半衰期似乎是体内活性的主要决定因素。这些观察导致一种假设，即可以通过引入额外的糖基化位点来提高多肽的唾液酸含量，以延长FSH的半衰期。FSH变异体通过将人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)融合到天然重组人FSH(rhFSH)上，开发出了具有更长半衰期的FSH激动剂。羧基末端肽(CTP)基团由112-118至l」145位氨基酸组成，具有位于121、127、132和138位的4个O-连接糖基化位点。US5,338,835和US5,585,345公开了一种修饰的FSH(3-亚基，其C-木端谷氨酸(Glu)以hCG的CTP基团延长。据称，得到的修饰类似物有天然FSH的生物活性，但却具有较长的循环半衰期。US5,405,945公开hCG(3-亚基的羧基末端部分或其变异体对于CG、FSH和LH的清除具有重要影响。US5,883,073公开了具有CG、TSH、LH和FSH激动剂或拮抗剂活性的并由两个a-亚基组成的单链蛋白。US5,508,261公开了具有LH和FSH受体结合亲和力的异源二聚体多肽，它含有一个糖蛋白激素oc-亚基和一个非天然产生的(3-亚基多肽，其中，(3-亚基多肽是含有4个合拼亚序列的氨基酸链，该亚序列选自--组特异性序列。Klein等人(2003)公开了一种单链的、半衰期延长的FSH类似物，其中a-和P-亚基通过一个寡肽相连，该寡肽含有两个W-连接糖基化位点。为了改善FSH的体内半衰期，WO01/58493公开了可以在FSH的a-亚基进行的77种突变和可以在FSH的P-亚基进行的51种突变。另外'WO01/58493还公开了可以在FSH的N-末端增加，或者FSH多肽不同位点内插入一个或多个糖基化位点，以改善其半衰期。WO01/58493虽然描述了糖基化位点可以插入FSH多肽，但是对于在哪个(哪些)位点插入糖基化位点，却仍能保持FSH活性没有给出指导。WO01/58493进一步公开了突变型a-和(3-亚基可以单独(l个额外的糖基化位点)或联合使用(2个额外的糖基化位点)。已经被鉴定的128个候选突变体，是使用FSH三维(3D)结构的50个模型鉴定的，该模型仅仅基于hCG的结构和FSH与hCG的序列比对产生，而hCG和FSH的(3-亚基只有32%的一致性。WO01/58493没有公开通过定点突变而引入糖基化位点的任何FSHoc-或p-亚基的生产或测定情况。WO05/020934公开了其中FSH的a-和卩-亚基都有突变的GM1，包括一个pE55N/V57T的双突变，即氨基酸位点55位的谷氨酸(E)残基突变成天冬酰胺(N)并且氨基酸位点57位的缬氨酸(V)残基突变成苏氨酸(T)。pE55N/V57T的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。临床上需要一种产品，能够提供FSH的部分或全部治疗相关的效果，可以比现有的FSH产品更低频次给药，并且优选地，和现有治疗可达到的循环FSH活性相比，可以提供更稳定的活性水平。本发明旨在提供这类产品以及这类产品的制备方法。
发明内容本发明涉及突变的FSH分子，其中FSHa-亚基含有序列SEQIDNO:4，FSH(3-亚基含有序列SEQIDNO:3。该FSH可以在所述的突变体的0、1、2、3、4、5或6位天冬酰胺残基发生N-糖基化。在一个实施方式中，含有SEQIDNO:4的突变体or亚基的N3可以是糖基化的。本发明还涉及一种编码FSHa-亚基突变体的分离的DNA分子'该a-亚基突变体含序列SEQIDNO:4。本发明也涉及一种编码FSHP-亚基的分离的DNA分子，该卩-亚基含序列SEQIDNO:3。本发明还涉及一种载体，该载体含有编码含序列SEQIDNO:4的FSHa-亚基突变体的DNA。该载体可以是表达载体。本发明还涉及一种载体，该载体含有编码含序列SEQIDNO:3的FSH卩-亚基突变体的DNA。该载体可以是表达载体。本发明还涉及一种载体，该载体含有第一DNA和第二DNA，其中第一DNA编码含有序列SEQIDNO:4的FSHa-亚基突变体，第二DNA编码含序列SEQIDNO:3的FSH(3-突变体。该载体可以是表达载体。本发明还涉及一种细胞，该细胞含有编码含序列SEQIDNO:4的FSHa-亚基突变体的DNA的载体。该载体可以是表达载体。该细胞可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。本发明还涉及一种细胞，该细胞含有编码含序列SEQIDNO:3的FSHp-亚基突变体的DNA的载体。该载体可以是表达载体。该细胞可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。本发明还涉及一种细胞，该细胞含有含第一DNA和第二DNA的载体，其中该第一DNA编码含序列SEQIDNO:4的FSHct-亚基突变体，第二DNA编码含序列SEQIDNO:3的FSH(3-亚基突变体。该载体可以是表达载体。该细胞可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。本发明还涉及一种细胞，该细胞含第一和第二载体，其中第一载体含编码含序列SEQIDNO:4的FSHa-亚基突变体的DNA，第二载体含有编码含序列SEQIDNO:3的FSHP-亚基突变体的DNA。该载体可以是表达载体。该细胞可以是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。本发明还涉及一种FSH突变体的生产方法，包括培养能使蛋白糖基化的哺乳动物细胞，其中所述的细胞含有第一表达载体，该载体含有编码含序列SEQIDNO:4的FSHa-亚基突变体的DNA，以及第二表达载体，该载体含有编码含序列SEQIDNO:3的FSH(3-亚基突变体的DNA。在本发明的另一个实施方式中，所述的细胞含有单一的载体，该载体含有编码含序列SEQIDNO:4的FSHa-亚基突变体的DNA，还含有编码含有序列SEQIDNO:3的FSHp-亚基突变体的DNA。本发明还涉及一种组合物，该组合物含有FSH突变体和药学可接受的载体或赋形剂，其中FSHa-亚基含序列SEQIDNO:4，FSH(3-亚基含序列SEQIDNO:3。本发明还涉及一种治疗哺乳动物不育的方法，包括在需要时把有效量的FSH突变体给予哺乳动物，其中FSHa-亚基含序列SEQIDNO:4，FSH(3-亚基含序列SEQIDNO:3。本发明还涉及一种刺激哺乳动物卵泡生成的方法，包括在需要时把有效量的FSH突变体给予哺乳动物，其中FSHa-亚基含序列SEQIDNO:4，并且其中FSH卩-亚基含序列SEQIDNO:3。本发明还涉及一种诱导哺乳动物卵巢超排卵的方法，包括在需要时把有效量的FSH突变体给予哺乳动物，其中FSHa-亚基含序列SEQIDNO:4，并且其中FSHp-亚基含序列SEQIDNO:3。图1cr亚基突变体D3N(SEQIDNO:4)与人FSHa-亚基(SEQIDNO:l)的比对。残基序数指人FSHor亚基(SEQIDNO:1)，其中1指其成熟多肽的第一位氨基酸。图2FSH突变体(该突变体含有cr亚基突变体D3N和含序列SEQIDNO:3的(3亚基GM1)与野生型FSH量效关系曲线的比较。量效关系曲线显示了不同稀释度的FSH突变体和野生型FSH的FSH活性。克隆15C指突变体D3N，克隆14C是非相关FSH突变体。具体实施例方式虽然已有证据表明，提高FSH的糖含量可以导致体内半衰期延长，但是改善FSH半衰期比简单地添加额外的糖基化位点更为复杂。虽然糖基化一致性序列对于添加糖是必要的，但却不足以保证糖基化位点被利用。其他因素，例如生物合成中的局部蛋白折叠和构象决定着寡糖是否能添加到特定一致性序列。另外，为了以额外的糖基化达到体内半衰期提高的目的，一致性序列必须处于这样的位置，即该位点的糖基化不会干扰受体结合或者危及该糖蛋白的折叠、构象或稳定性。在这一点上，具有更长的半衰期的FSH类似物，主要限定于融合蛋白，其多肽融合部分包括额外的糖基化位点。FSH突变体本发明提供了一种FSH突变体，经修飾可以产生额外的糖基化识别位点。和野生型的ot-亚基相比，FSH突变体的a-亚基可以是下列突变中的一种D3N和Q5T。FSH突变体可以含有上述a-亚基突变体和(3-亚基突变体，例如|3GMl含有下述突变E55N/V57T。重组FSH的一个或多个额外的糖基化位点可以是糖基化的。该一个或多个额外的糖基化位点可以在体外糖基化或在体内糖基化。FSH突变体可以用任何适合的现有技术已知的方法制备。这些方法包括构建编码相应的FSH突变体的核苷酸序列以及在适合的转染宿主中表达氨基酸序列。FSH突变体还可以采用化学合成制备，或者通过联合使用化学合成和重组DNA技术来制备。FSH突变体可以含有以两个独立多肽链形式存在的FSHa-和(3-亚基，这两个链在体内二聚化以产生二聚体多肽，或者它可以含有单链构建体，该构建体含有通过肽键或连接肽共价结合的两个亚基。连接肽的氨基酸残基具有可以不会明显干扰FSH突变体活性的性质。FSH突变体和野生型FSH相比，可以具有更长的半衰期。和野生型FSH相比，FSH突变体还可以具有更好的稳定性。FSH突变体可以在N-连接糖基化位点O、1、2、3、4、5或6含有寡糖。本发明也提供了一组FSH突变体，它们可以含有一个或多个同工型FSH突变体，其中每种同工型含有在N-连接糖基化位点O、1、2、3、4、5或6含有寡糖。编码FSH突变体a-或卩-亚基核苷酸序列，例如具有分别如SEQIDNOS:1和2所示的氨基酸序列的hFSH-a或hFSH-P，可以通过分离来构建，或通过合成编码FSH亚基母链的核苷酸序列来构建。然后可以改变核苷酸序列以实现相应氨基酸残基的取代或插入。核酸序列可以通过定点突变修饰。或者，核苷酸序列还可以通过化学合成制备，其中寡核苷酸根据FSH突变体的特异的氨基酸序列设计的。编码多肽的核苷酸序列可以插入到重组载体，并可操作性地连接到调控序列，该调控序列是转染的目标宿主细胞表达多肽所必需的。调控序列可以是任何的对于多肽表达必需的或有益的组分。适合的调控序列的例子如指导哺乳动物细胞转录的调控序列，包括SV40和腺病毒早期和晚期启动子，如腺病毒-2主要晚期启动子，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子和人巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子。本
技术领域：
的技术人员不需要过度试验就可以在这些载体、表达调控序列和宿主细胞中进行选择。重组载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体还可以是当其引入宿主细胞时，整合到宿主细胞基因组并同其所整合的一个或多个染色体共同复制的载体。载体可以是表达载体，其中编码本发明的多肽的核苷酸序列可以可操作性地连接到其它核苷酸转录所需要的片段上。载体可以来源于质粒或病毒DNA。此处提及大量的的适合在宿主细胞表达的载体是市售或见于文献描述的。重组载体还可以进一步包括能使载体在所述的宿主细胞中复制的DNA序列。这样的序列的例子，(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40复制起点。载体还可以含有选择标记，例如其产物和宿主缺陷互补的基因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因，或者表达药物抗性的基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯襟素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤抗性基因。载体还可以包括可扩增基因如DHFR,以便含有多个拷贝的可扩增基因和侧翼序列的细胞，包括FSH突变体DNA的细胞，能在适当的培养基上被筛选出来。本发明还提供了编码FSH突变体a-亚基的DNA。该编码FSH突变体a-亚基和e亚基的核苷酸序列，无论是通过定点突变、合成、PCR或其它方法制备，还可以任选地包括编码信号肽的核苷酸序列。当多肽需要从表达它的细胞中分泌的时候，可以存在该信号肽。这种信号肽，如果存在，可以被选择作为多肽表达的细胞识别。信号肽和多肽可以是同源的(如通常是和hFSH亚基关联的)，也可以是异源的(即來自于hFSH之外的另一种来源)，或者和宿主细胞可以是同源的或异源的，即通常在该宿主细胞表达的信号肽，或通常不在该宿主细胞表达的信号肽。任何适合的宿主都可以用来生产该多肽，包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物，或其它适合的动物细胞或动物细胞系，以及转基因动物或植物。适合的哺乳动物宿主细胞系的例子包括中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系，(如CHO-KL;ATCCCCL-61)'绿猴细胞系(COS)(如COS1(ATCCCRL-1650),COS7(ATCCCRL-1651));小鼠细胞系(如NSIO)，幼仓鼠肾(BI-EK)细胞系(如ATCCCRL-1632或ATCCCCL-IO)，和人细胞系(如BEK293(ATCCCRL-1573))，以及组织培养的植物细胞。其它的适合的细胞系对于本
技术领域：
是已知的，可从公共保藏机构如美国模式菌种收集中心(AmericanTypeCultureCollection,USA)获得。将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染、电穿孔、二乙胺基乙基-右旋糖苷(DEAE-dextran)介导的转染、脂质体介导的转染和病毒载体。可以采用现有技术，在适合多肽生产的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过摇瓶培养、小规模或较大规模发酵(包括连续、批次、流加或固态发酵)培养细胞，可在实验室或工业发酵罐中，在适合的培养基和允许多肽表达和/或分离的条件下进行。培养在含有碳源、氮源以及无机盐的营养培养基中，采用现有技术已知的程序进行。适合的培养基可由商业供应商提供，或者根据公开的组分制备(如美国模式菌种收集中心的目录)。如果多肽是分泌到营养培养基中的，可以直接从培养基中回收。如果多肽是不分泌的，可以从细胞裂解物中回收。一个高效生产本发明的FSH突变体的方法，是通过使用二氢叶酸脱氢酶(DHFR)在DHFR-缺陷型CHO细胞中扩增，通过连续增加甲氨蝶呤的浓度实现，如美国专利No.4,889,803所述。产生的FSH突变体多肽可以用现有技术已知的方法回收。例如，可以用传统的方法从营养培养基中回收，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。FSH突变体多肽可以用多种现有技术已知的方法纯化，包括但不限于层析(如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和分子排阻)、电泳方法(如制备型等点聚焦)、差异溶解度(如硫酸氨沉淀)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或萃取。本发明还提供一种含有FSH突变体的药物组合物。该药物组合物可以用于刺激卵泡生成，例如和排卵诱导或辅助生殖技术(ART)联合使用。因为本发明的FSH突变体可以有效诱导多卵泡发育和成熟，所以它可能特别适合用于期望收集多个卵细胞的ART。FSH突变体可以用于诱发排卵(01)时诱导单卵泡生成，或者宫腔内人工授精(IUI)时的少量卵泡生成(paucifolliculogenesis，达到大约3个卵泡)，用于体内授精。较之传统FSH制剂，FSH突变体减少用量或者低频用药可获单卵泡生成。例如，在诱发排卵(01)中，本发明的FSH制剂可以每3天给予225-400IU，或者更低剂量，这取决于患者的反应。患者反应可以用超声图跟踪。本发明的FSH突变体，可以用于控制性超排卵(COH)方案。COH标准方案包括下调期，在该期，通过给予促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂下调内源性黄体生成素(LH)，随之是刺激期，在该期，通过每天给予卵泡刺激素(FSH)，通常大约150-225IU/天，诱导卵泡发育(卵泡生成)。或者，刺激可以在自发或诱导的月经后，以FSH开始，随后给予GnRH拮抗剂(通常从刺激期第6天前后开始)。当至少3个卵泡〉16毫米(一个为18mm)时，给予单剂量推注hCG(5-10,000IU)，模拟自然LH峰(LHsurge)，诱导排卵。卵细胞收获定时在hCG注射后36-38小时。该FSH突变体还可以用于01和IUI。例如，可以在自发或诱导的月经后开始FSH刺激，每天剂量为75-150IU。当1或3个卵泡直径达到至少16毫米时，给予单剂量推注hCG诱导排卵。授精可以通过常规性交或IUI体内进行。因为FSH突变体可以比野生型FSH制剂有更长的半衰期，上述的方案中可以使用较低IU剂量的FSH制剂，和/或可以通过缩短FSH刺激周期来调整方案，而在卵泡的数量和活性方面，能达到同样的或更好的反应。例如，每R剂量为或大约为50-150、50-100或50-75IU的FSH就可以实现足够的卵泡生成。FSH剂量可以是每日或半円为基础的。给药周期可以少于或者大约为14、12、11或10天。对于OI，FSH突变体制剂可以是25-150或50-125IUFSH/天给药。对于男性不育的治疗，FSH突变体制剂可以按照3X150300IU/周给药，直至精子发生达到足以通过常规性交或ART技术受精的水平。因为FSH突变体比野生型FSH制剂有较长的半衰期，可以作为长效制剂给药，该制剂可以以低于每两天一次的频率给药。传统FSH可以每两天给药，用量为或大约300IU，或者每天给药，用量为或大约150IU，效果类似。FSH突变体可以每3、4、5、6或7天给药，而达到和传统FSH类似的或更好的效果。FSH突变体可以用于生产用来治疗疾病、紊乱或症状的药物。在另一方面，本发明的多肽或药物组合物可用在治疗哺乳动物，特别是人类的方法中，包括在需要时给予哺乳动物该多肽或药物组合物的歩骤。对于本
技术领域：
的技术人员来讲，显然，一种多肽、制剂或组合物的有效量，无论该多肽、制剂或组合物是单独用药还是和其它治疗药物联合使用，取决于疾病、剂量、给药时间表、该组合物的血清半衰期以及患者的一般健康状况如何。通常，该制剂或组合物的有效剂量足以保证治疗效果。FSH突变体可以以组合物给药，该组合物包括一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。"药学可接受的"是指一种载体或赋形剂不会使被给予该药物的患者产生任何不良反应。这种药学可接受的载体和赋形剂在本
技术领域：
是众所周知的，该多肽可以按照众所周知的方法制成药物组合物(参见参考书，如Remington'sPharmaceuticalSciences,18thedition,A.R.Gennaro,Ed.，MackPublishingCompany(1990);PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S.FrokjaerandLHovgaard，Eds"Taylor&Francis(2000);禾口HandbookofPharmaceuticalExcipients，3rdedition,A.Kibbe，Ed.，PharmaceuticalPress(2000))。可用于含有该多肽的组合物的药学可接受的赋形剂包括，例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗调节剂(isotonifiers)、非离子表面活性剂或去污剂("湿润剂")、抗氧化剂、膨胀剂或填充剂、螯合剂和助溶剂。含有FSH突变体的药物组合物可以制成各种剂型，包括液体如即用溶液或悬浮液、凝胶、冻干的，或者任何其它适合的剂型，如适合制成溶液的干粉或晶体。组合物的形式可以取决于需要治疗的特异的适应症，这对于本领域的技术人员是显而易见的。该含有FSH突变体的药物组合物可以经静脉、经肌肉、经腹膜、经皮、经皮下、经舌下、经口腔、经鼻腔、透皮给药，或通过吸入以及任何其它可接受的方式如干粉注射剂(PowderJect)或ProLease封装技术或笔注射系统，给药模式将取决于需要治疗的特异的适应症，这对于本领域的技术人员是显而易见的。该组合物可以经皮下给药，这样病人能够进行自己用药。该药物组合物可以和其它治疗药物联合使用。这些药物可以混合到该药物组合物中作为其一部分，也可以与多肽分开，同时给药，或者根据其它可接受的治疗方案使用。另外，该多肽、制剂或药物组合物可以作其它治疗的辅助使用。本发明包括多个方面，由以下的非限制性的例子具体说明。实施例1FSH突变体人FSH的3D晶体结构曾用来识别FSHa-亚基上候选糖基化位点或FSH分子上可以插入候选糖基化位点的部位。在每个晶体结构的不对称基团中存在两个FSH分子(四个亚基)。对这两个FSH分子进行了叠加和比较，每个残基在视觉上都可观察，以识别潜在位点，该位点可以插入N-糖基化位点而不会干扰FSH多肽的正确折叠或降低FSH活性的。FSH的晶体图谱结构和关于FSH/FSHR受体相S作用的知识结合，有助于进一歩选择潜在的N-糖基化位点。主要的设计标准就是3D结构破坏最小化、预测的结合和活性位点破坏最小化，以及预测的3D结构和糖基化相容。基于以上标准，鉴定出以下FSHa-亚基氨基酸序列的突变体<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例2FSH突变体的形态学分析从瞬时表达的FSHoc-亚基突变体取浓縮的培养物上清液分成若干等份，在非还原条件下进行SDS-PAGE分析，该条件可允许由完整的FSH二聚体不被拆分成游离的(x-和卩-亚基。通过比较每个突变体二聚体和野生型FSH的表观分子量，可以确定突变体FSH和野生型FSH相比是否为超糖基化的。简言之，电泳后，蛋白被电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用抗FSHa-亚基的雪兰诺(Serono)抗体9-4显影。作为对照，对野生型FSH、突变体GM1、FSH-羧基木端肽(FSH-CTP)和果纳芬(GonalF)也进行了分析。表1显示基于分子量标准品计算的由a-亚基突变体和野生型J3-亚基组成的异源二聚体的表观分子量。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表1所示，所表达的FSH突变体，即D3突变体，显示糖基化水平增加，证据是与野生型人FSH相比，该异源二聚体表观分子量分布有变化。实施例3FSH突变体的体外功能为了测定FSH突变体的活性，测定了每个突变体刺激重组表达人FSH受体的CHO细胞产生环磷酸腺苷(cAMP)的能力。CHO-FSH受体(CHO-FSHR)细胞保持在FSHR生长培养基中[基本培养基(MEM)(-)(Gibco,ca讲256卜056)+10%透析型胎牛血清(Gibco，cat#26300-020)+600ng/ml抗生素Geneticin(Gibco,cat#10131-035)+0.02^M氨甲喋呤]。CHO-FSHR细胞以2xl04细胞/孔接种，10(^1/孔(2^106细胞/101111=1皿)，在检测前于37。C孵育24小时。至少70%汇合时的细胞用于测定。所有样品和内标(GonalF作为内标)从67.5nM开始进行12-点1:3系列稀释。所有稀释都在检测培养基[DMEM/F12(不含酚红，Gibco,cat#11039-021)+mg/ml胎牛血清(Sigma，A-6003)+0.1mMIBMX(3-异丁基-l-甲基卩占吨酮-磷酸二酯酶抑制剂，Sigma，cat糾-7018)]中进行。从检测皿中去除生长培养基，加入25pl检测培养基(随MA6000cAMPMSD试剂盒-MesoScaleDiscovery,Gaithersburg，MD提供)，回收培养皿并在37。C孵育15分钟。孔中加入25pl/孔待测样品，混合，回收培养皿并在37°C孵育1小时。孵育1小时后，从孔中去除样品和培养基。然后每孔加入25ial标准裂解缓冲液(随MA6000MesoScaleDiscovery试剂盒提供)，培养皿加盖(Packard,cat存6005185)摇荡5分钟。5分钟裂解孵育后，将25(id细胞裂解物转移到cAMPMesoScaleDiscovery培养皿(随MA6000MSD试剂盒提供)中，室温温和混合培养30分钟。每孔加入25pcAMP-碱性磷酸酶组合物，然后每孔加入25pl抗cAMP抗体，培养皿加盖室温摇荡30分钟。培养皿而后用350ial/孔清洗缓冲液用自动清洗机清洗6次。然后每孔加入100pS叩phireIIRTU(即用型)底物增强剂，培养皿加盖25°C暗处孵育30分钟。然后培养皿每孔1秒读数，低cAMP浓度者显示高信号，高cAMP浓度者显示低信号。FSH突变体的量效关系曲线如图2所示。计算半数有效浓度(EC50)值，见表2。如图2和表2所示，FSH突变体具有与野生型FSH相当的体外活性。表2样品EC50M野生型FSH1.99E-10克隆15C-aD3N/pGM14.14E-10实施例4FSH突变体的体内半衰期两个不同批次的D3N突变体，运用独立的药代动力学研究进行分析。两项研究采取相同设计33只21R龄的未成熟雌性SD大鼠(体重约40g;CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)随机分成5个治疗组(n=6)和一个基线组(n=3)。选择未成熟雌性大鼠是基于要使用该年龄和性别来进行FSH的体内生物学活性测定。治疗组动物接受皮下(s.c.)注射4ugGMl(对照)、D3N突变体或8ugGonal-F(rFSH)果纳芬人重组FSH(Gonal-F(rFSH))(对照)。0小时从基线组动物，1、2、4、6、10、24、48和72小时从治疗组动物自球后窦取血(n-3/时间点；大鼠轮流取血以便两个后续的样品点不会出血)。每只大鼠每个出血点大约取血(Uml，收获血浆，储存于-80。C待ELISA分析。两项研究中所用的检测血清中FSH蛋白的方法是用DSLFSH包被孔板的ELISA(DiagnosticsSystemsLaboratories,Webster,TX)。每个血清样品重复分析三次。D3N突变体的半衰期明显高于野生型FSH。实施例5体内生物学活性评价D3N突变体体内生物学活性的模型是大鼠卵巢重量增加法。使用FSH或具有FSH类似活性的分子，如D3N突变体，治疗未成熟的21R龄雌性大鼠，触发卵巢卵泡生长和卵细胞产生。这种生长通过测量治疗末期卵巢重量很容易被检测到。在本模型中，待检测的物质通过注射给药3天，在最后一次给药后取出卵巢称重。该方法作为给临床产品标签FSH活性赋值的目的的基础已经使用了数十年。它能测量FSH的相关生理学作用，与临床产品的表现有明确的相关性。将D3N突变体与野生型FSH的体内活性进行比较。基于预测的FSH的等价十4并考虑到其体外活性和在大鼠体内的半衰期，来定义所有剂量。发现D3N突变体具有很强的FSH活性，其强度与野生型FSH相似。权利要求1.一种编码FSHα-亚基突变体的核酸，其中该α-亚基含有序列SEQIDNO:4。2.—种含权利要求1所述核酸的载体。3.如权利要求2所述的载体，其中该载体是表达载体。4.如权利要求2所述的载体，其中该载体还含有编码序列SEQIDNO:3的核酸。5.种含有权利要求2所述的载体的宿主细胞。6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。7.—种FSH突变体，其中(3-亚基含有序列SEQIDNO:3，a-亚基含有由权利要求1所述的核酸编码的序列。8.如权利要求1所述的FSH突变体，其中从0-6位的天冬酰胺残基中任何一个都是糖基化的。9.如权利要求7所述的FSH突变体，其中a-亚基含有序列SEQIDNO:4，并且其中N5是糖基化的。10.—种FHS突变体的生产方法，包括(a)提供一种细胞，该细胞含有权利要求1所述的核酸和编码序列SEQIDNO:3的第二核酸；(b)在允许第一和第二核酸表达的条件下培养该细胞。11.如权利要求l所述的方法，其中所述细胞能够使蛋白糖基化。12.如权利要求ll所述的方法，其中该细胞含有单一的载体，该载体含有权利要求1所述的核酸和编码序列SEQIDNO:3的核酸。13.如权利要求11所述的方法，其中该细胞含有含权利要求1所述的核酸的载体，还含有含编码序列SEQIDNO:3的核酸的第二载体。14.一种药物组合物，该组合物含有权利要求1所述的FSH突变体，任选地还含有药学可接受的载体或赋形剂。15.—种治疗哺乳动物不育的方法，包括在需要时把权利要求15所述的药物组合物给予哺乳动物。16.—种刺激哺乳动物卵泡生成的方法，包括在需要时把权利要求14所述的药物组合物给予哺乳动物。17.—种诱导哺乳动物卵巢超排卵的方法，包括在需要时把权利要求14所述的药物组合物给予哺乳动物。全文摘要本发明描述了具有附加糖基化和更长半衰期的FSH突变体。还描述了該FSH突变体诱导人类患者卵泡生成的用途。文档编号C07K14/59GK101370825SQ200780003073公开日2009年2月18日申请日期2007年1月16日优先权日2006年1月17日发明者M·穆达,S·D·麦肯纳,江旭亮申请人:雪兰诺实验室有限公司