专利名称：蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法
蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2009年4月20日提交的美国临时专利申请第61/170，897号的优先权，其整体援引加入本文。
背景技术：
本发明涉及用于控制蛋白质糖基化的方法及其相关组合物和方法。本发明进一步涉及减少糖蛋白的糖基化和/或聚糖位点占据率(occupancy)从而影响它们的生物学特征和/或功能的方法。本发明还涉及利用本发明的方法以控制糖基化而制备的组合物及其用途。蛋白质和多肽已成为越来越重要的治疗剂。在大多数情况下，这些蛋白质和多肽在细胞培养中产生，来自被改造和/或选择以产生异常高水平的所关注的特定蛋白质或多肽的细胞。细胞培养条件的控制和优化对于成功的蛋白质和多肽的商业化生产是极为重要的。许多在细胞培养中产生的蛋白质和多肽为糖蛋白，其含有包括寡糖链在内的共价连接的糖结构。这些寡糖链在内质网和高尔基体中通过N-键或0-键连接至蛋白质。寡糖链可以包含糖蛋白质量的显著部分。寡糖链被认为在糖蛋白的功能中起着关键作用，包括促进糖蛋白的正确折叠，介导蛋白-蛋白相互作用，赋予稳定性，赋予有利的药效和/或药物动力学特性，抑制蛋白质水解消化，将糖蛋白靶向适当的分泌途径以及将糖蛋白靶向特定器官或多个器官。—般,在内质网腔中将N-连接寡糖链添加至新生的易位蛋白(参见Alberts etal. , 1994, In Molecular Biology of the Cell,其援引加入本文)。寡糖被添加至在革巴共有序列Asn-X-Ser/Thr内含有的天冬酰胺残基的侧链上的氨基，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。通常在内质网中通过的特异性糖苷酶修剪初始寡糖链，导致由2个N-乙酰葡糖胺和3个甘露糖残基组成的短的分枝核心寡糖。在内质网中的初始加工之后，糖蛋白通过小泡穿梭至高尔基体，在这里寡糖链进行进一步加工，然后分泌至细胞表面。可以通过添加几个甘露糖残基来修饰修剪的N-连接寡糖链，导致高甘露糖寡糖。可选地，可以将一个或多个单糖单位的N-乙酰葡糖胺添加至核心甘露糖亚基以形成复杂寡糖(complex oligosaccharide)。可以将半乳糖添加至N-乙酰葡糖胺亚基，并且可以将唾液酸亚基添加至半乳糖亚基，导致以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺残基终止的链。此外，可以将岩藻糖残基添加至核心寡糖的N-乙酰葡糖胺残基。通过特异性糖基转移酶催化这些添加中的每一种。除了通过N-连接糖基化途径修饰糖蛋白，当它们在高尔基体中加工时还可以通过将0-连接寡糖链添加至特定丝氨酸或苏氨酸残基来修饰糖蛋白。一次添加一个0-连接寡糖残基，并且通过特异性酶催化每个残基的添加。与N-连接糖基化相比，0-连接糖基化的共有氨基酸序列较少明确定义。据证实，蛋白质特别是免疫球蛋白的糖基化对其生物学功能具有显著影响。例如，对于免疫球蛋白，已证实糖基化影响效应子功能、结构稳定性和抗体产生细胞的分泌率(Leatherbarrow et al.，1985, Mol. Immunol. 22 :407)。负责这些特性的糖基一般连接至抗体的恒定(C)区。例如，IgG激活补体依赖性细胞溶解的经典途径的完全能力需要在Ch2结构域中的天冬酰胺297处的IgG的糖基化(Tao and Morrison, 1989, J. Immunol. 143 2595)。在Ch3结构域中的天冬酰胺402处的IgM的糖基化是抗体的正确装配和细胞溶解活性所必需的(Muraoka and Shulman, 1989, J. Immunol. 142 :695)。去除诸如 IgA 抗体的ChI和Ch3结构域中的位置162和419的糖基化位点导致胞内降解和抑制至少90%的分泌(Taylor and Wall, 1988，Mol. Cell. Biol. 8 :4197)。还观察到在包含抗原结合位点的可变(V)区中的免疫球蛋白的糖基化。Sox和Hood(1970,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66 :975)报道约20%的人抗体在V区中是糖基化的。据信V结构域的糖基化是由V区序列中N-连接糖基化信号Asn-Xaa-Ser/Thr的偶然出现所引起的，并且本领域不认为其在免疫球蛋白功能中发挥重要作用。最近，已证实a -(1-6)葡聚糖特异性小鼠抗体的抗原结合位点中在重链的⑶R2处的糖基化增加其对葡聚糖的亲和力(ffallick et al. , 1988, J. Exp. Med. 168 :1099 ；and
Wright et al.，1991，EMBO J. 10 :2717)。还已证实去除抗CD33抗体的抗原结合位点内的糖基化位点的突变，更具体地，抗体M195的V结构域的框架区内的N-连接糖基化位点的去除增强抗体与抗原结合(Co等人的美国专利第6，350，861号)。然而，未去除存在于抗体的Fe部分中的N-连接糖基化位点，并且优选将其糖基化以维持分子的效应子功能。此外，已将糖酵解抑制物质加入细胞培养基以减少代谢废物乳酸的积累，从而增加细胞活力和抗体的蛋白质生产。参见，例如，国际专利申请第PCT/US2007/083473号，其现在公开为2008年5月8日的W02008/055260 (将糖酵解抑制化合物加入细胞培养物会减少乳酸浓度并增加生长分化因子8 (GDF-8)特异性抗体的产生)。虽然糖酵解抑制还可以影响蛋白质糖基化的水平，但是未评价甚至讨论抑制剂对蛋白质糖基化的影响。而且，细胞培养所产生的抗GDF-8抗体在抗原结合位点中不包含任何潜在的糖基化位点(参见WO2008/055260第49页第170段，引用Veldman等，美国专利公开第2004/0142382号，描述抗⑶F-8抗体Myo22、Myo28和Myo29)。因此，即使假设在重链恒定结构域的抗⑶F-8抗体的糖基化在所公开的培养条件下被影响，无法评价抗原结合位点的改变的糖基化的影响，因为看来所产生的抗体在抗原结合区(例如，V结构域)缺少潜在的糖基化位点。蛋白治疗剂的主要问题是对配体或抗原的降低的亲和力或低亲和力。丧失或降低的亲和力是高度不期望的，并且需要将更多的治疗性蛋白质注射入患者，成本更高并且副作用的风险更大。甚至更严重地，亲和力降低的蛋白质可能具有降低的生物学功能，如补体溶解、抗体依赖性细胞毒性和病毒中和。此外，与企图抑制其相互作用的内源性配体或结合伙伴相比减少的抗原或结合伙伴与治疗性蛋白质之间的竞争使得所述蛋白质可能具有降低的拮抗物功能。例如，在部分人源化抗体HUVHCAMP中亲和力的丧失可以导致其丧失所有介导补体溶解的能力(参见，Riechmann et al. , 1988, Nature, 332, 323-327,表 I)。此外，考虑到蛋白质构象的不可预测性，甚至单个氨基酸的突变，特别是在蛋白质的抗原结合位点或配体结合位点的单个氨基酸的突变可以对潜在的治疗性蛋白质的生物学活性具有剧烈影响。因此，本领域需要治疗性蛋白质，其具有改变的对配体的亲和力，或者在抗体的情况下，其具有改变的对抗原的亲和力，特别是对抗原或配体的增加的亲和力和/或增加的特异性，以及期望的潜在的由天然存在的恒定区糖基化所赋予的较低的免疫原性和提高的效应子功能。可选地，需要治疗性蛋白质，特别是包含免疫球蛋白恒定区的抗体或Fe融合蛋白，或者其部分，其具有提高的对抗原或配体的结合亲和力和/或特异性，但是存在于抗体重链恒定区中的糖基化位点的糖基化所介导的效应子功能下降或者没有效应子功能。还需要抑制或去除治疗性蛋白质的抗原或配体结合位点的糖基化，而不需要将任何突变引入所述抗原或配体结合位点的氨基酸序列。因此，本领域需要增加效力以及减少免疫球蛋白和其他治疗重要性蛋白质所需的剂量的方法，并且需要通过这样的方法所产生的治疗性蛋白质，本发明满足这些需要而不要求将任何突变引入抗体的抗原结合位点或治疗性蛋白质的配体结合位点。尽管存在治疗性糖蛋白的重要性和细胞培养方法的进步，对于在可以控制配体结合位点的糖基化的条件下产生这样的蛋白质而不要求将氨基酸突变引入这样重要的蛋白质部分的新方法仍有未满足的需要。本发明满足这种需要。发明概述本发明包括用于降低蛋白质的糖基化水平的方法。所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制剂的情况下，在生长于培养物中的宿主细胞中表达包含至少一个糖基化位点的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下在其他方面相同的条件下生长的其他方面相同的宿主细胞中产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质包含较低水平的糖基化，从而控制所述蛋白质的糖基化水平。在一方面,所述糖基化位点在配体结合位点或抗原结合位点中。在另一方面，所述糖基化水平选自在所述糖基化位点处的聚糖位点占据率和在所述糖基化位点处的糖基化的程度。在另一方面，所述糖基化位点选自0-连接糖基化位点和N-连接糖基化位点。在另一方面，所述糖基化位点为N-连接糖基化位点，并且进一步地，其中所述糖基化位点包含氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸。在另一方面，所述糖基化抑制剂为选自以下抑制剂中的至少一种衣霉素、衣霉素(tunicaymycin)同系物、链病毒菌素、杀枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、杆菌肽、corynetoxin、焦土霉素、金霉素(duimycin)、I-脱氧甘露糖野尻霉素(l-deoxymannonojirimycin)、脱氧野尻霉素、N-甲基_1_脱氧甘露糖野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖类似物、甘露糖类似物、2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧葡萄糖、D-(+)_甘露糖、D_(+)半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-匍萄糖、1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-甘露糖醇(DIM)、氟代葡萄糖、氟代甘露糖、UDP-2-脱氧葡萄糖、GDP-2-脱氧葡萄糖、甲羟戊二酸单酰-CoA还原酶抑制剂、25-羟基胆留醇、羟基胆留醇、苦马豆素、放线酮、嘌呤霉素、放线菌素D、莫能菌素、擬基氰化物间氯苯腙(m-Chlorocarbonyl-cyanide phenylhydrazone, CCCP)、密实菌素、多職长醇-磷酰基-2-脱氧葡萄糖(dolichyl-phosphoryl-2-deoxyglucose)、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黄嘌呤(hygoxanthine)、胸苷、胆固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴代环己烯四醇(bromoconduritol)、环己烯四醇环氧化物(conduritol epoxide)、环己烯四醇衍生物、糖基甲基对硝基苯三氮烯(glycosylmethyl-p-nitrophenyltriazene)、
羟基正缬氨酸、苏型￠-氟代天冬酰胺、D-(+)_葡糖酸S-内酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、十二烷基磷酸酯、(二苯甲基)-磷酸的2-二甲氨基乙酯、[2-( 二苯基磷氧基)乙基]三甲基碘化铵、碘乙酸酯和氟乙酸酯。在另一方面，所述糖基化抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖。在另一方面，所述糖基化抑制量的范围为约0. 5g/L_3g/L。在另一方面，所述方法还包括将所述培养物中的葡萄糖浓度维持在范围为约
0.05g/L-10g/L 的量。在另一方面，所述宿主细胞选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在另一方面，所述哺乳动物宿主细胞选自CHO细胞、NSO细胞、NS0/l、Sp2/0、人细胞、HEK 293、BHK、COS、Hep G2、PER. C6、C0S-7、TM4、CVl、VER0-76、MDCK、BRL 3A.W138.MMT060562、TRl、MRC5 和 FS4。在另一方面，所述宿主细胞为CHO细胞。在另一方面，所述糖基化位点为包含选自天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一种糖基化位点。本发明涵盖根据用于降低蛋白质的糖基化水平的方法所产生的蛋白质，其中所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制剂的情况下，在生长于培养物中的宿主细胞中表达包含至少一个糖基化位点的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下在其他方面相同的条件下生长的其他方面相同的宿主细胞中产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质包含较低水平的糖基化，从而控制所述蛋白质的糖基化水平，其中所述糖基化位点为配体结合位点或抗原结合位点，其中所述糖基化水平选自在所述糖基化位点处的聚糖占据率和在所述糖基化位点处的糖基化的程度，其中所述糖基化位点选自0-连接糖基化位点和N-连接糖基化位点，其中所述糖基化位点为包含选自天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)的氨基酸序列的至少一种糖基化位点，其中所述糖基化抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖，所述糖基化抑制量的范围为约0. 5g/L-3g/L，所述方法包括将所述培养物中的葡萄糖浓度维持在范围为约0. 05g/L-10g/L的量，其中所述宿主细胞选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一方面，所述哺乳动物细胞为CHO细胞，并且天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)。在另一方面，所述蛋白质为抗体或其抗原结合部分，并且进一步地，其中所述抗体为抗人IgE抗体。在另一方面，所述抗体为人抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO 10的氨基酸序列。在另一方面，与在不存在所述糖基化抑制剂的情况下产生的其他方面相同的抗体相比，所述抗体包含至少一个以下所述的N-连接糖基化位点,所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分，其中所述位点选自重链相对于SEQ ID NO :8的氨基酸序列的天冬酰胺73(N73)处的糖基化位点和天冬酰胺301 (N301)处的糖基化位点。在另一方面，所述抗体包含未被占据的在天冬酰胺73处的N-连接糖基化位点。在另一方面，所述蛋白质包含晚期糖基化终产物受体(RAGE)的配体结合位点(LBS)，所述配体结合位点包含选自SEQ ID NO 13,SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:15的氨基酸序列。在另一方面，所述蛋白质为RAGE融合蛋白，其包含没有信号序列的SEQ ID NO 1的氨基酸序列，所述信号序列包含氨基酸残基I至氨基酸残基23号，其中所述融合蛋白缺少末端赖氨酸残基(Lys438)。在另一方面，与在不存在所述糖基化抑制剂的情况下产生的其他方面相同的RAGE融合蛋白相比，所述RAGE融合蛋白包含至少一个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分，其中所述位点为选自在2号氨基酸残基(N2)处的天冬酰胺、在58号氨基酸残基(N58)处的天冬酰胺和在288号氨基酸残基(N288)处的天冬酰胺的至少一个位点，全部相对于没有信号序列(氨基酸I至23)的SEQ ID NO: I的氨基酸序列。在一方面，所述蛋白质包含至少两个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分。在另一方面，所述蛋白质包含三个N-连接糖基化位点，其中至少一个未被占据和/或少包含至少一个糖部分。在另一方面，与在不存在所述抑制剂的情况下产生的其他方面相同的蛋白质相t匕，所述蛋白质表现出增加的与抗原的结合。在另一方面，与在不存在所述抑制剂的情况下产生的其他方面相同的蛋白质相t匕，所述蛋白质表现出增加的与RAGE配体的结合。在一方面，所述方法还包括从范围为约34°C -39°C的温度至范围为约28V -33°C的温度的温度转换。在另一方面，所述方法包括从范围为约34 °C -37 °C的温度至范围为约30. 5°C -31. 5°C的温度的温度转换。本发明涉及一种药物组合物，其包含根据用于降低蛋白质的糖基化水平的方法所产生的蛋白质，其中所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制剂的情况下，在生长于培养物中的宿主细胞中表达包含至少一个糖基化位点的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下在其他方面相同的条件下生长的其他方面相同的宿主细胞中产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质包含较低水平的糖基化，从而控制所述蛋白质的糖基化水平，其中所述糖基化位点在配体结合位点或抗原结合位点中，其中所述糖基化水平选自在所述糖基化位点处的聚糖位点占据率和在所述糖基化位点处的糖基化的程度，其中所述糖基化位点为包含氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸的N-连接糖基化位点，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸，其中所述糖基化抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖，其中所述糖基化抑制量的范围为约0. 5g/L-3g/L，并且所述方法还包括将所述培养物中的葡萄糖浓度维持在范围为约0. 05g/L-10g/L的量，并且其中所述宿主细胞为CHO细胞。在另一方面，所述糖基化位点为包含选自天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一种糖基化位点。本发明涉及包含一定量的融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白包含连接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽，其中所述RAGE多肽包含人RAGE(SEQ ID NO 3)的片段，其中所述人RAGE的片段包含配体结合位点和至少一个可以被糖基化的氨基酸残基，其中所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的Ch2结构域或部分Ch2结构域以及免疫球蛋白的Ch3结构域，并且其中所述免疫球蛋白多肽的N端残基连接至所述RAGE多肽的C端残基；并且其中所述融合蛋白的量的至少0. 5%是非糖基化的(aglycosylated)。在一方面，所述融合蛋白的总量的至少30%是非糖基化的。在另一方面，完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率少于所有非完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率。在另一方面，所述融合蛋白包含至少三个可以糖基化的氨基酸残基，其中糖基化的第一潜在位点是所述RAGE配体结合位点的氨基酸残基，糖基化的第二潜在位点是所述RAGE多肽的氨基酸残基，而糖基化的第三潜在位点是所述免疫球蛋白多肽的氨基酸残基。本发明涉及一种组合物，其包含一种蛋白质，所述蛋白质包含至少一个潜在的糖
基化位点，其中完全糖基化的蛋白质的量少于糖基化低于完全糖基化的蛋白质的量，并且还包含药学可接受的载体。在一方面，所述蛋白质包含两个潜在的糖基化位点，并且其中完全糖基化的蛋白质的量少于包含一个未被糖基化和/或较低水平糖基化的位点的蛋白质的加和量和包含两个未被糖基化和/或较低水平糖基化的位点的蛋白质的量。下文描述了本发明的可选实施方案，如采用各种培养条件、糖蛋白以及涉及不同糖基化抑制剂的实施方案。
当结合附图阅读时会较好地理解上文的发明概述以及下文的发明详述。为了说明本发明的目的，图中示出了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于示出的具体安排和工具。图中图I为示出sRAGE-Ig融合蛋白的构建的图。示出了晚期糖基化终产物受体(RAGE)与它的三个胞外结构域(V、C1和C2)、跨膜结构域和推测负责RAGE信号传递的胞内结构域。术语“可溶性RAGE”和“sRAGE”所涵盖的可溶性或分泌形式的RAGE显示为缺少跨膜和胞内结构域。sRAGE可以作为诱饵受体，并且在图中其显示为仅RAGE胞外结构域。示出了全长人重链IgGl分子，显示可变结合结构域(Vh)与第一恒定结构域ChI —起形成抗体结合片段(Fab)，其通过柔性铰链区连接至IgGl分子的第二和第三恒定结构域(Ch2和Ch3)。该图还示出了通过将人RAGE的V和Cl结构域连接至IgGl分子的Ch2和CH3结构域来构建的有或没有(示出)免疫球蛋白铰链区的sRAGE-Ig融合蛋白。图2，包括图2A和2B，示出了本发明的sRAGE_Ig融合蛋白的氨基酸和核酸序列。图2A示出了本发明的sRAGE-Ig融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)0 sRAGE-Ig蛋白序列包含461个氨基酸，其包括23个氨基酸的信号肽/前导序列，在某些情况下可以为22个氨基酸，在表达期间被切割以产生438个氨基酸的成熟蛋白(或者在N端赖氨酸被剪掉时为437个氨基酸)。为了这个实例的目的，氨基酸残基的编号不包括23个氨基酸的前导序列，从而sRAGE-Ig融合蛋白序列具有在氨基酸I(Ql)处的谷氨酰胺，其可以环化以形成在氨基酸I处的焦谷氨酸(pE) (pEl)。人RAGE序列来源于GenBank登录号NM_001136。在位置N2、N58和N288处的三个下划线的天冬酰胺(N)表示N-连接糖基化的潜在位点。RAGE的V结构域跨越I号氨基酸残基至氨基酸残基E109。RAGE的Cl结构域与V结构域的C端序列重叠约10个氨基酸，并且跨越约氨基酸G99至E220。从氨基酸残基195至氨基酸残基198的下划线的氨基酸RALR表示弗林蛋白酶切割的共有序列。在sRAGE的C2结构域的N端的约8个氨基酸残基(PEGGAVAP)与Cl结构域的C端序列重叠，从而C1/C2连接处跨越约氨基酸L212至P228。IgGl Fe的CH2和CH3结构域显示为涵盖约P229至K438，其中末端赖氣fe (K)未被到掉。在不出的实施方案中，所述融合蛋白不包含完整的人IgGl绞链结构域。在另一实施方案中，所述融合蛋白可以包含铰链或其任何部分，包括其中铰链如果存在时可以被修饰，以便例如改变与未修饰的铰链区相关的任何效应子功能。图2B示出了编码包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的sRAGE-Ig融合蛋白的核酸序列(SEQ ID NO :2)。以粗体突出的编码序列1-753编码RAGE N端蛋白序列，而序列754-1386编码无铰链区的人IgG Fe ( y I)蛋白序列。图3为sRAGE-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析的图，其证实用PNGaseF和弗林蛋白
酶消化的效果。通过mabselect纯化在摇瓶培养中生长的细胞中表达的sRAGE_Ig融合蛋白，并且用PNGaseF或弗林蛋白酶进行消化，然后在还原4-12%梯度Bis-Tris凝胶上分析。每条泳道含有2. 7 yg的蛋白质。以Kd表示的分子量在左侧示出。泳道I和6含有未处理的融合蛋白。泳道2含有单独与PNGaseF消化缓冲液孵育的融合蛋白。泳道3含有用PNGaseF消化的融合蛋白。泳道4含有单独与弗林蛋白酶消化缓冲液孵育的融合蛋白。泳道5含有用弗林蛋白酶消化的融合蛋白。FLM=全长单体。图4示出了通过尺寸排阻层析(SEC)分析sRAGE-Ig融合蛋白的结果。在流动相(350mM朽1檬酸盐,pH 6.0)中将纯化的sRAGE-Ig融合蛋白稀释至3mg/mL,并且通过尺寸排阻层析(SEC)分析，利用Superdex 20010/300GL柱、环境温度、0. 75mL/分钟流速、20 y L注射体积和40分钟运行时间，在280nm监测。SEC使得能够用左上角的插图所示出的峰结果相对定量同源二聚体、异源二聚体、Fe 二聚体和高分子量类型(species)。图5示出了反相-HPLC的结果，其示出了 sRAGE-Ig融合蛋白的聚糖位点占据谱。叠加的层析谱为sRAGE-Ig融合蛋白(SI)和分级样品(S1F1、S1F2和S1F3)的FLM。级分S1F3的浓度非常低，因此其未被包括在随后的ELISA结合测定中。右上角的插图示出了每种聚糖的大约含量，为每个样品/级分的百分率。图6为示出图5所示的峰SlFl和S1F2通过质谱分析法的峰性质确认的图。质谱数据鉴定峰SlFl为3-聚糖类型，而S1F2为2-聚糖类型。图7为示出从sRAGE-Ig融合释放的N-连接聚糖的正相HPLC分析与层析谱上所示的峰的鉴定图。各种类型的相对丰度如表I所示。图8为示出sRAGE-Ig的胰蛋白酶消化的反相分离结果的图。插图示出了 N-连接胰蛋白酶消化肽段洗脱的区域。图9示出了含有共有N-连接糖基化位点的胰蛋白酶消化肽段的鉴定与理论单一同位素分子量。该图示出了来自用胰蛋白酶消化的sRAGE-Ig融合蛋白的三种预测的胰蛋白酶消化糖肽的氨基酸序列，并且示出了每种胰蛋白酶消化物(digest)的理论单一同位素分子量。所述胰蛋白酶消化糖肽如下具有约638. 36Da质量的TlpE(pENITAR);具有约 2241. 22Da 分子量的 TlO (VLPNGSLFLPAVGIQDEGIFR)；以及具有约 1188. 50Da 分子量的T31 (EEQYNSTYR)。
图10为示出反相-HPLC的图，其示出了在存在衣霉素的情况下表达的sRAGE-Ig融合蛋白的聚糖位点占据谱。叠加的层析谱为来自衣霉素处理的细胞的sRAGE-Ig融合蛋白(S2)和三个级分样品(S2F1、S2F1和S2F3)。右上角的插图示出了每个样品或其级分中每种聚糖的相对百分率。图11为示出图10所示的峰S2F1、S2F2和S2F3通过质谱分析法的峰鉴定的确认图。质谱数据鉴定峰S2F1为3-聚糖类型，S2F2为2-聚糖类型，而S2F3为0-聚糖类型。图12为示出典型存在于免疫球蛋白重链恒定区中的示例性二触角糖形的图。根据本发明，“G0”指其中不存在末端唾液酸(NeuAc)或Gal的二触角结构，“G1”指具有一个Gal而无NeuAc的二触角结构，并且“G2”指具有两个末端Gal而无NeuAc的二触角结构。图13，包括图13A至13D，示出了抗IgE抗体5. 948. I的重链和轻链的序列。图13A示出了 mAb 5. 948. I重链的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。可变结构域以小写字母显示，
而恒定结构域以大写字母显示。互补决定区(CDR)有下划线，并且重链可变区中在框架3的天冬酰胺73处的潜在N-连接糖基化位点以大写字母显示(“NTS”)。在重链恒定结构域中的N-连接糖基化位点(“NST”)Asn301有下划线。图13B示出了编码mAb 5. 948. I的重链的核酸序列(SEQ ID NO 9)。图13C示出了 mAb 5. 948. I轻链的氨基酸序列(SEQ IDN0:10)。可变结构域以小写字母显示，而恒定结构域以大写字母显示。互补决定区(OTR)有下划线。图13D示出了编码mAb 5.948. I的轻链的核酸序列(SEQ ID N0:11)。图14为示出抗体5. 948. I的重链的4种可能的聚糖位点占据变体的图。从左至右，该图示出了在Asn73或Asn301不包含聚糖的0-聚糖占据变体；仅在Asn301包含一个聚糖的I-聚糖占据变体；仅在Asn73包含一个聚糖的I-聚糖占据变体；以及在Asn73和Asn301均包含聚糖的完全占据的2-聚糖占据位点变体。图15为示出抗体5. 948的聚糖谱的图。重链被解析为3个峰，显示2_聚糖和I-聚糖变体。未检测到0-聚糖占据变体。可以将I-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fe区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。数据显示完全糖基化的2-聚糖占据重链包含在对照培养条件下产生的总重链的约98 %，而I-聚糖占据重链包含在对照培养条件下产生的总重链的约2 %。图16为示出单克隆抗体5. 948. l(mAb 5.948. I)与用乙二醇_N_聚糖酶去糖基化的5. 948. I抗体的样品和利用SDS和BME变性的样品一起的聚糖谱的图。如先前所见到的(图15，见上文)，天然5. 948. I抗体的重链解析为3个主峰，显示2-聚糖和I-聚糖变体。未检测到0-聚糖占据变体。可以将I-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fe区中糖基化的变体和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。天然去糖基化的5. 948. I抗体的重链显示出主要含有I-聚糖类型与一些0-聚糖类型的谱。变性去糖基化的5. 948. I抗体的重链显示出主要含有0-聚糖类型的谱。图17为示出在对照条件下(即，在不存在糖基化抑制剂的情况下)产生的抗体5. 948. I的聚糖谱的图，其中在第14天从培养物采集样品(样品7 ；S7)。重链被解析为3个峰，显示2-聚糖和I-聚糖变体。未检测到0-聚糖占据变体。可以将I-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fe区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。数据显示完全糖基化的2-聚糖占据重链包含在对照培养条件下产生的总重链的约98%，而I-聚糖占据重链包含在对照培养条件下产生的总重链的约2%。
图18为示出在存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下产生的抗体5.948. I的聚糖谱的图，其中在第14天从培养物采集样品(样品11 ;S11)。重链被解析为3个峰，显示2-聚糖和I-聚糖。很容易检测到0-聚糖占据变体。可以将I-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fe区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。图19为谱叠加的图，其比较在对照条件下(在不存在糖基化抑制剂的情况下)产生的mAb 5.948. I的聚糖谱和在糖基化控制条件下(即，在存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下)产生的mAb 5. 948. I的聚糖谱，其中在第14天从每种培养物采集样品(分别为S7和S11)。重链被解析为4个峰，显示2-聚糖、I-聚糖和0-聚糖变体。仅在Sll中很容易检测到0-聚糖占据变体。可以将I-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fe区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。数据显示与其中I-聚糖变体主要由Fe变体组成的对照样品(S7)相比，在2-脱氧-D-葡萄糖样品(Sll)中
I-聚糖Fab变体重链相对于I-聚糖Fe变体大大增加。图20，包括图20A和20B，为详细的谱比较图，其比较在存在和不存在糖基化抑制剂的情况下产生的抗体5. 948. I的聚糖谱。图20A为示出在对照条件下(在糖基化抑制剂不存在的情况下)产生的mAb 5.948. I的聚糖谱的图，其中在第14天从培养物采集样品
(S7)。图20B为示出在存在2-脱氧-D-葡萄糖的情况下产生的mAb 5. 948. I的聚糖谱的图，其中在第14天从培养物采集样品(Sll)。图20A和图20B的比较显示仅在Sll中很容易检测到0-聚糖占据变体。可以将I-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fe区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。数据显示与其中I-聚糖变体主要由Fe变体组成的对照样品(S7 ;图20A)相比，在2-脱氧-D-葡萄糖样品(Sll ;图20B)中I-聚糖Fab变体重链相对于I-聚糖Fe变体大大增加。图21为示出在对照条件下(即，在不存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下)产生的mAb 5. 948. I在该方法的时间进程中的聚糖谱的图。该图示出了 3条曲线，显示在培养的第7天(S5)、第12天(S6)和第14天(S7)采集的样品的聚糖谱。数据显示与在Fab位点(Asn73)糖基化的1_聚糖重链的量相比，在该蛋白质的Fe区(Asn301)糖基化的I-聚糖重链的相对量随时间增加。数据还证实在任何时间采集的任何样品中未检测到0-聚糖重链。图22为示出在存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下产生的mAb5. 948. I在该方法的时间进程中的聚糖谱的图。该图示出了 3条曲线，显示在培养的第7天
(S9)、第12天(SlO)和第14天(Sll)采集的样品的聚糖谱。数据显示与2-聚糖重链蛋白的量相比，I-聚糖重链蛋白的相对量随时间增加。此外，数据显示与在Fe位点(Asn301)糖基化的I-聚糖重链的量相比，在该蛋白质的Fab区(Asn73)糖基化的1_聚糖重链蛋白随时间增加。这与在对照样品中观察到的相反，对照样品中在培养期间Fe I-聚糖相对于FabI-聚糖增加。数据还证实在糖基化抑制条件下0-聚糖重链的产生随时间增加。图23为示出在对照条件下(即，在不存在糖基化抑制剂的情况下)产生的天然抗体5. 948. I (mAb 5. 948. I)与等量的用乙二醇-N-聚糖酶去糖基化的5. 948. I抗体样品和利用SDS和BME变性的样品一起的聚糖谱的图，其中在培养的第14天采集样品(S7)。如先前所见到的，天然5. 948. I抗体的重链解析为3个主峰，显示2-聚糖和I-聚糖变体。在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖不存在的情况下，未检测到这个样品的O-聚糖占据变体。图24为示出与等量的用乙二醇-N-聚糖酶去糖基化的5.948. I抗体样品(一 一)和利用SDS和BME变性的样品()相比的在存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下产生的天然抗体5. 948. I (mAb 5. 948. I)(实线)的聚糖谱的图，其中在培养的第14天采集样品(S7)。天然5. 948. I抗体的重链解析为4个峰，显示2-聚糖、I-聚糖和0-聚糖变体。很容易检测到这个样品的0-聚糖占据变体，并且进一步证实了在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖存在的情况下0-聚糖重链的产生。发明详述除非本文另有定义，用于本发明的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的意思。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。一般，本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交所用的命名及其技术是本领域众所周知和常用的。除非另有说明，一般根据本领域众所周知的方法并如本说明书所引用和讨论的各种普遍和更具体的参考文献所述进行本发明的方法和技术。这类参考文献包括，例如，Sambrook and Russell，2001， In Molecular Cloning， A Laboratory Approach， ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY ；Ausubel et al. , 2002, In CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY JBHarlow and Lane，1990，In Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor, NY，其援引加入本文。如本领域通常所完成的或如本文所述，根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术。本文所述的分析化学、有机合成化学、细胞和分子生物学、免疫学以及医药化学所用的命名及其实验室方法和技术是本领域众所周知和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。定义如本文所用，在这个部分中以下术语中的每个具有与其相关的意思。在本文中冠词“一个(a)”和“一个(an)”用于指一个或超过一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“一个元素”表示一个元素或超过一个元素。如本文所用，20个常规氨基酸及其缩写按照常规用法。参见Immunology--ASynthesis(2nd Edition, E. S.Golub and D. R.Gren, Eds. , Sinauer Associates,Sunderland, Mass. (1991))，其援引加入本文。如本文所用，通过其全名、其相应的三字母代码或其相应的单字母代码来表示氨基酸，如下表所示全名三字母代码单字母代码
天冬氨酸AspD
谷氨酸GluE
赖氨酸LysK
精氨酸ArgR
组氨酸HisH
酪氨酸TyrY
半胱氨酸CysC
天冬酰胺AsnN
谷氨酰胺GlnQ
丝氨酸SerS
苏氨酸ThrT
甘氨酸GlyG
丙氨酸AlaA
缬氨酸ValV
亮氨酸LeuL
异亮氨酸IleI
甲硫氨酸MetM
脯氨酸ProP
苯丙氨酸PheF
色氨酸TrpW“保守性氨基酸取代”是这样的取代，其中氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链R基团的另一氨基酸残基取代。一般来说，保守性氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或两个以上氨基酸序列互相的不同之处在于保守性取代的情况下，可以将序列相同性百分比或相似性程度上调以校正该取代的保守性。进行这种调整的方法为本领域技术人员众所周知。参见,例如，Pearson, 1994，Methods Mol.Biol. 243 :307-31)。具有化学特性相似的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；3)含有酰胺的侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含有硫的侧链半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可选地，保守性置换是在Gonnet et al.，1992，Science 256 :1443-1445 (其援引加入本文)所公开的PAM2501og-似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守”置换是在PAM2501og-似然矩阵中具有非负值的任何变化。优选的氨基酸取代为这样的取代(I)减少对蛋白质水解的敏感性，(2)减少对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，以及(4)赋予或修饰这样的类似物的其他物理化学和功能特性。包含取代、缺失、和/或插入的类似物可以包括具有除特定肽序列之外的序列的各种突变蛋白质。例如，可以在特定序列中(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽的部分中，例如，在CDR之外)产生单个或多个氨基酸取代(优选保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代应当基本上不改变亲本序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应当倾向于打开存在于亲本序列中的螺旋，或者破坏表征亲本序列的其他类型的二级
结构)。本领域公知的多肽二级和三级结构的实例如Proteins, Structures and MolecularPrinciples(Creighton, Ed. ,ff. H. Freeman and Company,New York (1984)) ； Introductionto Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York,N. Y. (1991));和 Thornton et al.，1991，Nature 354 :105)所述，各自援引加入本文。通常利用序列分析软件测量多肽的序列相似性。蛋白质分析软件利用相似性的测量来匹配相似序列，所述相似性测量归因于各种取代、缺失和其他修饰，包括保守性氨基酸取代。例如，Genetics Computer Group (可从 Genetics Computer Group, Inc.获得的GCG),也被称为Wisconsin Package,是超过130个程序的集成软件包,用于访问、分析和操作核苷酸和蛋白质序列。GCG含有诸如“Gap”和“Bestfit”的程序，其可以用于用缺省参数确定密切相关的多肽之间或者野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列相似性、同源性和/或序列相同性，所述密切相关的多肽如来自生物的不同物种的同源蛋白质。参见，例如，GCG版本6. I、版本7. O、版本9. I和版本10. O。还可以利用GCG中的程序FASTA比较多肽序列，利用缺省或推荐参数。FASTA (例如，FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列相同性百分比(Pearson,1990，Methods EnzymoI. 183 :63-98 ；Pearson,2000, Methods Mol. Biol. 132 185-219)。当本发明的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一优选算法为计算机程序BLAST,特别是blastp或tblastn,利用缺省参数。参见，例如，Altschul et al. ,1990,J. Mol. Biol. 215 :403-410 ；Altschul et al. ,1997,Nucleic AcidsRes. 25 :3389-402 ;其援引加入本文。本文使用常规表示法描述多肽序列多肽序列的左端为氨基端；多肽序列的右端
为羧基端。完整“抗体”包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。一般参见，Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, ff. ,1989,ed. ,2nd ed. Raven Press, N. Y.)(为了所有目的其整体援引加入本文)。每条重链由重链可变区(HCVR*Vh)和重链恒定区(Ch)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(LCVR或')和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域Q组成。可以将V1^P'区进一步细分为高变区，其被称为互补决定区(CDR)，散布在更保守的、被称为框架区(FR)的区域中。每个
Vl由3个⑶R和4个FR组成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排列FRl』DRl、FR2、raR2、FR3、CDR3、FR4。按照Kabat, 1987and 1991, In !Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,MD)或Chothia&Lesk,1987, J. Mol.Biol. 196 :901-917 ；Chothia et al.，1989，Nature 342 :878-883 的界定将氨基酸分配至每个结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。在轻链和重链内，通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接可变区和恒定区，而重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见，Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul,ff. , ed. , 2nd ed. Raven Press,N. Y. (1989))。本文所用的术语“配体结合位点”指与另一分子特异性结合的多肽或蛋白质的部分，或者其片段，所述另一分子也被称为结合伙伴或关联配体(cognate ligand)。优选地，配体结合位点(“LBS”)可以但不必须包含至少一个聚糖位点(在本文中也被称为“潜在的糖基化位点”)，所述聚糖位点可以但不必须被糖部分占据。配体结合位点的实例为RAGE的配体结合位点，其在2号氨基酸残基天冬酰胺(Asn2或N2)处包含聚糖位点，并且在N58处还包含第二聚糖位点，其中LBS与RAGE配体特异性结合，所述RAGE配体包括但不限于淀粉状蛋白P (AP)、血清淀粉状蛋白A(SAA)、S100、羧甲基赖氨酸(CML)、两性蛋白和⑶IIb/
CD18。在本文中可互换使用的术语“抗原结合位点”或“抗原结合部分”指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合至抗原(例如，IgE)的能力。据证实抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。涵盖在术语抗体的“抗原结合位点”之内的结合片段的实例包括⑴Fab片段，由Vh、(^和ChI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通过在铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和ChI结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的Vl和Vh结构域组成的Fv片段；(V) dAb片段(Ward et al.，1989,Nature 341 :544-546)，其由Vh结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域\和Vh由不同基因编码，但是可以利用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头使它们能够作为单个蛋白链，其中\和Vh配对以形成单价分子(称为单链 Fv(scFv));参见，例如，Bird et al.，1988，Science 242 :423-426 ;和 Hustonet al.，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883。这样的单链抗体也涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”之内。诸如双抗体(diabody)的其他形式的单链抗体也涵盖在内。双抗体为二价、双特异性抗体，其中在单个多肽链上表达Vh和\结构域，但是利用接头，所述接头太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对，从而强迫所述结构域与另一条链上的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger et al. , 1993, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 ；Poljak et al.，1994，Structure 2 :1121-1123)。此外，抗体或其抗原结合部分可以是较大的免疫粘附分子的部分，所述免疫粘附分子是通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽共价或非共价连接来形成的。这类免疫粘附分子的实例包括用链霉亲和素核心区产生四聚体scFv分子(Kipriyanov etal. , 1995, Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)以及用半胱氨酸残基、标记物肽和C端多聚组氨酸标签产生二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov et al. , 1994,Mol.Immunol. 31 :1047-1058)。其他实例包括其中将来自一个抗体的一个或多个⑶R共价或非共价并入分子以使其成为特异性结合至诸如IgE的所关注的抗原的免疫粘附素。在这样的实施方案中，CDR可以作为较大的多肽链的部分并入，可以共价连接至另一多肽链，或者可以非共价并入。可以利用常规技术从整个抗体制备诸如Fab和F(ab' )2片段的抗体部分，例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化整个抗体。此外，如本文所述，可以利用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。当在本文中提到关于本发明的“抗体”时，应当理解还可以使用其抗原结合部分。抗原结合部分与完整抗体竞争特异性结合。一般参见，Paul. ff. ,ed.，1989，In fundamentalImmunology,Ch. 7 (2nd ed. ,Raven Press,N. Y.)(为了所有目的其整体援引加入本文)。可以通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割来产生抗原结合部分。在一些实施方案中，“抗原结合部分”包括Fab、Fab’、F (ab’)2、Fd、Fv、dAb以及互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体和多肽，所述多肽至少含有抗体的部分，其足以赋予该多肽特异性抗原结合。在具有一个或多个结合位点的实施方案中，所述结合位点可以互相相同或者可以不同。本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。如本文所用，术语“人抗体”或“全人抗体”包括具有可变区的抗体，在所述可变区中框架和CDR区均来源于人种系(germline)免疫球蛋白序列。而且,如果所述抗体含有恒定区，该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本公开的人抗体或其抗原结合部分可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不包括这样的抗体，其中来源于诸如小鼠的另一哺乳动物物种的种系的CDR序列被移植至人框架序列。术语“人单克隆抗体”或“全人单克隆抗体”指表现出单一结合特异性的抗体，其具有可变区，在所述可变区中框架和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括获得自诸如转基因小鼠的转基因非人动物的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组，其中将所述B细胞融合至永生化细胞。如本文所用，术语“重组人抗体”包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，如(a)从人免疫球蛋白基因转基因或转染色体(transchromosomal)的动物(例如，小鼠)或由此制备的杂交瘤(下文进一步描述)分离的抗体；(b)从转化以表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离；(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体；以及(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有可变区，在所述可变区中框架和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，可以使这类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的Vh和\区的氨基酸序列虽然来源于人种系Vh和 '序列并与之相关，但是可以在体内人抗体种系库(repertoire)内不天然存在。如本文所用，“同种型”或“种类”指重链恒定区基因所编码的抗体种类(例如，IgM或IgG)。虽然抗体的恒定结构域不涉及结合至抗原，但是其表现出各种效应子功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，可以将给定人抗体或免疫球蛋白分至五大类免疫球蛋白中的一类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。不同种类的免疫球蛋白的结构和三维构型为众所周知。在各种人免疫球蛋白种类中，已知仅人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和IgM激活补体。已知人IgGl和IgG3在人中介导ADCC。如本文所用，“亚类”指重链恒定区基因的同种型内的进一步划分，例如，IgG同种型内的 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 亚类。短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。术语“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如，NK细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等)识别结合在靶细胞上的抗体，随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的这类细胞毒性细胞一般表达Fe受体(FcR)。介导ADCC的初级细胞(NK 细胞)表达 Fe ￥1 111，而单核细胞表达？(^1 1、？(^1 11、？(^1 111 和 / 或 Fe yRIV。在造血细胞上表达的 FcR如 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92(1991)所总结。为了评价分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利第5，500, 362号或第5，821，337号所述。对这类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤
(NK)细胞。可选地或额外地，可以在体内评价所关注的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如 Clynes et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)95 :652-656(1998)所公开的动物模型。术语“Fe受体”或“FcR”用于描述结合至抗体的Fe区的受体，其中Fe区包含重链的铰链区以及(^和^^结构域。例如，FcR可以是天然序列人FcR。FcR可以是结合IgG抗体的受体(Y受体)，并且包括Fe Y RI、Fe Y RH、Fe y RIII和Fe y RIV亚类的受体,包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括Fe Y RIIA( “激活受体”)和Fe y RIIB ( “抑制受体”)，这两个受体具有相似的氨基酸序列，不同之处主要在于其胞质结构域。激活受体Fe y RIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体Fe Y RIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见，Daeron, 1997, Annu. Rev. TmmunoI 15 :203_234)。在 Ravetch and Kinet,1991, Annu.Rev.Immunol. 9 :457-92 ； Cape I et al. , 1994, Immunomethods 4 :25-34 ;和 de Haas et al.,1995，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-341 中综述了 FcR。在本文中术语“FcR” 涵盖其他 FcR，包括那些在未来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al. ,1976, Tmmuno1. 117 587)和 Kim et al. ,1994, J. Tmmuno1. 24 249)。免疫球蛋白Fe片段上的主要FcR结合位点位于ChI和Ch2之间的铰链区中。这个铰链区与各种白细胞上的FcRl-3相互作用，并且触发这些细胞攻击靶标。(Wines et al. ,2000,J. Immunol. 164 :5313-5318)。铰链区包括但不限于美国专利第6，165，476号所述的序列。术语“能够诱导抗体依赖性细胞毒性”指通过本领域技术人员已知的测定法所测量的物质(诸如抗体)的引起ADCC的能力。这种活性的特征一般在于Fe区与各种FcR的结合。不受任何特定机制的限制，本领域技术人员会认识到抗体引起ADCC的能力可以例如，依靠其亚类(如IgGl或IgG3)，通过引入Fe区的突变，或者依靠对抗体的Fe区中的糖型的修饰。这样的修饰如美国专利公开第2007/0092521号所述。术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何修饰形式，例如，抗体与另一物质或抗体的
缀合物。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中来源于诸如小鼠的另一哺乳动物物种的种系的CDR序列已被移植至人框架序列。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
如本文所用，短语“特异性结合”表示化合物，例如蛋白质、核酸、抗体等，其识别并结合特定分子，但是基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，抗体或肽抑制剂，其识别并结合样品中的关联(cognate)配体(例如，与其关联抗原IgE结合的抗IgE抗体)，但是基本上不识别或结合该样品中的其他分子。因此，在指定的测定条件下，特定的结合部分(例如，抗体或其抗原结合部分)优选结合至特定靶分子，例如IgE，并且不以显著量结合至测试样品中存在的其他组分。各种测定形式可以用于选择特异性结合所关注的分子的抗体。例如，在可以用于鉴定与IgE特异性反应的抗体的许多测定中有固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcore, FACS和蛋白质印迹分析。典型地，特异性或选择性反应会是背景信号或噪声的至少2倍，并且更典型地是背景的超过10倍，甚至更具体地，当平衡解离常数(Kd)为彡I PM，优选彡IOOnM并且最优选彡IOnM时，认为抗体“特异性结合”抗原。如本文所用，术语“k ”指特定抗体-抗原或受体-配体相互作用的结合速率(on-rate)或结合速率(association rate),而如本文所用，术语“k。^”指特定抗体-抗原/受体-配体相互作用的解离速率(off-rate)或解离速率(dissociation rate)。如本文所用，术语“KD”指解离常数，其获得自U与km的比值(即，U/kJ，并且表示为摩尔浓度
(M)。可以利用本领域已建立的方法测定抗体或其它结合伙伴的Kd值。用于测定Kd的一种方法是通过利用表面等离子共振，通常利用生物传感器系统，如Biacore 系统。本文所用的术语“嵌合抗体”表示包含来自两个或两个以上不同抗体的区域的抗体。在某些实施方案中，“嵌合抗体”包含来源于一个物种的可变区序列和来源于另一个物种的恒定区序列，如一种抗体，其中可变区序列来源于小鼠抗体，而恒定区序列来源于人抗体。在一实施方案中，CDR中的一个或多个来源于小鼠抗人IgE抗体。在另一实施方案中，所有CDR均来源于小鼠抗人IgE抗体。在另一实施方案中，将来自不止一种小鼠抗人IgE抗体的CDR在嵌合人抗体中组合。例如，嵌合抗体可以包含来自第一小鼠抗IgE抗体的轻链的⑶R1、来自第二小鼠抗人IgE抗体的轻链的⑶R2以及⑶R3，并且⑶R3来自第三小鼠抗人IgE抗体的轻链，而且来自重链的⑶R可以来源于一种或多种其他抗IgE抗体。此外，框架区可以来源于相同小鼠抗人IgE抗体中的一种或者来源于一种或多种不同小鼠。此外，如本文前面所讨论的，嵌合抗体包括这样的抗体，其包含来源于不止一个物种的种系序列的部分。本发明的糖部分会参考用于描述寡糖的常用命名法来描述。使用这种命名法的糖化学的综述在 Hubbard and Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50 :555-583 中找到。这种命名法包括，例如，Man，其代表甘露糖；GicNAc，其代表2-N-乙酰葡糖胺；Gal，其代表半乳糖；Fuc，为岩藻糖；以及Glc，其代表葡萄糖。唾液酸通过简化符号描述如下=NeuNAc为5-N-乙酰神经氨酸，而NeuNGc为5-轻乙酰神经氨酸(IUB-IUPAC Joint Commissionon Biochemical Nomenclature,1982, J.Biol. Chem. 257 :3347-3351 ； (1982)J. Biol.Chem. 257 :3352)。本发明的糖结构出现在作为N-连接寡糖表达的蛋白质上。“N-连接糖基化”指糖部分通过GlcNAc连接至多肽链中的天冬酰胺残基。N-连接糖全部含有共同的Man1-6 (Manl-3)Man^ 1_4G1cNAcP l_4GlcNAc P-R核心结构。因此，在所述核心结构中，R代表产生的糖蛋白的天冬酰胺残基。所产生的蛋白质的序列会含有天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸(Asn-Xaa-Ser/Thr)。相比之下,“0-连接”糖的特征在于共同核心结构,其为连接至苏氨酸或丝氨酸的羟基的GalNAc，但是不需要共有序列。N-连接糖中最重要的是“复杂” N-连接糖，，如本文所述的“二触角”结构。技术人员会认识到糖蛋白免疫球蛋白G(IgG)与含有0个、I个或2个半乳糖残基的三种类型的复杂二触角结构相关(Wormland et al. ,1997, Biochemistry 36:1370-1380)，通常分别称为GO、Gl和G2。关于IgG类的人抗体分子，每种具有连接在Asn297的酰胺侧链的N-连接寡糖，Asn 297位于Fe区的CH2结构域的内表面的P-4转角(Beale and Feinstein,1976，Q. Rev. Biophys. 9 :253-259 ；Jefferis et al. ,1995,Immunol. Letts. 44 :111-117)。连接在IgG CH2结构域的Asn 297的寡糖部分是复杂二触角类型的，其具有经鉴定的多聚己糖核心结构和可变的外部糖残基(参见JefTeris et al.， 1997, supra ；ffyss and Wagner, 1996, Current Opinions in Biotech. 7 :409-416)。核心结构(GIcNAc2Man3GICNAC)为典型的二触角寡糖，并且可以如以下示意图所代表
权利要求
1.一种用于降低蛋白质的糖基化水平的方法，所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制剂的情况下，在生长于培养物中的宿主细胞中表达包含至少一个糖基化位点的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下在其他方面相同的条件下生长的其他方面相同的宿主细胞中产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质包含较低水平的糖基化，从而控制所述蛋白质的糖基化水平。
2.权利要求I的方法，其中所述糖基化位点在配体结合位点或抗原结合位点中。
3.权利要求2的方法，其中所述糖基化水平选自在所述糖基化位点的聚糖位点占据率和在所述糖基化位点的糖基化程度。
4.权利要求3的方法，其中所述糖基化位点选自O-连接糖基化位点和N-连接糖基化位点。
5.权利要求4的方法，其中所述糖基化位点为N-连接糖基化位点，并且进一步地，其中所述糖基化位点包含氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸。
6.权利要求5的方法，其中所述糖基化抑制剂为选自以下抑制剂的至少一种衣霉素、衣霉素同系物、链病毒菌素、杀枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、杆菌肽、corynetoxin、焦土霉素、金霉素、I-脱氧甘露糖野尻霉素、脱氧野尻霉素、N-甲基-I-脱氧甘露糖野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖类似物、甘露糖类似物、2-脱氧_D_匍萄糖、2-脱氧匍萄糖、D- (+)-甘露糖、D- (+)半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-匍萄糖、1,4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-甘露糖醇(DM)、氟代葡萄糖、氟代甘露糖、UDP-2-脱氧葡萄糖、GDP-2-脱氧葡萄糖、甲羟戊二酸单酰-CoA还原酶抑制剂、25-羟基胆留醇、羟基胆甾醇、苦马豆素、放线酮、嘌呤霉素、放线菌素D、莫能菌素、羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)、密实菌素、多萜长醇-磷酰基-2-脱氧葡萄糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴代环己烯四醇、环己烯四醇环氧化物、环己烯四醇衍生物、糖基甲基对硝基苯三氮烯、羟基正缬氨酸、苏型氟代天冬酰胺、D-(+)_葡糖酸I内酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、十二烷基磷酸酯、(二苯甲基)-磷酸的2-二甲氨基乙酯、[2-( 二苯基磷氧基)乙基]三甲基碘化铵、碘乙酸酯和氟乙酸酯。
7.权利要求6的方法，其中所述糖基化抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖。
8.权利要求7的方法，其中所述糖基化抑制量的范围为约O.5g/L-3g/L。
9.权利要求8的方法，所述方法还包括将所述培养物中的葡萄糖浓度维持在范围为约O.05g/L-10g/L 的量。
10.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞选自CHO细胞、NSO细胞、NS0/1、Sp2/0、人细胞、HEK 293、BHK、COS、Hep G2、PER. C6、COS-7, TM4、CVU VER0-76、MDCK, BRL3A.W138.MMT 060562、TRl、MRC5 和 FS4。
12.权利要求11的方法，其中所述宿主细胞为CHO细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述糖基化位点为包含选自天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一个糖基化位点。
14.根据权利要求10的方法产生的蛋白质。
15.根据权利要求13的方法产生的蛋白质。
16.权利要求15的蛋白质，其中所述蛋白质为抗体或其抗原结合部分，并且进一步地，其中所述抗体为抗人IgE抗体。
17.权利要求16的蛋白质，其中所述抗体为人抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID N0:10的氨基酸序列。
18.权利要求17的蛋白质，其中与在不存在所述糖基化抑制剂的情况下产生的所述其他方面相同的抗体相比，所述抗体包含至少一个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分，其中所述位点选自重链中相应于SEQ ID NO 8的氨基酸序列的天冬酰胺73 (N73)处的糖基化位点和天冬酰胺301 (N301)处的糖基化位点。
19.权利要求18的蛋白质，其中所述抗体包含未被占据的在天冬酰胺73处的N-连接糖基化位点。
20.权利要求15的蛋白质，其中所述蛋白质包含晚期糖基化终产物受体(RAGE)的配体结合位点(LBS)，所述配体结合位点包含选自SEQ ID NO 13,SEQ ID N0:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
21.权利要求20的蛋白质，其中所述蛋白质为RAGE融合蛋白，其包含没有信号序列的SEQ ID NO :1的氨基酸序列，所述信号序列包含氨基酸残基I至23号氨基酸残基，其中所述融合蛋白缺少末端赖氨酸残基(Lys438)。
22.权利要求21的蛋白质，与在不存在所述糖基化抑制剂的情况下产生的其他方面相同的RAGE融合蛋白相比，所述RAGE融合蛋白包含至少一个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分，其中所述位点为选自在2号氨基酸残基(N2)处的天冬酰胺、在58号氨基酸残基(N58)处的天冬酰胺和在288号氨基酸残基(N288)处的天冬酰胺的至少一个位点，全部相应于没有信号序列(氨基酸I至23)的SEQID NO 1的氨基酸序列。
23.权利要求22的蛋白质，其中所述蛋白质包含至少两个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分。
24.权利要求22的蛋白质，其中所述蛋白质包含三个N-连接糖基化位点，其中至少一个未被占据和/或少包含至少一个糖部分。
25.权利要求18的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下产生的所述其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质表现出增加的与抗原的结合。
26.权利要求22的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下产生的所述其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质表现出增加的与RAGE配体的结合。
27.权利要求11的方法，所述方法还包括从范围为约34°C_39°C的温度至范围为约28 V -33 0C的温度的温度转换。
28.权利要求27的方法，所述方法包括从范围为约34°C_37°C的温度至范围为约30. 5°C -31. 5°C的温度的温度转换。
29.—种药物组合物，其包含权利要求14的蛋白质和药学可接受的载体。
30.一种药物组合物，其包含权利要求15的蛋白质和药学可接受的载体。
31.包含一定量的融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白包含连接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽， a)其中所述RAGE多肽包含人RAGE(SEQ ID NO :3)的片段，其中所述人RAGE的片段包含配体结合位点和至少一个可以被糖基化的氨基酸残基， b)其中所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的Ch2结构域或部分Ch2结构域和免疫球蛋白的Ch3结构域，以及 c)其中所述免疫球蛋白多肽的N端残基连接至所述RAGE多肽的C端残基；以及 其中所述融合蛋白的量的至少O. 5%是非糖基化的。
32.权利要求31的组合物，其中所述融合蛋白的总量的至少30%是非糖基化的。
33.权利要求31的组合物，其中完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率少于所有非完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率。
34.权利要求31的组合物，其中所述融合蛋白包含至少三个可以被糖基化的氨基酸残基，其中糖基化的第一潜在位点是所述RAGE配体结合位点的氨基酸残基，糖基化的第二潜在位点是所述RAGE多肽的氨基酸残基，糖基化的第三潜在位点是所述免疫球蛋白多肽的氣基酸残基。
35.一种组合物，其包含一种蛋白质，所述蛋白质包含至少一个潜在的糖基化位点，其中完全糖基化的蛋白质的量少于糖基化低于完全糖基化的蛋白质的量，并且还包含药学可接受的载体。
36.权利要求35的组合物，其中所述蛋白质包含两个潜在的糖基化位点，并且其中完全糖基化的蛋白质的量少于包含一个未被糖基化和/或较低水平糖基化的位点的蛋白质的加和量与包含两个未被糖基化和/或较低水平糖基化的位点的蛋白质的量。
全文摘要
本发明涉及用于控制蛋白质的糖基化的新方法和由此产生的蛋白质。本发明的示例性方法包括通过在糖基化抑制剂存在的情况下培养表达所述蛋白质的宿主细胞来产生包含降低的糖基化水平的蛋白质，例如，所述蛋白质在糖基化位点包含较少聚糖或较少糖。在本发明的示例性方法中，降低的糖基化水平改变所述蛋白质的生物学特征，例如，改变了所述蛋白质与其靶配体的结合。
文档编号C07K14/705GK102803292SQ201080027386
公开日2012年11月28日 申请日期2010年4月15日 优先权日2009年4月20日
发明者R·G·库姆斯, S·罗, D·L·鲁布尔 申请人:辉瑞公司