专利名称：具有变异糖基化方式的细胞系和蛋白质的制作方法
技术领域：
已经表明碳水化合物、糖类、或者糖分子组成中的变化会影响IgG对三类 Fc γ R(Fe γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII)的亲和性，其中Fc γ R将IgG-介导的免疫反应与效应子功能联系起来(Wright 和 Morrison，Trends Biotechnol 15(1) J6-32 ;Gessner 等，Ann Hematol 76(6) :231-48(1998) Jefferis 等，Immunol Rev 163 :59-76 (1998). Ravetch 和 Bolland, Annu Rev Immunol 19:275-9(^2001))。根据与蛋白质部分的结合形式的不同，通常将糖蛋白的糖链分为下列两大类即， 与天冬酰胺结合的糖链(N-糖苷连接的糖链)；以及与其它氨基酸(如丝氨酸或苏氨酸)结合的糖链(0-糖苷连接的糖链)。通常，它们具有下述结构式(I)所示的基本共同核结构
权利要求
1.一种糖蛋白，该糖蛋白被修饰为表现出变异糖基化方式，其中所述变异糖基化方式的特征在于，与对应的野生型糖蛋白相比，至少两种糖分子的水平发生变化。
2.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中所述变异糖基化方式通过葡萄糖、半乳糖、或这二者的水平变化来证实。
3.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中所述半乳糖的水平变化为降低。
4.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中所述葡萄糖的水平变化为增加。
5.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中所述变异糖基化方式通过葡萄糖水平的增加、 半乳糖水平的降低以及岩藻糖水平的降低来证实。
6.根据权利要求1所述的糖蛋白，所述变异糖基化方式通过末端葡萄糖部分来证实。
7.根据权利要求1所述的糖蛋白，所述变异糖基化方式包括具有式(I)或(II)所示结构的N-连接多糖
8.—种由经修饰的宿主细胞产生的抗体，该抗体包含N-连接多糖，其中，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，所述抗体对Fc γ受体Illa(FcYRlIIa)的结合亲和性增加，并且/或者对Fcy受体IIb(FcyRnb)的结合亲和性降低，从而提高了对表达 Fc γ RIIIa和/或Fc γ RIIb的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。
9.一种由经修饰的宿主细胞产生的抗体，该抗体包含N-连接多糖，其中，与由对应的未修饰的宿主细胞产生的对应的抗体相比，所述抗体的ADCC活性增加，并且其中，所述增加的ADCC活性针对表达高亲和性Fc γ受体Fc YRIIIa 158V/V的效应细胞、以及表达低亲和性 Fc γ 受体 Fc YRIIIal58F/F 或 Fc YRIIIa 158F/V 的效应细胞。
10.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述N-连接多糖包含一个葡萄糖分子、四个甘露糖分子和两个N-乙酰基葡萄糖胺分子。
11.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述N-连接多糖包含一个或多个岩藻糖分子。
12.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述N-连接多糖具有式(I)或(II)所示的结构
13.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述N-连接多糖与所述抗体的Fc区相连。
14.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体结合癌抗原。
15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述癌抗原选自由HER2、免疫球蛋白εFc受体 II、Alk-1、CD20、EGF 受体、VEGF 受体、FGF 受体、NGF 受体、PDGF 受体、EpCam, CD3、CD4、 CD1 la、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、 CTLA-4、黏蛋白1、黏蛋白16、内皮糖蛋白、间皮蛋白受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂⑶3、以及α和β整联蛋白所组成的组。
16.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体为抑制性抗体。
17.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体为IgG抗体。
18.根据权利要求8或9所述的抗体，其中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、 CHO-Kl (ATCC#CCL-61 和 CRL-9618)或 CH0-DG44anvitrogen#U609_012)产生的抗体相比，所述抗体对表达低亲和性FcR的Fc y RIIIal58F/F或Fc γ RIIIa 158F/V的效应细胞的 ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性增加。
19.根据权利要求8或9所述的抗体，其中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、 CHO-Kl (ATCC#CCL-61 和CRL-9618)或CH0-DG44(Invitrogen#12609_012)产生的抗体相比， 所述抗体对表达高亲和性FcR的Fc y RIIIal58V/V的效应细胞的ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性增加。
20.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
21.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述宿主细胞选自由NSO、SP2/0、HEK293、 PER. C6和TO2/0细胞组成的组。
22.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述宿主细胞为骨髓瘤细胞。
23.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述效应细胞为人外周血液单核细胞 (PBMC)。
24.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体为抗-Her2抗体。
25.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述效应细胞为NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、或多形核中性粒细胞(PMN)。
26.—种N-连接多糖，包含一个葡萄糖分子、四个甘露糖分子和两个N-乙酰基葡萄糖胺分子。
27.根据权利要求沈所述的N-连接多糖，其中所述葡萄糖位于所述N-连接多糖的末端，并且该N-连接多糖可任选地包含一个或多个岩藻糖分子。
28.根据权利要求沈所述的N-连接多糖，具有式(I)所示的结构
29.根据权利要求沈所述的N-连接多糖，具有式(II)所示的结构
30.一种经分离的糖蛋白，其包含权利要求沈至四中任意一项所述的N-多糖。
31.根据权利要求30所述的糖蛋白，其中该糖蛋白为抗体。
32.根据权利要求30所述的糖蛋白，其中该糖蛋白为酶。
33.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述N-连接多糖与所述抗体的Fc区相连。
34.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述抗体结合癌抗原。
35.根据权利要求34所述的糖蛋白，其中所述癌抗原选自由HER2、免疫球蛋白εFc受体 II、Alk-1、CD20、EGF 受体、VEGF 受体、FGF 受体、NGF 受体、PDGF 受体、EpCam、CD3、CD4、 CD1la、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、 CTLA-4、黏蛋白1、黏蛋白16、内皮糖蛋白、间皮蛋白受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂⑶3、以及α和β整联蛋白所组成的组。
36.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述抗体由经修饰的宿主细胞产生，所述宿主细胞产生基本上同种群的N-连接多糖。
37.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、 CHO-Kl (ATCC#CCL-61 和CRL-9618)或CH0-DG44(Invitrogen#12609_012)产生的抗体相比， 所述抗体的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性增加。
38.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、 CHO-Kl (ATCC#CCL-61 和CRL-9618)或CH0-DG44(Invitrogen#12609_012)产生的抗体相比， 所述抗体对Fc y RIIIA受体的结合亲和性增加。
39.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述抗体为抑制性抗体。
40.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述抗体为IgG抗体。
41.一种制备经修饰的糖蛋白的方法，包括(a)提供编码所述经修饰的糖蛋白的异源多核苷酸序列；以及(b)使所述经修饰的糖蛋白在宿主细胞中表达，其中所述宿主细胞产生具有变异糖基化方式的N-连接多糖，所述变异糖基化方式的特征在于，选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺所组成的组中的一种或多种糖部分的水平发生变化。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主细胞保持在无血清培养基中。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主细胞保持在悬浮液培养物中。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述经修饰的糖蛋白为抗体。
45.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主细胞产生具有式(I)或(II)所示结构的N-连接多糖
46.一种经修饰的宿主细胞，其产生具有变异糖基化方式的N-连接多糖，所述变异糖基化方式的特征在于，与未修饰的母本宿主细胞相比，选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺所组成的组中的一种或多种糖部分的水平发生变化。
47.根据权利要求46所述的经修饰的宿主细胞，其中所述变异糖基化方式的特征在于，与所述未修饰的母本宿主细胞相比，所述宿主细胞表面上存在的至少两种糖分子的水平发生变化。
48.一种经分离的宿主细胞，其产生糖蛋白，该糖蛋白表现出基本上同种方式的N-连接多糖。
49.根据权利要求48所述的宿主细胞，其中所述基本上同种方式的N-连接多糖由通过质谱解析的单峰来证实。
50.一种经修饰的宿主细胞，其特征在于能够产生具有N-连接多糖的经修饰的抗体，其中，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，该抗体对Fc γ受体 IIIa(FcyRIIIa)的结合亲和性增加，并且/或者对Fc γ受体lib (Fe γ RIIb)的结合亲和性降低，从而提高对表达Fc γ RIIIa和/或Fc γ RIIb的效应细胞的ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。
51.根据权利要求50所述的宿主细胞，其中提高的ADCC活性针对表达高亲和性Fcγ 受体Fc γ RIIIa 158V/V的效应细胞、以及表达低亲和性Fc γ受体的Fc YRIIIa 158F/F或 Fc YRIIIa 158F/V的效应细胞。
52.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述N-连接多糖表现出变异方式，该变异方式的特征在于，半乳糖水平降低。
53.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述变异糖基化方式的特征在于，葡萄糖水平增加。
54.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其产生这样的抗体，该抗体表现出的ADCC活性高于对应的未修饰的宿主细胞的ADCC活性。
55.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述变异糖基化方式的特征在于，存在末端葡萄糖部分。
56.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述变异糖基化方式的特征在于，岩藻糖水平降低，葡萄糖水平增加并且半乳糖水平降低。
57.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述N-连接方式具有式 I或II所示的结构
58.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
59.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述细胞为骨髓瘤细胞。
60.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述细胞在至少约60代后仍保持所述变异糖基化方式。
61.一种培养基，其包含根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞。
62.一种培养发酵罐，其包含在无血清培养基中的多种根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞。
63.一种选择具有变异糖基化方式的真核细胞的方法，包括(a)提供多个真核细胞；(b)将随机基因突变引入到所述多个真核细胞中；以及，(c)从所述多个细胞中选择至少一个表现出变异糖基化方式的细胞，所述变异糖基化方式的特征在于，与对应的未进行所述随机基因突变的母本细胞相比，至少一种糖分子的水平发生变化。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述基因突变由化学诱变剂诱导。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺中的一种或多种糖部分的水平发生变化。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，半乳糖水平降低。
67.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，D-葡萄糖胺水平降低。
68.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，甘露糖水平增加。
69.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，存在末端葡萄糖分子。
70.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述真核细胞产生这样的抗体，该抗体表现出的ADCC活性高于对应的未进行所述随机基因突变的细胞的ADCC活性。
71.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述真核细胞产生这样的抗体，与对应的由未进行所述随机基因突变的细胞产生的抗体相比，该抗体对Fc γ RIIIA受体的结合亲和性增加。
72.根据权利要求63所述的方法，其中所述真核细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
73.根据权利要求63所述的方法，其中所述真核细胞选自由NS0、SP2/0、HEK293、PER. C6和TO2/0细胞组成的组。
74.根据权利要求63所述的方法，其中所述真核细胞为骨髓瘤细胞。
75.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞在至少约60代之后仍保持所述变异糖基化方式。
76.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞在无血清培养基中生长。
77.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞在悬浮液中生长。
78.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞包含编码异源糖蛋白的异源序列。
79.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞表达基本上同种方式的N-连接多糖。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述基本上同种方式的N-连接多糖由通过质谱解析的单峰来证实。
81.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，所述N-连接方式具有式I或II所示的结构
82.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，半乳糖水平降低，葡萄糖水平增加，并且岩藻糖水平降低。
全文摘要
本发明提供一种包含产生具有变异糖基化方式的糖蛋白的细胞的组合物和方法。所述方法和组合物可以用来制备具有治疗价值的抗体和蛋白质。
文档编号C07K16/18GK102216452SQ200980145664
公开日2011年10月12日 申请日期2009年7月21日 优先权日2008年9月26日
发明者刘诚, 向京宜, 戴炜展, 王培 , 言苏 申请人:尤里卡治疗公司