分子的糖基化的制作方法

分子的糖基化的制作方法【专利摘要】本文描述的是可用于产生目标分子的改变的N-糖基化形式的方法和遗传工程化细胞。还描述用于治疗多种病症例如代谢紊乱的方法和N-糖基化改变的分子。【专利说明】分子的糖基化[0001]本申请是基于申请日为2008年4月3日，优先权日:为2007年4月3日，申请号为200880018736.4(PCT/IB2008/001814)，发明名称为："分子的糖基化"的专利申请的分案申请。【
技术领域：
】[0002]本发明涉及获得糖基化的分子，特别是蛋白质和脂质分子的方法。[0003]置量[0004]高效表达系统是生产大多数目前正在开发中的生物药物（例如，重组蛋白）所需要的。许多这些生物药物的生物学活性依赖于它们的修饰（例如，磷酸化或糖基化）。一种基于酵母的表达系统将遗传操作和微生物发酵的简易性与分泌和修饰蛋白的能力相结合。然而，酵母细胞中产生的重组糖蛋白主要展现为异质性的高甘露糖和超甘露糖聚糖结构（high-mannoseandhyper-mannoseglycanstructures)，其可能对蛋白质功能、下游加工和后续治疗用途有害，特别是在糖基化扮演重要的生物学角色的情况下。[0005]概沭[0006]本发明至少部分基于：（a)发现解脂西洋蓍霉（YarrowiaIypolitica)细胞中的单个基因缺失（外部链延长（OuterCHainelongation)(OCHl)缺失）导致基本上均质产生在Man5GlcNAc2(结构式IV;图1)骨架上具有α-1，2_连接的甘露糖残基的糖基化蛋白质；(b)发现靶向解脂西洋蓍霉细胞（具有和不具有OCHl缺失的两种细胞）ER的经工程化的α-1，2-甘露糖苷酶的过表达导致基本上均质产生具有Man5GlcNAc2N-聚糖结构（结构式IV;图1)的糖基化蛋白；（c)发现使解脂西洋蓍霉细胞中天冬酰胺连接的糖基化3(ALG3)酶活性失活导致糖基化聚糖水平的高度增加；和（d)发现解脂西洋蓍霉细胞中解脂西洋蓍霉基因（MNM)的过表达导致α-1，2-连接的甘露糖残基的超磷酸化（hyperphosphorylation)。如此，遗传工程化的细胞（例如，解脂西洋蓍霉（Yarrowialipolytica)、Arxulaadeninivorans，或其它相关种类的双态性酵母细胞）可以在产生如下目标分子的方法中使用，所述目标分子如与在未经遗传工程化的相同种类的细胞中产生的目标分子的N-糖基化形式相比具有改变的N-糖基化形式。向患有代谢紊乱（例如，溶酶体IC积病（lysosomalstoragedisorder))的患者施用N-糖基化的目标分子（例如，N-糖基化蛋白）已被证明可改善所述病症的症状，所描述的方法和细胞可用于制备N-糖基化的目标分子用于治疗，包括但不限于，代谢紊乱，例如溶酶体贮积病。[0007]本发明还至少部分基于解脂西洋蓍霉和巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)HACl基因的剪接形式的发现。由HACl基因编码的蛋白质Haclp是转录激活因子，其通过与称为未折叠蛋白质应答（UnfoldedProteinResponse)(UPR)元件的DNA序列基序结合而激活数个靶基因的转录。在Haclp靶基因之中包括编码侣伴蛋白、折叠酶（foldase)和负责脂质和肌醇代谢的蛋白质的那些。由于经剪接形式Haclp是比由未经剪接的HAClmRNA所编码的形式更强力的转录激活因子，所以Haclp转录因子的经剪接形式的过表达能够导致天然和异源蛋白表达水平的增加，以及在ER膜中的增加。由此，Haclp的经剪接形式能够用于在多种真核细胞（例如，真菌细胞（例如，解脂西洋蓍霉或任何其它本文描述的酵母细胞）、植物细胞或动物细胞（例如，哺乳动物细胞如人的细胞）中通过同时激活UPR和表达目标分子来增加膜蛋白和分泌蛋白的产生。[0008]本发明还基于这样的发现，即在解脂西洋蓍霉中表达时，丽Sl甘露糖苷酶的突变形式能够将Man8GlcNAc2(结构式I;图4)结构转化成Man5GlcNAc2(结构式IV;图4)、Man6GlcNAc2(结构式V;图4)和Man7GlcNAc2(结构式VI;图4)。由此，表达甘露糖苷酶如MNSl的突变形式的遗传工程化的真核细胞（例如，真菌细胞（例如，解脂西洋蓍霉或任何其它本文描述的酵母细胞）、植物细胞或动物细胞（例如，哺乳动物细胞如人的细胞））能够在产生如下目标分子的方法中使用，所述目标如与在未经遗传工程化的相同种类的细胞中产生的目标分子的N-糖基化形式相比具有改变的N-糖基化形式。因此，所描述的方法和细胞可用于制备N-糖基化的目标分子用于治疗，包括但不限于，代谢紊乱，例如溶酶体贮积病（见下文）。[0009]在一个方面，本公开描述了产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法。所述方法包括向细胞引入编码目标蛋白的核酸的步骤，其中所述细胞产生N-糖基化形式改变的目标蛋白，并且其中所述细胞是经遗传工程化而含有至少一种经修饰的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞（或相关种类的双态性的酵母细胞）。所述方法也可包括提供经遗传工程化而含有至少一种经修饰的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞（或相关种类的双态性的酵母细胞）的步骤。所述方法也可包括分离目标蛋白的改变的N-糖基化形式的步骤。[0010]在一些实施方案中，目标蛋白可以是内源蛋白或外源蛋白。目标蛋白可以是哺乳动物蛋白如人的蛋白。目标蛋白可以是例如，病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。融合蛋白可以是例如，病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子或趋化因子与抗体或其抗原结合片段的融合物。目标蛋白可以是例如，与溶酶体贮积病（LSD)相关的蛋白质。目标蛋白可以是例如，葡糖脑苷酯酶、半乳糖脑苷酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶Β、芳基硫酸醋酶Α、α-Ν-乙酰半乳糖胺酶（α-Ν-acteylgalactosaminidase)、天冬氨酰葡糖胺酶(aspartylglucosaminidase)、艾杜糖醛酸-2-硫酸醋酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、β-D-葡糖醛酸酶（β-D-glucoronidase)、透明质酸酶、α-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶（sphinogmyelinase)、硫酯酶、组织蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。[0011]在一些实施方案中，改变的N-糖基化形式可以含有一种或多种N-聚糖结构如，例如，Man5GlcNAcrMan8GlcNAcpMan9GlcNAcrMan3GlcNAc2Xlc1Man5GlcNAc2Xlc2Man5GlcNAc20在一些实施方案中，改变的糖基化可以是，例如，Man5GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Man3GlcNAc2、Glc1Man5GlcNAc2NGlc2Man5GlcNAc20[0012]在一些实施方案中，目标蛋白的改变的N-糖基化形式可以是均质的或基本上均质的。例如，含有改变的糖基化的改变的目标分子的分数可以是至少约20%，至少约30%，至少约40%，至少约45%，至少约50%，至少约55%，至少约60%，至少约65%，至少约70%，至少约75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，或至少约95%或更多。[0013]在一些实施方案中，细胞可以经遗传工程化而缺乏至少一种N-糖基化活性。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCHl活性、丽Sl活性或MNN9活性。[0014]在一些实施方案中，至少一种修饰可以是：(a)缺失编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因；(b)表达具有N-糖基化活性的蛋白质的突变形式；（c)引入或表达干扰具有N-糖基化活性的蛋白质的功能性表达的RNA分子；（d)表达具有N-糖基化活性的蛋白质(例如ALG6或α-甘露糖苷酶（例如，靶向内质网的α-甘露糖苷酶）。表达的蛋白质可以是由细胞中的内源核酸编码的蛋白质。表达的蛋白质可以是最适pH在7.5以下的（例如，最适PH在5.1以下）的α-甘露糖苷酶。具有N-糖基化活性的蛋白质可以是外源蛋白。具有N-糖基化活性的蛋白质可以是哺乳动物蛋白（如人的蛋白）或低等真核生物的(例如，真菌、原生动物或锥虫）蛋白。低等真核生物可以选自下组：布氏锥虫（Typanosomabrucei)、哈茨木霉（Trichodermaharzianum)、曲霉（Aspergillus)，和任何其它本文描述的低等真核生物。[0015]在一些实施方案中，N-糖基化活性可以是葡萄糖基转移酶活性。在一些实施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白质是ALG6或α-甘露糖苷酶。α-甘露糖苷酶可以靶向内质网。例如，具有N-糖基化活性的蛋白质可以是融合蛋白，其包含α-甘露糖苷酶多肽和HDEL内质网保留肽（HDELendoplasmicreticulumretentionpeptide)。[0016]在一些实施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白质可以是能够从Man5GlcNAc2去除葡萄糖残基的蛋白质。例如，具有N-糖基化活性的蛋白质可以是具有α-1，3-葡糖苷酶活性的蛋白质，例如，但不限于，葡糖苷酶11(例如，葡糖苷酶II的α和β亚基之一或二者）或变聚糖酶（mutanase)。[0017]在一些实施方案中，细胞可以经遗传工程化而包含至少两种经修饰的N糖基化活性，例如任何本文描述的经修饰的N-糖基化活性。所述至少两种经修饰的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。[0018]在一些实施方案中，细胞可以经遗传工程化而包含至少三种经修饰的N-糖基化活性，例如任何本文描述的经修饰的N-糖基化活性。所述至少三种经修饰的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。[0019]在一些实施方案中，细胞未经遗传工程化而缺乏OCHl活性。[0020]在一些实施方案中，修饰可以包含表达能够影响目标蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物活性的变体。所述能够影响目标蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物活性的变体可以是1剛4、？勵1或11剛6。在一些实施方案中，糖蛋白的至少约30%的甘露糖基残基可以是磷酸化的。[0021]在一些实施方案中，所述方法可进一步包括对糖蛋白的额外加工。额外加工可以发生在体外或体内。额外加工可以包括将异源模块（moiety)添加到修饰的糖蛋白。异源模块可以是聚合物或载体。额外加工可以包括对目标蛋白的改变的N-糖基化形式酶处理或化学处理。例如，额外加工可以包括用甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基转移酶处理目标蛋白的改变的N-糖基化形式。额外加工可以包括用氢氟酸处理目标蛋白的改变的N-糖基化形式。额外加工可以包括目标蛋白的改变的N-糖基化形式的磷酸化。[0022]在另一方面，本公开提供产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法。本方法包括如下步骤：提供经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性的真核细胞（例如，真菌细胞、植物细胞或动物细胞）；和向细胞引入编码目标蛋白的核酸，其中所述细胞产生N-糖基化形式改变的目标蛋白。[0023]在另一方面，本公开描述了产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法。所述方法包括将目标蛋白与从解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞制备的细胞裂解物接触的步骤，所述解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性，其中将目标蛋白与所述细胞裂解物接触导致目标蛋白的改变的N-糖基化形式。[0024]在又一方面，本公开描述产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法，所述方法包括将目标蛋白与一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质接触的步骤，其中所述一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质获得自经遗传修饰而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞，并且其中将目标分子与一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质接触导致目标蛋白的改变的N-糖基化形式。[0025]在另一方面，本公开提供N-糖基化改变的分离的蛋白质，其中所述蛋白质由任一上述方法产生。[0026]在又一方面，本公开提供分离的经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞（或其它相关种类的双态性的酵母细胞）。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCHl活性、丽Sl活性或MNN9活性。所述修饰可以是任何本文所述的那些修饰。例如，所述修饰可以包括：(a)缺失编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因；(b)表达具有N-糖基化活性的蛋白质的突变形式；（c)引入或表达干扰具有N-糖基化活性的蛋白质的功能性表达的RNA分子；或（d)表达具有N-糖基化活性的蛋白质。具有N-糖基化活性的蛋白质可以是例如，ALG6。具有N-糖基化活性的蛋白质可以是哺乳动物蛋白，例如人的蛋白。所述修饰也可以包括表达能够促进经修饰糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白质（例如，MNM或PN01)或其生物学活性的变体。[0027]在另一方面，本公开提供治疗病症的方法，所述病症可以通过施用N-糖基化改变的蛋白质来治疗。所述方法包括向受试者施用如下蛋白质的步骤，所述蛋白质可以通过上述任何方法获得，其中所述受试者是患有或疑似患有可通过施用N-糖基化改变的蛋白质来治疗的疾病的患者。所述方法也可以包括如下步骤：(a)提供受试者和/或（b)测定该受试者是否患有可以通过施用N-糖基化改变的蛋白质来治疗的疾病。所述受试者可以是哺乳动物如人。所述病症可以是例如，癌症，免疫病症（例如，炎性状态）或代谢紊乱。代谢紊乱可以是任何本文描述的那些代谢紊乱，例如，溶酶体贮积病（LSD)如高歇尔氏病(Gaucherdisease)、泰-沙二氏病（Tay-Sachsdisease)、旁姆普氏病（Pompedisease)、尼-皮二氏病（Niemann-Pickdisease)或法布里氏病（Fabrydisease)。所述蛋白质可以是与LSD相关的蛋白质，例如，所述蛋白质可以是，例如，葡糖脑苷酯酶、α-半乳糖苷酶。所述蛋白质可以是，例如，a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶（hexosaminidase)、β-D-甘露糖苷酶、a-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸醋酶Β、芳基硫酸醋酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明质酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶（sphinogmyelinase)、硫醋酶、组织蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。[0028]在另一方面，本公开提供解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞（或其它相关种类的双态性的酵母细胞）的基本上纯的培养物，其中大量细胞是经遗传工程化而包含至少一种经修饰（例如任何本文所述的修饰）的N-糖基化活性的。所述细胞培养物可以包含一种或多种细胞亚群，各亚群包含不同的经修饰的糖基化活性。[0029]在又一方面，本公开提供：（a)包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的分离的核苷酸序列；（b)包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%相同的序列的分离的核苷酸序列；或（c)由（a)或（b)的分离的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，分离的核酸序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。[0030]在另一方面，本公开描述分离的核酸，其含有：(a)在高严紧条件下与SEQIDNO:1或SEQIDN0:2的补体杂交的核苷酸序列；或（b)核苷酸序列的补体。[0031]在又一方面，本公开提供：(a)包含本文所示核酸序列中任一（或由其组成）的分离的核苷酸序列；(b)包含与本为所示的核酸序列中的任一至少80%相同的序列的分离的核苷酸序列；或（c)由（a)或（b)的分离的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，所述分离的核酸序列是本文所示的核酸序列中的任一。[0032]在另一方面，本公开描述分离的核酸，其含有：(a)在高严紧条件下与本文所示核酸序列中任一的补体杂交的核苷酸序列；或（b)所述核苷酸序列的补体。[0033]在又一方面，本公开提供：(a)包含上述核酸序列中任一的载体或（b)含有（a)的载体的经培养的细胞。所述载体可以是表达载体。载体中的核酸序列可以与表达调控序列可操作地连接。[0034]在另一方面，本公开提供产生蛋白质的方法。所述方法包括在允许多肽表达的条件下培养上述细胞中的任一种的步骤。所述方法也可包括如下步骤：在培养细胞之后，从细胞或培养细胞的培养基中分离多肽。所述细胞可以是例如，含有包含上述核酸序列中任一的载体的经培养细胞。[0035]本文所述的目标分子（例如，目标蛋白）、具有N-糖基化活性的蛋白质和N-糖基化改变的分子（统称为"本发明的分子"）可以是，但不需要是分离的。术语"分离的"如应用于任何本文所述的本发明的分子是指这样的分子或其片段，其已经从天然与其伴随的成分（例如，蛋白质或其它天然存在的生物分子或有机分子）分开或纯化。应理解的是重组分子（例如，重组蛋白）将总是"分离的"。通常，当本发明的分子按重量占制备物中全部相同类型的分子的至少60%时，例如占样品中全部相同类型的分子的60%时，则它是分离的。例如，当糖基化改变的蛋白质按重量占制备物或样品中全部蛋白质的至少60%时，它是分离的。在一些实施方案中，制备物中的本发明的分子按重量组成至少75%，至少90%，或至少99%的制备物中全部相同类型的分子。[0036]如用于本文，目标分子的"改变的N-糖基化形式"是由经遗传工程化的宿主细胞(例如，解脂西洋蓍霉细胞、Arxulaadeninivorans细胞或另一相关的双态性酵母细胞种类的细胞）产生的目标分子的N-糖基化形式，其不同于未经遗传工程化的与经遗传工程化的细胞相同种类的细胞中产生的目标分子的N-糖基化形式。由此，目标分子的改变的糖基化形式可以是例如，非N-糖基化的目标分子。此外，目标分子的改变的糖基化形式可以是例如，一种或多种N-联聚糖的磷酸化改变的目标分子的形式。[0037]如用于本文，术语"其它相关的双态性酵母细胞种类"是指与解脂西洋蓍霉和Arxulaadeninivorans相关的属于双足囊菌科（familyDipodascaceae)的酵母，例如Arxula、双足囊菌属（Dipodascus)(例如白色双足囊菌（D.albidus)、大双足囊菌(D.ingens)、或D.specifer)、半乳糖霉（Galactomyces)(例如里氏半乳糖霉（G.reesii)或大地半乳糖霉（G.geotrichum))、Sporopachyderma、射盾子囊霉属（Stephanoascus)(例如，西非射盾子囊霉（S.ciferii))、拟威克酵母属（Wickerhamiella)和接囊菌属(Zygoascus)。具体而言，进化枝Metchnikowia(例如，M.pulcherrima或M.agaves)和射盾子囊霉属（通过分析菌种如Arxula(例如A.adeninivorans或A.terrestris)的26S-rDNA序列的D1/D2结构域将解脂西洋蓍霉被分配于其中）中的酵母以及一些念珠菌属菌种（Candidaspecies)(例如，C.apicola，而非白念珠菌（C.albicans)、麦芽糖念珠菌(C.maltose)或热带念珠菌（C.tropicalis))〇[0038]"多肽"和"蛋白质"可以互换使用并且意指任何肽连接的氨基酸链，无论其长度和翻译后修饰。[0039]本公开还提供本文所述的野生型、全长、成熟"目标蛋白"或"具有N-糖基化活性的蛋白质"的（i)生物学活性变体和（ii)生物学活性片段或其生物学活性变体。全长、成熟、野生型蛋白质或所述蛋白质的片段的生物学活性变体可以含有添加、缺失或取代。具有取代的蛋白质将通常具有不多于50个（例如，不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50个）保守氨基酸取代。保守取代是用一种氨基酸取代另一种具有相似特征的氨基酸。保守取代包括在以下组内的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。将上述极性、碱性或酸性组中的一个成员用相同组中的另一成员取代可认为是保守取代。相反，非保守取代是用一种氨基酸取代另一种具有不相似的特征的氨基酸的取代。[0040]缺失变体可以缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个（两个或更多个氨基酸的）氨基酸区段或不连续的单独氨基酸。[0041]添加（添加变体）包括融合蛋白，所述融合蛋白含有：（a)全长、野生型、成熟多肽或其含有至少五个氨基酸的片段；和（b)内部或末端（C或N)的无关的或异源的氨基酸序列。在这些融合蛋白的背景下，术语"异源氨基酸序列"是指除（a)之外的氨基酸序列。因此含有本文描述的肽和异源氨基酸序列的融合蛋白在序列上不对应于天然存在的蛋白质的全部或部分。例如，异源序列可以是用于重组蛋白的纯化的序列（例如，FLAG、多组氨酸(例如，六组氨酸）、血凝素（hemagluttanin)(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)或麦芽糖结合蛋白（MBP))。异源序列也可以是用作诊断或检测标志物的蛋白质，例如，萤光素酶、绿色荧光蛋白（GFP)或氯霉素乙酰转移酶（CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞（例如，酵母宿主细胞）中，目标蛋白的表达和/或分泌可以通过使用异源信号序列增加。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引发免疫应答（例如，用于抗体生成；见下文）的载体（例如，KLH)或内质网或高尔基体保留信号。异源序列可以具有不同的长度，并且在一些情况下可以是比异源序列所附接的全长目标蛋白更长的序列。[0042]"片段"如用于本文是指比全长、不成熟的蛋白质短的多肽的区段。蛋白质的片段可以具有末端（羧基或氨基末端）缺失和/或内部缺失。通常，蛋白质的片段的长度将是至少4个（例如，至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少18个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个或至少100个或更多个）氨基酸。[0043]目标蛋白或具有N-糖基化活性的蛋白质的生物学活性片段或生物学活性变体具有野生型、全长、成熟蛋白质的活性的至少25%(例如，至少：30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99.5%，或100%或甚至更高）。在目标蛋白的情况下，相关活性是目标蛋白在经遗传工程化的细胞中经历改变的N-糖基化的能力。在具有N-糖基化活性的蛋白质的情况下，相关活性是N-糖基化活性。[0044]依赖于它们的预期用途，蛋白质、其生物学活性片段或生物学活性变体可以是任何物种的，如，例如，真菌（包括酵母）、线虫、昆虫、植物、鸟、爬行动物、或哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、沙鼠（gerbil)、犬、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴或人）。在一些实施方案中，生物学活性片段或生物学活性变体包括所述蛋白质的免疫原性和抗原性片段。免疫原性片段是具有相关全长、未成熟蛋白质在感兴趣的动物中刺激免疫应答（例如，抗体应答或细胞免疫应答）的能力的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99·5%或100%或甚至更多）的片段。蛋白质的抗原性片段是具有相关全长、未成熟的蛋白质被对于所述蛋白质特异性的抗体或对于所述蛋白质特异性的T细胞识别的能力的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99.5%或100%或甚至更多）的片段。[0045]"N-糖基化活性"如用于本文是指任何如下活性，S卩⑴能够向目标分子添加N-联聚糖（即，寡糖基转移酶活性）；（ii)从目标分子去除N-联聚糖，（iii)修饰目标分子上的一个或多个N-联聚糖，（iv)修饰多萜醇连接的寡糖；或（V)能够辅助（i-iv)之内的活性的活性。同样，N-糖基化活性包括，例如，N-糖苷酶活性、糖苷酶活性、糖基转移酶活性、糖核苷酸合成、修饰或转运蛋白活性。对目标分子上一种或多种N-联聚糖的修饰包括甘露糖基磷酰基转移酶（mannosylphosphoryltransferase)活性、激酶活性或磷酸酶活性，例如，改变目标分子上N-联聚糖的磷酸化状态的甘露糖基磷酰基转移酶、激酶或磷酸酶活性。[0046]如用于本文，"遗传工程化"细胞或"经遗传工程化的细胞"和类似术语是指任何人工创造的细胞的遗传改变，其导致与未经遗传工程化的细胞（例如，真菌细胞例如解脂西洋蓍霉细胞、Arxulaadeninivorans细胞或其它相关种类的双态性的酵母细胞，植物细胞或动物细胞（例如，哺乳动物细胞例如人的细胞））相比细胞中的至少一种经修饰的N-糖基化活性。由此，应该理解的是人工创造的遗传改变不包括，例如，自发突变。人工遗传改变的实例在下文描述（参见"遗传工程化的细胞"）。[0047]如用于本文，术语"野生型"如应用于核酸或多肽是指当生物学生物体存在于自然界中时分别在该生物学生物体中存在的或由所述生物学生物体产生的核酸或多肽。[0048]术语"异源"如在本文中应用于宿主细胞中的核酸或由宿主细胞产生的多肽是指并非源自与宿主细胞相同种类的细胞的核酸或多肽（例如，具有N-糖基化活性的蛋白质）。因此，如用于本文，"同源"核酸或蛋白质是在与宿主细胞相同种类的细胞中存在的或由与宿主细胞相同种类的细胞产生的那些。[0049]术语"外源"如用于本文与核酸和特定宿主细胞有关时是指不存在于（并且不能获得自）在自然界中存在的所述特定细胞的任何核酸。因此，非天然存在的核酸一旦引入宿主细胞则被认为对于所述宿主细胞是外源的。重要的是应注意非天然存在的核酸可以含有在自然界中存在的核酸序列的核酸亚序列或片段，条件是所述核酸作为整体不存在于自然界中。例如，在表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且因此一旦引入宿主细胞则对所述宿主细胞是外源的，因为该核酸分子作为整体（基因组DNA加上载体DNA)不存在于自然界中。因此，作为一个整体在自然界中不存在的任何载体、自复制质粒或病毒（例如，逆转录病毒、腺病毒或疱瘆病毒）被认为是非天然存在的核酸。由此推断通过PCR或限制性内切核酸酶处理的基因组DNA片段以及cDNA被认为是非天然存在的核酸，因为它们作为在自然界中不存在的单独的分子而存在。还由此推断以自然界中不存在的排列含有启动子序列和多肽编码序列的任何核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸对于特定细胞可以是外源的。例如，从酵母X的细胞分离的完整染色体一旦引入酵母y的细胞则该染色体对于酵母y的细胞是外源核酸。[0050]从上文将显而易见的是，"外源"核酸可以是"同源"或"异源"核酸。相反，术语"内源"如用于本文与核酸或基因（或由所述核酸或基因编码的蛋白质）以及特定细胞有关时是指确实存在于（并且可以获得自）在自然界中存在的所述特定细胞中。[0051]作为对上述概念的示例，转化入解脂西洋蓍霉细胞中的编码解脂西洋蓍霉ALG6蛋白的表达质粒相对于该细胞而言是外源核酸。然而，编码ALG6蛋白的序列和由其产生的ALG6蛋白与所述细胞是同源的。类似地，转化入解脂西洋蓍霉细胞中的编码ArxulaadeninivoransALG6蛋白的表达质粒相对于该细胞而言是外源核酸。然而与前一例子相反，编码所述ALG6蛋白的序列和由其产生的ALG6蛋白与所述细胞是异源的。[0052]如用于本文，"启动子"是指使基因能够被转录的DNA序列。启动子由RNA聚合酶识别，然后起始转录。因此，启动子含有或者直接通过RNA聚合酶的募集结合的或在RNA聚合酶的募集中涉及的DNA序列。启动子序列也可以包括"增强子区"，其是能够与蛋白质结合以增强基因簇中基因的转录水平（因此得名）的一个或多个DNA区（S卩，反式作用因子，更像一组转录因子）。所述增强子尽管通常在编码区的5'端，但是也可以与启动子序列分开，并且可以例如在基因内含子区内或在基因编码区的3'。[0053]如用于本文，"可操作地连接"是指并入遗传构建体从而表达调控序列有效地调控感兴趣的编码序列的表达。[0054]本文描述的任何核酸序列的变体（例如，SEQIDNO:1或SEQIDN0:2中所示的HACl序列）可以具有与野生型核酸序列同源的序列，例如，与野生型核酸序列为至少约70%(例如，至少约75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%或至少约99%)同源（相同）的序列。这样的野生型序列可以分离自自然界或者可以通过重组或合成方法产生。由此野生型序列核酸可以具有天然存在的人的核酸序列、猴核酸序列、鼠类核酸序列或任何其它含有所述感兴趣野生型核酸的同源物的物种的核酸序列。如用于本文，"同源"或"同源核酸序列"或类似术语是指如下序列，其特征在于在核苷酸水平的至少指定百分比的同源性，并且可与序列同一性互换使用。[0055]百分比同源性或同一性可以如下测定，例如通过Gap程序（WisconsinSequenceAnalysisPackage,用于UNIX的第八版，GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,Madison,WI)，使用缺省设定，其使用Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482-489)的算法。在一些实施方案中，探针和靶（见下文）之间的同源性在约50%至约60%之间。在一些实施方案中，探针和靶核酸之间的同源性是大约55%-65%，65%-75%，约70%-80%，约75%-85%，约80%-90%，约85%-95%或约90%-100%。[0056]术语"探针"如用于本文是指长度可变的核酸序列。在一些实施方案中，探针包含至少10个并且多如6,000个核苷酸序列。在一些实施方案中，探针包含至少12个，至少14个，至少16个，至少18个，至少20个，至少25个，至少50个或至少75个或100个连续核苷酸。较长长度的探针通常获得自天然或重组的来源（与直接的化学合成相反），对于靶序列是高特异性的，并且与较长的寡聚物相比与靶杂交慢得多。探针可以是单链或双链核酸分子。[0057]在一些实施方案中，本文描述的变体核酸可以具有如下序列，所述序列包含与感兴趣的野生型核酸（例如，如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所示的HACl核酸序列）中的区域、部分、结构域或区段具有部分互补性（例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互补性）的单链或双链。在一些实施方案中，感兴趣的变体核酸序列可以具有如下序列，所述序列包含与野生型核酸序列中的区域、部分、结构域或区段具有完全互补性（即，100%互补性）的单链或双链。序列"互补性"是指特定含氮碱基之间由于它们的氢键键合特性（即，具有使反向平行双链体能够形成的碱基序列的两条核酸链的性质，其中腺嘌呤和尿嘧啶（或胸腺嘧啶，在DNA或经修饰的RNA的情况下）彼此相反，而鸟嘌呤和胞嘧啶彼此相反）产生的化学亲和力。如此，完全互补序列将是在核苷酸序列形成反向平行双链体时具有完全的一对一碱基序列对应性（即，腺嘌呤对尿嘧啶/胸腺嘧啶且鸟嘌呤对胞嘧啶）的两个序列。[0058]杂交也可用作对两个核酸序列之间同源性的测量。本文描述的核酸序列，或其片段或变体，可以用作依据标准杂交技术的杂交探针。感兴趣的特定探针（例如，HACl核苷酸序列的探针，例如，如SEQIDN0S:1或2中所示的HACl核苷酸序列）与来自试验来源(例如，真核细胞）的DNA或RNA的杂交表明对在试验来源中对应于所述探针的DNA或RNA的存在（例如，HACl核苷酸序列）。杂交条件是本领域那些技术人员已知的，并且可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6,1991中找到。将中等杂交条件定义为等同于在2X氯化钠/柠檬酸钠（SSC)中在30°C杂交，之后在IXSSC、0.1%SDS中在50°C清洗。将高严紧性条件定义为等同于在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在45°C杂交，之后在0.2XSSC、0.1%SDS中在65°C清洗。[0059]除非另有限定，本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的一个普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似的或等同的方法和材料，在下文将描述示例性的方法和材料。将本文提及的全部公开文献、专利申请、专利、Genbank?登录号和其它参考文献通过所述整体并入。发生冲突的情况下，以包括定义在内的本申请为准。材料、方法和实例仅作为示例说明，而非意欲进行限制。[0060]本发明的其它特征和优势，例如，产生N-糖基化改变的分子的方法，将从以下详述并从权利要求书中清楚可见。[0061]附图简沐[0062]图1是描述在酵母内质网的N-聚糖前体合成的示意图。其所编码的蛋白质具有介导指明的酶促转化的活性的基因在带阴影的框中（例如，ALG7;左上）。"UDP"和"UMP"分别指二磷酸尿苷和一磷酸尿苷。"⑶P"和"GMP"分别指二磷酸鸟苷和一磷酸鸟苷。"Gn"是指N-乙酰葡糖胺。"Μ"是指单体甘露糖，G是指葡萄糖，Pi是指磷酸。[0063]图2是描述酵母内质网中N-聚糖加工的示意图。[0064]图3是描述酿酒酵母（S.cerevisiae)高尔基体中N-聚糖加工的示意图。其编码的蛋白质具有介导指明的酶促转化的活性的基因在带阴影的框中（例如，OCHl;中上）。[0065]图4是描述多种本文所述的N-聚糖结构的示意图。[0066]图5是描述用于破坏解脂西洋蓍霉中OCHl基因的克隆策略的示意图。"PCR"是指聚合酶链式反应。[0067]图6是描述用于MNN9基因破坏片段的克隆策略的示意图。"PCR"是指聚合酶链式反应。[0068]图7是一系列描述获得自野生型解脂西洋蓍霉细胞或糖基化突变体（例如，A〇chlcI9、Amnn91和AochlAmnn9)细胞和MTLY60菌株细胞的甘露糖蛋白的N-聚糖分析的电泳图谱（electroferogram)。在一些情况下，将所述N-聚糖进一步用α-1，2甘露糖苷酶处理。使用DNA测序仪辅助型、荧光团辅助型糖电泳（DSA-FACE)来进行分析。"Μ5"，"Μ6"，"Μ7"，"Μ8"，和"Μ9"是指与基本N-乙酰葡糖胺结构结合（conjugate)的甘露糖残基数。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖（oligomaltose)的分析。[0069]图8是描述用于酿酒酵母丽Sl表达载体的克隆策略的示意图。"PCR"是指聚合酶链式反应。[0070]图9是一系列描述对获得自MTLY60细胞的分泌型糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱，所述细胞表达野生型（WT)Mnslp或所指明的Mnslp的多种突变形式（即，R273G、R273L或R269S/S272G/R273L)。分析使用DSA-FACE进行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"，"M9"是指与基本N-乙酰葡糖胺结构结合的甘露糖残基数。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。[0071]图10是描述用于MNM表达载体的克隆策略的示意图。[0072]图11是一系列描述对获得自指明的野生型MTLY60细胞或糖基化突变细胞的分泌型糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"，"M9"是指与壳二糖核心结构结合的甘露糖残基数。"P"是指含有一个磷酸残基的甘露糖蛋白，而"PP"是指含有两个磷酸残基的甘露糖蛋白。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。[0073]图12是描述用于α-半乳糖苷酶表达载体的克隆策略的示意图。[0074]图13是一系列描述对获得自指明的野生型MTLY60细胞或糖基化突变细胞的多种克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。"alg3"表明所述细胞是ALG3敲除型。"ALG6过表达"表明所述ALG6的蛋白质产物在细胞中过表达。分析使用DSA-FACE进行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"和"M9"是指与基本N-乙酰葡糖胺结构结合的甘露糖残基数。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过聚丙烯酰胺凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。[0075]图14是一系列描述对获得自指明的野生型MTLY60细胞或糖基化突变细胞的多种克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。"alg3"表明所述细胞是ALG3敲除型。"ALG6过表达"表明所述ALG6的蛋白质产物在细胞中过表达。一个峰与RNA酶B标志物的]\&111561〇嫩(32运行在相同位置，并且在α-1，2-甘露糖苷酶处理之后迀移了两个葡萄糖单位，并在α-甘露糖苷酶（JB)消化之后迀移4个葡萄糖单位。这与预期的Man5GlcNAc2g构相符。额外的两个峰在约一个和两个糖单位的距离运行，并且不受a_l，2-甘露糖苷酶消化的影响。在a-甘露糖苷酶（JB)消化时两个峰都迀移一个葡萄糖单位。小迀移是因为加入的酶（例如JB甘露糖苷酶）的较高的盐浓度。分析使用DSA-FACE进行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"和"M9"是指与壳二糖核心结构结合的甘露糖残基数。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。[0076]图15是对获得自未折叠蛋白质应答（UPR)诱导的菌株解脂西洋蓍霉的分离的DNA片段（SEQIDΝΟ:1)序列与基因组HAC1DNA序列（SEQIDNO:5)的序列比对。带框的序列对应于非常规剪接的内含子。[0077]图16是一系列对巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母的预测的5'（顶部）和3'（底部）剪接位点的序列比对。粗体加下划线的核苷酸存在于环结构中。[0078]图17A和17B是对获得自DTT-诱导型（I)(SEQIDNO:2)和非诱导型（NI)(SEQIDNO:6)巴斯德毕赤酵母培养物的HAClcDNA的序列比对的两个部分视图。[0079]图18是对巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母18个氨基酸的C-末端区域的序列比对。保守的氨基酸为粗体并加下划线。[0080]图19是描述对KAR2mRNA的相对表达水平进行比较的柱状图。将克隆3、4和5(巴斯德毕赤酵母GSM5细胞）在作为碳源的甲醇上培养。"3+"、"4+"和"5+"是指在作为碳源的甲醇上培养的各个克隆，而"3-"、"4_"和"5-"是指在作为碳源的葡萄糖上培养的各个克隆。Y轴代表使用实时PCR的KAR2基因的相对表达。[0081]图20是描述两种巴斯德毕赤酵母克隆（克隆6和8)中Kar2和HACl的相对表达水平的柱状图。"6+"和"8+"是指在作为碳源的甲醇上培养的各个克隆，而"6_"和"8-"是指在作为碳源的葡萄糖上培养的各个克隆。Y轴代表使用实时PCR的KAR2基因的相对表达。[0082]图21是描述用于ΠΜΝΝ6表达载体的克隆策略的示意图。[0083]图22是一系列描述对获得自指明的单独的Aochl解脂西洋蓍霉细胞，或表达ΠΜΝΝ6的Aochl解脂西洋蓍霉的多种克隆（23、24、25、耶、服和现）的糖蛋白进行的^聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。[0084]图23是描述用于MFManHDEL表达载体的克隆策略的示意图。[0085]图24是一系列描述对获得自指明的单独的Aochl解脂西洋蓍霉细胞，或表达MFManHDEL的Aochl解脂西洋蓍霉的多种克隆（9、11、10、3、5和6)的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。[0086]图25是描述用于LIP2preManHDEL表达载体的克隆策略的示意图。[0087]图26是一系列描述对获得自指明的单独的Aochl解脂西洋蓍霉细胞，或表达LIP2ManHDEL的Λochl解脂西洋蓍霉的多种克隆（l、5、10和ll)的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。15"，16"，17"，18"和19"是指与壳二糖核心结构结合的甘露糖残基数。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。[0088]图27A和27B是解脂西洋蓍霉（图27A;SEQIDN0:3)和巴斯德毕赤酵母（图27B;SEQIDNO:4)的HACl蛋白的氨基酸序列。[0089]图28是考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶的照片，其描述在多种解脂西洋蓍霉细胞（MTLY60、MTLY60Δalg3和MTLY60Δalg3ALG6)培养物中Lip2p过表达的结果。在凝胶中解析了以下样品：泳道1("梯子"或"梯")，已知分子量的蛋白质的组合；泳道2("WT")，获得自过表达Lip2p的WT解脂西洋蓍霉细胞（MTLY60)的Lip2p蛋白；泳道3("WT+PGaseF"），获得自过表达Lip2p的WT解脂西洋蓍霉细胞并用PNGaseF酶处理的Lip2p蛋白；泳道4("alg3-ALG6"），获得自缺乏alg3并且过表达Lip2p和ALG6二者的西洋蓍霉细胞(MTLY60Δalg3ALG6)的Lip2p蛋白；泳道5("alg3-ALG6+PNGaseF"），获得自缺乏alg3并且过表达Lip2p和ALG6二者的西洋蓍霉细胞（MTLY60Δalg3ALG6)并且用PNGaseF酶处理的Lip2p蛋白；泳道6("alg3")，获得自缺乏alg3并且过表达Lip2p的解脂西洋蓍霉细胞（MTLY60Aalg3)的Lip2p蛋白；泳道7("alg3+PNGaseF")，获得自缺乏alg3并且过表达Lip2p的解脂西洋蓍霉细胞（MTLY60Aalg3)并用PNGaseF酶处理的Lip2p蛋白；泳道8("无Lip2p过表达的WT"），获得自MTLY60细胞的蛋白质；和泳道9("无Lip2p过表达的WT+PNGaseF"），获得自MTLY60细胞并用PNGaseF酶处理的蛋白质。[0090]图29是一系列描述对获得自指明的多种解脂西洋蓍霉细胞（WT(MTLY60);Λalg3;AalgSALGe过表达的；和过表达ALG6连同来自解脂西洋蓍霉（Yl)或布氏锥虫(Tb)的葡糖苷酶II的α亚基的Aalg3克隆）的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。15"，16"，17"，18"和19"是指与壳二糖核心结构结合的甘露糖残基数。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。底部的电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0091]图30是一系列描述对获得自指明的多种解脂西洋蓍霉细胞（Aalg3;Aalg3ALG6过表达的；和过表达ALG6连同含有HDEL序列的来自解脂西洋蓍霉（Yl)的葡糖苷酶II的α亚基的Λalg3克隆）的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。[0092]图31是一系列描述对获得自指明的多种解脂西洋蓍霉细胞（Aalg3;Aalg3ALG6过表达的；和过表达ALG6连同含有HDEL序列的来自布氏锥虫（Trypanosomabrucei)(Tb)的葡糖苷酶II的α亚基的Aalg3克隆）的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。[0093]图32是一系列描述对获得自指明的用不同浓度变聚糖酶体外处理的alg3ALG6解脂西洋蓍霉细胞的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。底部的电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0094]图33是一系列描述对获得自指明的多种解脂西洋蓍霉细胞（Aalg3;Aalg3ALG6过表达的；和过表达ALG6连同在Hp4d或TEF启动子调控下表达的来自解脂西洋蓍霉(Y.1.)的葡糖苷酶Π的α亚基和来自Y.1的葡糖苷酶II的β亚基的Λalg3克隆）的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。底部的电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0095]图34是一系列描述对获得自指明的多种解脂西洋蓍霉细胞（Λalg3ALG6过表达的；和过表达ALG6连同在Hp4d或TEF启动子调控下表达的含HDEL的来自解脂西洋蓍霉(Y.1.)的葡糖苷酶Π的α亚基和来自Y.1的葡糖苷酶II的β亚基的Λalg3克隆）的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。分析使用DSA-FACE进行。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。底部的电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0096]图35是一系列描述对获得自指明的多种解脂西洋蓍霉细胞（Λalg3和过表达在TEF启动子调控下表达的来自解脂西洋蓍霉（Y.1.)的葡糖苷酶II的α亚基和来自Y.1的葡糖苷酶II的β亚基的Aalg3克隆）的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。底部的电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0097]图36A和36B描述的是编码黑曲霉（Aspergillusniger)葡糖苷酶IIΦ成熟形式（缺少信号肽）的cDNA的核苷酸序列，其是为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化的cDNA(SEQIDN0:7)。[0098]图37是描述编码黑曲霉（Aspergillusniger)葡糖苷酶IIβ成熟形式（缺少信号肽）的cDNA的核苷酸序列，其是为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化的cDNA(SEQIDNO:8)〇[0099]图38是一系列对获得自指明的多种解脂西洋蓍霉细胞（Aalg3和ALG6过表达的，连同在TEF或hp4d启动子调控下表达的来自黑曲霉（An)的葡糖苷酶II的α亚基）的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。底部的电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0100]图39Α和39Β是一对柱状图，其描述在WT(MTLY60)解脂西洋蓍霉细胞中或在含有在hp4d启动子表达调控下的HAClcDNA的经剪接形式的解脂西洋蓍霉细胞的两个克隆（克隆7和克隆2)中，HACl(39A)或KAR(39B)基因的相对表达水平（Y轴）。[0101]图40是线型图，其描述用空载体转化的野生型巴斯德毕赤酵母GSl15细胞与表达Haclp蛋白的巴斯德毕赤酵母GS115细胞的生长相比的生长。[0102]图41是考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶的照片，其比较了来自表达鼠类IL-10(mIL-10)蛋白的巴斯德毕赤酵母GSl15细胞细胞培养物的mIL-10蛋白的表达水平与获得自在诱导型启动子AOXl调控下表达mIL-10和来自巴斯德毕赤酵母的经剪接HACl蛋白的GS115细胞的培养物的mIL-10蛋白的表达。在凝胶中解析了以下样品：泳道1("梯子"），已知分子量的蛋白质的组合；泳道2("参照"），获得自表达参照mIL-10的巴斯德毕赤酵母菌株（GS115)的蛋白质；泳道3("参照")，获得自表达参照mIL-10的巴斯德毕赤酵母菌株的、在用PNGaseF酶处理蛋白质之后的蛋白质；泳道4("克隆1")，获得自诱导型表达HACl蛋白的表达mIL-10的巴斯德毕赤酵母细胞的蛋白质；泳道5("克隆1")，获得自诱导型表达HACl蛋白的表达mIL-10的巴斯德毕赤酵母细胞的、在用PNGaseF酶处理蛋白质之后的蛋白质；泳道6("克隆2"），获得自诱导型表达HACl蛋白1的表达mIL-10的巴斯德毕赤酵母细胞的蛋白质；泳道7("克隆2")，获得自诱导型表达HACl蛋白的表达mIL-10的巴斯德毕赤酵母细胞的、在用PNGaseF酶处理蛋白质之后的蛋白质。[0103]图42描述的是编码里氏木霉（Trichodermareesei)α-1，2甘露糖苷酶、为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化、含有LIP2前信号序列的示例性cDNA序列的核苷酸序列（SEQIDΝ0:9)。[0104]图43描述的是用于解脂西洋蓍霉的GAP启动子的示例性核苷酸序列的核苷酸序列（SEQIDN0:10)。[0105]图44A-44C描述的是用于表达载体pYLHUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDN0:11)，其含有编码里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶的、为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化并且含有LIP2前信号序列的cDNA序列。[0106]图45A-45C描述的是用于表达载体pYLGUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDN0:12)，其含有编码里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶的、为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化并且含有LIP2前信号序列的cDNA序列。[0107]图46A-46C描述的是用于表达载体pYLPUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDN0:13)，其含有编码里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶的、为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化并且含有LIP2前信号序列的cDNA序列。[0108]图47A-47C描述的是用于表达载体pYLTUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDN0:14)，其含有编码里氏木霉α-1，2甘露糖苷酶的、为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化并且含有LIP2前信号序列的cDNA序列。[0109]图48是一系列对获得自用指明的不同表达载体转化的解脂西洋蓍霉细胞的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱："hp4dL2ManHDEL"(pYLHUXdL2preManHDEL，图44A-44C);"GAPL2ManHDEL"（pYLGUXdL2preManHDEL，图45A-45C);"TEFlL2ManHDEL"（pYLTUXdL2preManHDEL，图47A-47C)。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的葡聚糖(dextran)的分析。系列中第二个电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0110]图49是一系列对获得自含有稳定整合的表达载体pYLTUXdL2preManHDEL(图47A-47C)的解脂西洋蓍霉MTLY60△ochl细胞的糖蛋白进行的N-聚糖分析的电泳图谱。糖蛋白样品获得自24、48、72和96小时的细胞培养物。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的葡聚糖（dextran)的分析。系列中第二个电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0111]图50是用于人葡糖脑苷酯酶的示例性核酸序列（GLCM，SwissProt条目号：P04062;SEQIDNO:15)，其是按照为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化的cDNA以化学方法合成的。[0112]图51是免疫印迹的照片，其描述了在解脂西洋蓍霉菌株MTLY60(WT;泳道4和6)和MTLY60A〇chl(A〇chl;前三个泳道）中表达的人葡糖脑苷酯酶的迀移图。蛋白质的分子量（kDa)通过在所述免疫印迹最右侧的分子量标志物来说明。[0113]图52是人促红细胞生成素的示例性核酸序列（Epo,SwissProt条目号：P01588;SEQIDNO:16)，其是按照为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化的cDNA以化学方法合成的。[0114]图53是人α-半乳糖苷酶A的示例性核酸序列（AGAL，SwissProt条目号：P06280;SEQIDNO:17)，其是按照为了在解脂西洋蓍霉中表达而经密码子优化的cDNA以化学方法合成的。[0115]图54是一系列过表达Haclp蛋白的经剪接形式的巴斯德毕赤酵母细胞或野生型巴斯德毕赤酵母细胞的电子显微照片。将细胞中堆叠的脂质膜的离散区加框。[0116]图55是一系列电泳图谱，其描述对获得自指明的WT解脂西洋蓍霉细胞（polld)和表达α-1，2-甘露糖苷酶和HDEL序列的融合蛋白的解脂西洋蓍霉细胞的糖蛋白进行的N-聚糖分析。分析使用DSA-FACE进行。"Μ5"，"Μ6"，"Μ7"，"Μ8"和"Μ9"是指与壳二糖核心结构结合的甘露糖残基数。Y轴代表相对荧光单位，表明各个甘露糖结构的量。X轴代表各个复合甘露糖结构通过凝胶的相对迀移率。顶部的电泳图谱是对用作迀移率标准品的寡麦芽糖的分析。底部的电泳图谱是对RNA酶B的分析。[0117][0118]本文描述的方法和遗传工程化的细胞可以用于产生如下目标分子（例如，目标蛋白或目标多萜醇），其与在未经遗传工程化的细胞中产生的所述目标分子的N-糖基化形式相比具有改变的N-糖基化形式。已经证明糖基化目标分子（例如，糖基化蛋白）向患有代谢紊乱（例如，溶酶体贮积病）患者的施用使所述病症的症状改善。因此，所述的方法和细胞可用于制备N-糖基化改变的目标分子，其用于包括但不限于治疗代谢紊乱如溶酶体贮积病。这样的N-糖基化改变的分子也可用于广泛多样的其它领域，例如，食品和饮料工业；药物工业（例如，作为疫苗）；农业工业；和化学工业，等等。[0119]N-糖基化改夺的分子[0120]如用于本文，目标分子是指通过来自遗传工程化的细胞（例如，真菌细胞如解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans(或其它相关种类的双态性酵母）细胞；植物细胞；或动物细胞）的一种或多种N-糖基化活性而经受改变的N-糖基化的任何分子。在一些实施方案中，目标分子能够被运输经过解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans(或其它相关种类的双态性酵母）分泌途径中的一步或多步，导致它们的N-糖基化因宿主细胞机构(machinery)而改变。所述目标分子可以是内源或外源的。[0121]目标蛋白、它们的生物学活性片段或其生物学活性变体可以包括如上所述含有添加、缺失或取代的蛋白质。合适的目标蛋白包括病原体蛋白（例如，破伤风类毒素；白喉(diphtheria)类毒素；病毒表面蛋白（例如，巨细胞病毒（CMV)糖蛋白B、H和gCIII;人免疫缺陷病毒I(HIV-I)包膜糖蛋白；劳斯肉瘤病毒（RSV)包膜糖蛋白；单纯疱瘆病毒（HSV)包膜糖蛋白；EB病毒（EBV)包膜糖蛋白；水痘带状疱瘆病毒（VZV)包膜糖蛋白；人乳头状瘤病毒（HPV)包膜糖蛋白；流感病毒糖蛋白；和肝炎家族表面抗原），溶酶体蛋白（例如，葡糖脑苷酯酶、脑苷酶或半乳糖脑苷酯酶），胰岛素，胰高血糖素，生长因子，细胞因子，趋化因子，抗体及其片段，或所述蛋白质中任一与抗体或抗体片段的融合物（例如，蛋白质-Fc)。生长因子包括，例如，血管内皮生长因子（VEGF)、胰岛素样生长因子（IGF)、骨形态发生蛋白（BMP)、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、神经生长因子（NGF);神经营养蛋白、血小板衍生生长因子（PDGF)、促红细胞生成素（EPO)、血小板生成素（TPO)、Myostatin(⑶F-8)、生长分化因子-9(⑶F9)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF或FGF2)、表皮生长因子（EGF)、肝细胞生长因子（HGF)。细胞因子包括，例如，白介素（例如，IL-I至IL-33(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13或IL-15))。趋化因子包括，例如，1-309、TCA-3、MCP-1、MIP-Iα、MIP-Iβ、RANTES、C10、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-1γ、Eotaxin、MCP-5、MCP-4、NCC-1、Ckβ10、HCC-1、白细胞诱素-I(Leukotactin-I)、LEC、NCC-4、TARC、PARC或Eotaxin-2。还包括肿瘤糖蛋白（例如，肿瘤相关抗原），例如，癌胚抗原（CEA)、人粘蛋白、HER-2/neu和前列腺特异性抗原（PSA)[R.A.Henderson和O.J.Finn,AdvancesinImmunology,62,第217-56页（1996)]。在一些实施方案中，目标蛋白可以是与溶酶体贮积病相关的目标蛋白，所述目标蛋白包括，例如，α-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、a-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明质酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。[0122]目标蛋白也可以是融合蛋白。融合蛋白包括，例如，（i)本文描述的任何蛋白或其片段与（ii)抗体或其片段的融合物。如用于本文，术语"抗体片段"是指抗原结合片段，例如，Fab、F(ab'）2、Fv和单链Fv(scFv)片段。scFv片段是单一多肽链，其包括所述scFv所源自的抗体的重链和轻链可变区二者。此外，双抗体[Poljak(1994)Structure2(12):1121-1123;Hudson等（1999)J.Immunol.Methods23(1-2):177-189,将这两篇的内容通过所述整体并入本文]和细胞内抗体[Huston等（2001)Hum.Antibodies10(3-4):127-142;Wheeler等（2003)Μ01·Ther.8(3):355-366;Stocks(2004)DrugDiscov.Today9(22):960-966,将全部这些的内容通过所述整体并入本文]也可以在本发明的方法中使用。[0123]目标蛋白也可以与聚合物、载体、佐剂、免疫毒素或可检测的（例如，荧光、发光或放射性）模块中的一种或多种结合。例如，可以将目标蛋白与聚乙二醇结合，所述聚合物模块可以用于例如增加小蛋白质的分子量和/或增加循环滞留期。[0124]在一些实施方案中，目标分子可以是或可以含有多萜醇。[0125]遗传工稈化的细朐[0126]本文描述的遗传工程化的细胞具有至少一种经修饰的N-糖基化活性，所述细胞可用于一种或多种具有改变的N-糖基化形式的目标分子的产生。适合于遗传工程化的细胞包括，例如，真菌细胞（例如，解脂西洋蓍霉或本文所述的任何其它相关的双态性酵母细胞），植物细胞或动物细胞（例如，（线虫、昆虫、植物、鸟、爬行动物、或哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、沙鼠、犬、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴或人））。所述细胞可以是原代细胞、无限增殖化细胞或经转化的细胞。所述细胞可以是动物中，例如非人哺乳动物中的那些细胞。这些细胞，在进行本文指定的遗传工程化之前，可以获得自多种商业来源和研宄资源机构，如，例如，美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection)(R〇ckVille，MD)。目标分子包括蛋白质，例如任何本文所述的目标蛋白（见上文）。目标分子也包括多猫醇。[0127]对细胞进行的遗传工程化包括遗传修饰如：（i)缺失编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源基因；（ii)引入编码具有N-糖基化活性的蛋白质（例如，内源或外源蛋白）的突变形式的重组核酸（即，表达具有N-糖基化活性的突变蛋白）引入或表达RNA分子，所述RNA分子干扰具有N-糖基化活性的蛋白质的功能性表达；（iv)引入编码具有N-糖基化活性的蛋白质的野生型（例如，内源的或外源的）的重组核酸（即，表达具有N-糖基化活性的蛋白质）；或（V)改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的一种或多种内源基因的启动子或增强子元件，由此改变它们编码的蛋白质的表达。RNA分子包括，例如，小干扰RNA、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA或微小RNA(miRNA)。应该理解的是，第（ii)项包括，例如，用相对于如下被替代的内源基因编码具有更大N-糖基化活性的蛋白质的基因替代内源基因（例如，通过同源重组）。遗传工程化还包括改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源基因以产生具有添加（例如，异源序列）、缺失或取代（例如，突变如点突变；保守或非保守突变）的蛋白质。突变可以特异性地引入（例如，定点诱变或同源重组；参加随附实施例）或者可以随机引入（例如，可以对细胞进行化学诱变，如在例如Newman和Ferr〇-Novick(1987)J.CellBiol.105(4):1587中所述，将其公开内容通过所述整体并入本文）。[0128]本文描述的遗传修饰可以导致如下的一种或多种：（i)在经遗传修饰的细胞中一种或多种N-糖基化活性的增加，（ii)在经遗传修饰的细胞中一种或多种N-糖基化活性的减少，（iii)在经遗传修饰的细胞中一种或多种N-糖基化活性的定位或胞内分布的变化，或（iv)在经遗传修饰的细胞中一种或多种N-糖基化活性的比例的变化。应该理解的是，N-糖基化活性的量的增加可以归因于一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质的过表达；内源基因的拷贝数的增加（例如，基因重复）；或内源基因的启动子或增强子的改变，其刺激由所述基因编码的蛋白质的表达增加。一种或多种N-糖基化活性的减少可以归因于一种或多种蛋白质的突变形式（例如，显性阴性形式）的过表达，所述突变形式具有改变N-糖基化的活性；一种或多种干扰RNA分子的引入或表达，所述干扰RNA分子降低一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质的表达；或一种或多种编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源基因的缺失。[0129]缺失或破坏一种或多种内源基因的方法在随附实施例中描述。例如，为了通过同源重组破坏基因，"基因替代"载体可以以一种使其包括可选择的标记基因的方式构建。这些可选择的标记基因可以在5'和3'端与长度足以介导同源重组的基因部分可操作地连接。所述可选择的标记可以是多种基因之一，所述基因或者补足宿主细胞的营养缺陷型(auxotrophy)，或者提供抗生素抗性，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合适的可选择标记包括CAT基因，其赋予酵母细胞氯霉素抗性，或IacZ基因，其导致因表达β-半乳糖苷酶产生的蓝色菌落。然后使用本领域公知的方法（见下文）将基因替代载体的线性化DNA片段引入细胞。线性片段向基因组中的整合和基因的破坏可以基于所述选择标记来测定，并且可以通过例如Southern印迹分析来验证。[0130]如在随附实施例中详述的，在可选择的标记在选择中使用之后，可以将其从宿主细胞的基因组去除，通过例如Cre-IoxP系统（见下文）。[0131]或者，基因替代载体可以以一种使其包括待破坏基因的部分的方式构建，所述部分缺乏任何内源基因启动子序列并且什么也不编码或编码所述基因编码序列的失活片段。"失活片段"是这样的基因片段，其编码的蛋白质具有，例如，产自所述基因全长编码序列的蛋白质的活性的低于约10%(例如，低于约9%，低于约8%，低于约7%，低于约6%，低于约5%，低于约4%，低于约3%，低于约2%，低于约1%，或0%)。将这种基因部分以如下方式插入载体，即没有已知启动子序列与该基因序列可操作连接，但是终止密码子和转录终止序列与所述基因序列的所述部分可操作地连接。然后可以将这种载体在所述基因序列的所述部分中线性化并且转化入细胞中。通过单同源重组的方式，于是将这种线性化的载体整合入所述基因的内源对应物（counterpart)中。[0132]表达载体可以是自主性的或整合型的。[0133]可以将重组核酸（例如，编码具有N-糖基化活性的蛋白质的野生型或突变形式的重组核酸）以表达载体的形式引入细胞，所述表达载体例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒或病毒颗粒。重组核酸可以保持在染色体外，或者它可以被整合入酵母细胞染色体DNA。表达载体可以含有选择标记基因，其编码细胞在选择条件下生存所需的蛋白质（例如，URA3，其编码尿嘧啶生物合成所需要的酶；或TRP1，其编码色氨酸生物合成所需要的酶），以允许检测和/或选择那些用期望的核酸转化的细胞（参见，例如，美国专利No.4,704,362)。表达载体也可以包括自主复制序列（ARS)。例如，美国专利No.4,837,148描述了自主复制序列，其为在巴斯德毕赤酵母中保持质粒提供了适合的方法。将美国专利No.4,837,148的公开内容通过所述整体并入本文。[0134]整合型载体在例如美国专利No.4,882,279(将其公开内容通过所述整体并入本文）中披露。整合型载体通常包括连续排列的至少有第一可插入DNA片段、可选择的标记基因和第二可插入DNA片段的序列。所述第一和第二可插入DNA片段的长度各为约200个(例如，约250,约300,约350,约400,约450,约500或约1000或更长）核苷酸并且具有与待转化物种基因组DNA中的部分同源的核苷酸序列。将用于表达的含有感兴趣的基因（例如，编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因）的核苷酸序列插入这种载体的第一和第二可插入DNA片段之间，在标记基因之前或是之后。可以在酵母转化之前将整合型载体线性化以促进感兴趣的核苷酸序列整合入宿主细胞基因组。[0135]表达载体可以包含（feature)在酵母（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans，或其它相关的双态性酵母种）启动子调控下的重组核酸，所述启动子使得它们能够在酵母中表达。合适的酵母启动子包括例如，ADC1、TPI1、ADH2、hp4d、POX和GallO(参见，例如，Guarente等（1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(23):7410)启动子。另外的合适启动子在例如Zhu和Zhang(1999)Bioinformatics15(7-8):608-611和美国专利No.6,265,185中记载，将它们每一篇的公开内容通过所述整体并入本文。在将表达载体引入动物细胞（例如哺乳动物细胞）的情况下，所述表达载体可以包含在适合用于在感兴趣的宿主细胞中表达的动物细胞启动子调控下的重组核酸。哺乳动物启动子的实例包括，例如，SV40或巨细胞病毒（CMV)启动子。[0136]启动子可以是组成型或诱导型（条件性）的。组成型启动子应理解为这样的启动子，其表达在标准培养条件下是恒定的。诱导型启动子是响应于一种或多种诱导信号(inductioncue)的启动子。例如，可以对诱导型启动子进行化学调节（例如，其转录活性受到化学诱导剂的存在或缺失调节的启动子，所述化学诱导剂例如醇、四环素、类固醇、金属或其它小分子）或物理调节（例如，其转录活性受到物理诱导物的存在或缺失调节的启动子，所述物理诱导物例如光或高温或低温）。诱导型启动子也可以直接通过一种或多种转录因子调节，所述转录因子本身直接受到化学或物理信号的调节。[0137]细胞的遗传工程化还包括激活存在于宿主细胞中，但是通常在所述细胞中不表达或在所述细胞中不以显著水平表达的内源基因（例如，编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因）。例如，可以修饰内源基因的调节序列（例如，基因启动子或增强子）从而使可操作连接的编码序列展现增加的表达。同源重组和靶向可以用于使用如下调节序列替代通常与该基因结合的调节序列或使其失效，所述调节序列引起待表达基因以高于在相应的未经遗传工程化的细胞中所显现的水平表达，或引起所述基因展现不同于在相应的未经遗传工程化的细胞中所显现的调节或诱导模式。用于引入基因的调节序列（例如，启动子或增强子）的改变的合适方法记载着，例如，美国专利申请公开No.20030147868中，将其公开内容通过所述整体并入本文。[0138]应理解的是，其它遗传工程化的修饰也可以是条件性的。例如，可以将基因条件性地缺失，使用例如位点特异性DNA重组酶如Cre-IoxP系统（参见，例如，Gossen等（2002)Ann.Rev.Genetics36:153-173和美国申请No.20060014264,将它们每一篇的公开内容通过所述完整并入本文）。[0139]可以使用多种方法将重组核酸引入本文所述的细胞，所述方法例如原生质球技术或全细胞氯化锂酵母转化方法。其它对于将质粒或线性核酸载体转化入细胞有用的方法记载在，例如，美国专利No.4,929,555;Hinnen等（1978)Proc.Nat.Acad.Sci.USA75:1929;Ito等（1983)J.Bacteriol.153:163;美国专利No.4,879,231;和Sreekrishna等（1987)Gene59:115中，将它们每一篇的公开内容通过所述完整并入本文。电穿孔和PEG1000全细胞转化方法也可以使用，如Cregg和Russel,MethodsinMolecularBiology:PichiaProtocols，Chapter3，HumanaPress，Totowa，N.J·，第27-39页（1998)中所述，将其公开内容通过所述完整并入本文。动物细胞的转染可以包括，例如，使用磷酸钙、电穿孔、热激、脂质体或转染试剂如FUGENE?或LIPOFECTAMINE?或通过使裸核酸载体与细胞在溶液中接触（参见，例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManualSecondEditionvol.I,2and3.ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork,USA,Nov.1989;将其公开内容通过所述完整并入本文）将载体引入细胞。[0140]可以通过使用合适的技术来选择经转化的酵母细胞，所述技术包括但不限于，在转化之后在缺乏所需生化产物（由于细胞的营养缺陷型）条件下培养营养缺陷型细胞，选择和检测新的表型，或在对于缺乏转化体中所含抗性基因的酵母为毒性的抗生素存在下进行培养。转化体也可以通过将表达盒整合入基因组来选择和/或验证，其可以通过例如Southern印迹或PCR分析来评定。[0141]在将载体引入感兴趣的靶细胞之前，可以将载体在细菌细胞如大肠杆菌（E.coli)中培养（例如，扩增）。载体DNA可以通过任何本领域已知的方法从细菌细胞分离，所述方法致使载体DNA从细菌环境中纯化。经纯化的载体DNA可以用酚、氯仿和醚粗提（extractextensively)，以确保没有大肠杆菌蛋白存在于质粒DNA制备物中，因为这些蛋白质对于哺乳动物细胞是毒性的。[0142]如本文所述，遗传工程化可以用于表达（例如，过表达）多种基因、向多种基因中引入修饰或缺失多种基因，例如，编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因。这些基因包括，例如，ALG7、ALG13、ALG14、ALG1、ALG2、ALG11、RFT1、ALG3、ALG9、ALG12、ALG6、ALG8、ANLl、ALG10、ALG5、0ST3、0ST4、0ST6、STT3、OSTl、0ST5、WBPl、SWPl、0ST2、DPMI、SEC59、OCHl、MNN9、VANl、MNN8、MNN10、MNNll、HOCl、MNN2、MNN5、MNN6、KTRl、YURl、MNN4、KRE2、KTR2、KTR3、MNN1、MNS1、MNN4、PN01、MNN9、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、或内切甘露糖苷酶（endomannosidase)。编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因可以来自任何含有这样的基因的物种（例如，低等真核生物（例如，真菌（包括酵母）或锥虫），植物，或动物（例如，昆虫、鸟、爬行动物或哺乳动物（例如，啮齿动物如小鼠或大鼠、犬、猫、马、山羊、牛、猪、非人灵长类动物或人））。编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因可以从中获得的示例性真菌菌种包括，但不限于，异常毕赤酵母（Pichiaanomala)、牛肠毕赤酵母（Pichiabovis)、加拿大毕赤酵母（Pichiacanadensis)、Pichiacarsonii、粉状毕赤酵母（Pichiafarinose)、发酵毕赤酵母（Pichiafermentans)、泌液毕赤酵母(Pichiafluxuum)、膜醭毕赤酵母（Pichiamembranaefaciens)、膜醭毕赤酵母（Pichiamembranaefaciens)、粗壮念珠菌(Candidavalida)、白念珠菌(Candidaalbicans)、Candidaascalaphidarum、Candidaamphixiae、南极念珠菌（CandidaAntarctica)、大西洋念珠菌（Candidaatlantica)、Candidaatmosphaerica、Candidablattae、Candidacarpophila、Candidacerambycidarum、Candidachauliodes、Candidacorydalis、Candidadosseyi、都柏林念珠菌（Candidadubliniensis)'Candidaergatensis>Candidafructus、光滑念珠菌（Candidaglabrata)、发酵念珠菌（Candidafermentati)、季也蒙念珠菌（Candidaguilliermondii)、希木隆念珠菌（Candidahaemulonii)、Candidainsectamens、昆虫念珠菌（Candidainsectorum)、间型念珠菌（Candidaintermedia)、Candidajeffresii、乳酒念珠菌（Candidakefyr)、克鲁斯念珠菌（Candidakrusei)、葡萄牙念珠菌（Candidalusitaniae)、Candidalyxosophila、Candidamaltosa、酉業膜念珠菌（Candidamembranifaciens)、Candidamilleri、Candidaoleophila、奥里戈念珠菌（Candidaoregonensis)、近平滑念珠菌（Candidaparapsilosis)、桔念珠菌（Candidaquercitrusa)、休哈塔念珠菌（Candidashehatea)、Candidatemnochilae、纤细念珠菌(Candidatenuis)、热带念珠菌（Candidatropicalis)、Candidatsuchiyae、Candidasinolaborantium、酱油念珠菌（Candidasojae)、会隹国（Candidaviswanathii)、产朊念珠菌（Candidautilis)、膜醭毕赤酵母、（Pichiasilvestris)、膜醭毕赤酵母、Pichiachodati、膜醭毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、Pichiaminuscule、巴斯德毕赤酵母、假多形毕赤酵母（Pichiapseudopolymorpha)、栎毕赤酵母（Pichiaquercuum)、Pichiarobertsii、斋藤毕赤酵母（Pichiasaitoi)、Pichiasilvestrisi、斯地毕赤酵母（Pichiastrasburgensis)、陆生毕赤酵母（Pichiaterricola)、Pichiavanriji、PseudozymaAntarctica、红冬抱酵母（Rhodosporidiumtoruloides)、红酵母（Rhodotorulaglutinis)、贝酵母（Saccharomycesbayanus)、贝酵母、Saccharomycesmomdshuricus、葡萄汁酵母（Saccharomycesuvarum)、贝酵母、酿酒酵母、二抱酵母（Saccharomycesbisporus)、薛瓦酵母（Saccharomyceschevalieri)、德尔布酵母（Saccharomycesdelbrueckii)、少抱酵母（Saccharomycesexiguous)、发酵性酵母（Saccharomycesfermentati)、脆壁酵母（Saccharomycesfragilis)、马克思酵母（Saccharomycesmarxianus)、蜂蜜酵母（Saccharomycesmellis)、罗斯酵母（Saccharomycesrosei)、鲁酵母（Saccharomycesrouxii)、葡萄汁酵母、威尔酵母（Saccharomyceswillianus)、路德酵母路德酵母、Saccharomycopsiscapsularis、扣囊复膜抱酵母（Saccharomycopsisfibuligera)、扣囊复膜抱酵母、大麦曲内抱霉（Endomyceshordei)、Endomycopsisfobuligera、Saturnisporasaitoi、八抱裂殖酵母（Schizosaccharomycesoctosporus)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、西方许旺酵母（Schwanniomycesoccidentalis)、戴尔有孢圆酵母（Torulasporadelbrueckii)、戴尔有孢圆酵母、大连酵母（Saccharomycesdairensis)、戴尔有抱圆酵母、发酵有抱圆酵母（Torulasporafermentati)、发酵性酵母、戴尔有孢圆酵母、罗斯有孢圆酵母（Torulasporarosei)、罗斯酵母（Saccharomycesrosei)、戴尔有孢圆酵母、罗斯酵母、戴尔有孢圆酵母、德尔布酵母、戴尔有抱圆酵母、德尔布酵母、Zygosaccharomycesmongolicus、（Dorulasporaglobosa)、球形德巴利酵母（Debaryomycesglobosus)、圆球拟酵母（Torulopsisglobosa)、丝抱酵母（Trichosporoncutaneum)、三角酵母（Trigonopsisvariabilis)、加利福尼亚拟威尔酵母（Williopsiscalifornica)、拟威尔酵母（Williopsissaturnus)、二抱接合酵母(Zygosaccharomycesbisporus)、二抱接合酵母、(Debaryomycesdisporua)、二抱酵母、二抱接合酵母、二抱酵母、蜂蜜接合酵母（Zygosaccharomycesmellis)、Zygosaccharomycespriorianus、(Zygosaccharomycesrouxiim)、鲁接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii)、(Zygosaccharomycesbarkeri)、鲁酵母、鲁接合酵母、大接合酵母（Zygosaccharomycesmajor)、鲁酵母、异常毕赤酵母、牛肠毕赤酵母、加拿大毕赤酵母、Pichiacarsonii、粉状毕赤酵母、发酵毕赤酵母、泌液毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、假多形毕赤酵母、栎毕赤酵母、Pichiarobertsii、PseudozymaAntarctica、红冬抱酵母、红冬抱酵母、红酵母、贝酵母、贝酵母、二孢酵母、酿酒酵母、薛瓦酵母、德尔布酵母、发酵性酵母、脆壁酵母、路德酵母、粟酒裂殖酵母、西方许旺酵母、戴尔有孢圆酵母、Torulasporaglobosa、三角酵母、力口利福尼亚拟威尔酵母、拟威尔酵母、二孢接合酵母、蜂蜜接合酵母、鲁接合酵母或任何其它本领域已知的或本文描述的真菌（例如，酵母）。示例性低等真核生物还包括曲霉属(Aspergillus)的多个种，包括但不限于，浅蓝灰曲霉（Aspergilluscaesiellus)、亮白曲霉（Aspergilluscandidus)、肉色曲霉（Aspergilluscarneus)、棒曲霉（Aspergillusclavatus)、弯头曲霉（Aspergillusdeflectus)、黄曲霉（Aspergillusflavus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、灰绿曲霉（Aspergillusglaucus)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)、黑曲霉、赫曲霉（Aspergillusochraceus)、米曲霉（Aspergillusoryzae)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、青霉状曲霉(Aspergilluspenicilloides)、局限曲霉（Aspergillusrestrictus)、酱油曲霉（Aspergillussojae)、聚多曲霉(Aspergillussydowi)、溜曲霉（Aspergillustamari)、土曲霉（Aspergillusterreus)、焦曲霉（Aspergillusustus)或杂色曲霉（Aspergillusversicolor)。编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因可以从中获得的示例性原虫属包括，但不限于，芽短膜虫属（Blastocrithidia)、短膜虫属（Crithidia)、肠锥虫属（Endotrypanum)、滴虫属（Herpetomonas)、利什曼原虫属（Leishmania)、细滴虫属（Leptomonas)、植生滴虫属（Phytomonas)、锥虫属（Trypanosoma)(例如，布氏锥虫（T.bruceii)、冈比亚锥虫(T.gambiense)、罗德西亚维虫（T.rhodesiense)和克氏维虫（T.cruzi))和Wallaceina。[0143]应该理解的是，如本文所述，遗传工程化可以用于表达（例如过表达）、引入修饰至、或缺失多种基因（例如，编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因）和/或本文所述任何基因中一种或多种（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或20种或更多种）的任意组合。[0144]在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞缺乏ALG3(Genbank?登录号：XM_503488;GenolevuresRef:YALI0E03190g)基因或其基因产物（例如，mRNA或蛋白质）。在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞表达（例如过表达）ALG6(Genbank?登录号：XM_502922,GenolevuresRef:YALI0D17028g)蛋白。在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞表达MNM基因（Genbank?登录号：XM_503217,GenolevuresRef:YALI0D24101g)。在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞缺乏OCHl和/或MNN9基因或其基因产物（例如，mRNA或蛋白质）。在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞不缺乏OCHl基因或其基因产物（例如，mRNA或蛋白质）。在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞表达葡糖苷酶II的α或β亚基（或α和β亚基二者），所述葡糖苷酶II例如解脂西洋蓍霉或布氏锥虫的葡糖苷酶II。在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞表达变聚糖酶（mutantase)，例如哈茨木霉的变聚糖酶。在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞可以具有这些修饰的任意组合。[0145]例如，在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞可以缺乏ALG3(例如，由Genbank?·登录号：XM_503488,GenolevuresRef:YALI0E03190g示例的ALG3基因）基因或其基因产物（例如，mRNA或蛋白质）；可以过表达ALG6(例如，如由Genbank?·登录号：XM_502922,GenolevuresRef:YALI0D17028g示例的ALG6)蛋白；可以过表达葡糖苷酶Π(例如解脂西洋蓍霉、布氏锥虫或任何其它本文所述的物种的葡糖苷酶II)的α和/或β亚基；可以过表达α-1,2-甘露糖苷酶；并且过表达如下中的一种或多种（和任意组合）：糖苷酶、糖基转移酶、糖-核苷酸转运蛋白、糖-核苷酸修饰酶。在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞不缺乏OCHl基因或其基因产物（例如，mRNA或蛋白质）。[0146]在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞可以含有甘露糖苷酶活性（例如，α-甘露糖苷酶活性）。所述甘露糖苷酶活性可以靶向内质网。所述甘露糖苷酶可以具有至少7.5以下的最适pH(例如，至少7.4以下，至少7.3以下，至少7.2以下，至少7.1以下，至少7.0以下，至少6.9以下，至少6.8以下，至少6.7以下，至少6.6以下，至少6.5以下，至少6.4以下，至少6.3以下，至少6.2以下，至少6.1以下，至少6.0以下，至少5.9以下，至少5.8以下，至少5.7以下，至少5.6以下，至少5.5以下，至少5.4以下，至少5.3以下，至少5.2以下，至少5.1以下，至少5.0以下，至少4.9以下，至少4.8以下或至少4.7以下）。[0147]所述甘露糖苷酶可以是丽Sl。[0148]例如，所述经遗传工程化的细胞可以过表达甘露糖苷酶（例如，α-1，2-甘露糖苷酶或任何其它本文所述的甘露糖苷酶），但是不缺乏OCHl基因或其基因产物（例如，mRNA或蛋白质）。所述甘露糖苷酶可以是所述蛋白质的野生型形式，或者可以是突变形式，例如含有甘露糖苷酶和HDELER-保留氨基酸序列的融合蛋白（参见实施例）。（应该理解可以将任何具有N-糖基化活性的蛋白质工程化改造成包含HDEL序列的融合蛋白）。[0149]在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞可以含有能够促进目标分子的改变的N-糖基化形式进行甘露糖基磷酸化的活性。例如，可以将编码促进N-聚糖进行磷酸化的活性的核酸（例如MNN4,MNN6,PN01)引入遗传工程化的细胞，所述细胞能够增加目标分子的N-糖基化的磷酸化。[0150]在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞可以含有能够去除甘露糖残基的活性（例如，甘露糖苷酶，如来自JackBean的甘露糖苷酶），所述甘露糖残基遮蔽N-糖基化改变的分子的磷酸化。[0151]在一些实施方案中，所述经遗传工程化的细胞能够从Man5GlcNAc2去除葡萄糖残基。例如，所述经遗传修饰的细胞可以过表达具有α-1，3-葡糖苷酶活性的蛋白质，例如，但不限于，变聚糖酶或葡糖苷酶II(例如解脂西洋蓍霉、布氏锥虫或本文所述的任何其它真菌菌种的葡糖苷酶II)的α和/或β亚基。[0152]在具有N-糖基化活性的蛋白质源自与表达该蛋白质的细胞不同类型（例如，不同种）的细胞的实施方案中，可以为了在特定的感兴趣的细胞中表达而对编码所述蛋白质的核酸进行密码子优化。例如，可以对来自布氏锥虫的编码具有N-糖基化的蛋白质的核酸进行密码子优化用于在酵母细胞（例如解脂西洋蓍霉）中表达。这种密码子优化可以用于增加蛋白质在感兴趣的细胞中的表达。用于对编码蛋白质的核酸进行密码子优化的方法是本领域已知的，并且记载在例如Gao等（Biotechnol.Prog.(2004)20(2):443-448)，Kotula等（Nat.Biotechn.(1991)9,1386-1389)和Bennetzen等（J.Biol.Chem.(1982)257(6):2036-3031)中。[0153]也可以对细胞进行遗传工程化以主要产生作为哺乳动物（例如，人）糖基化途径的中间体的N-聚糖。例如，可以将编码具有N-糖基化活性的人的蛋白的一种或多种核酸引入细胞。在一些实施方案中，可以将人的蛋白引入细胞，并且可以抑制（例如，缺失或突变）一种或多种具有N-糖基化活性的内源酵母蛋白。用于"人源化"真菌糖基化途径的技术记载在，例如，Choi等（2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(9):5022-5027;Verveken等（2004)Appl.Environ.Microb.70(5):2639-2646;和Gerngross(2004)NatureBiotech.22(11):1410-1414中，将它们每一篇的公开内容通过所述整体并入本文。[0154]在遗传工程化涉及例如改变蛋白质的表达或外源蛋白（包括内源蛋白的突变形式）的表达的情况下，可以使用多种技术来测定经遗传工程化的细胞是否表达该蛋白质。例如，编码所述蛋白质的mRNA或蛋白质本身的存在可以如下检测，分别使用例如Northern印迹或RT-PCR分析或Western印迹分析。具有N-糖基化活性的蛋白质的胞内定位可以通过使用多种技术来分析，所述技术包括亚细胞分级和免疫荧光。[0155]另外的遗传修饰和将它们引入本文描述的任何细胞的方法可以根据例如，美国专利Nos.7,029,872;5,272,070;和6,803,225;和美国专利申请公开Nos.20050265988、20050064539、20050170452和20040018588的公开内容修改适用，将它们每一篇的公开内容通过所述整体并入本文。[0156]尽管在双态性酵母菌种中为了实现体内产生Man5GlcNAcdPMan361〇嫩(：2而进行的工程化步骤可能与在其它酵母菌种中进行的工程化步骤不同，但是本领域技术人员将清楚在双态性酵母中体内产生经修饰的糖蛋白（具有Man5GlcNAcdPMan3GlcNAc2核心N-聚糖结构）的工程化技术可以根据常规实验法从包括但不限于美国专利No.7,326,681和美国公开Nos.20040018590、20060040353和20060286637(将它们每一篇的公开内容通过所述整体并入本文）中公开方法修改获得。由此可以将经修改的方法用于实现糖蛋白的产生，所述糖蛋白经修饰而具有人类型杂合和复合的N-聚糖。这些复合N-聚糖可以在上文指定的核心聚糖上具有2-5个以GIcNAc残基起始的分支，其可以进一步延伸，例如，用半乳糖、果糖、唾液酸残基延伸。[0157]在一些实施方案中，具有N-糖基化活性的突变蛋白或野生型蛋白可以从经遗传工程化的细胞中使用标准技术分离。例如，在所述经遗传工程化的细胞中表达突变蛋白或野生型蛋白之后，可以从该细胞本身或从培养该细胞的培养基分离所述蛋白质。分离蛋白质的方法是本领域已知的并且包括，例如，液相层析（例如，HPLC)、亲和层析（例如，金属螯合或免疫亲和层析）、离子交换层析、疏水相互作用层析、沉淀或差示溶解（differentialsolubilization)〇[0158]在一些实施方案中，可以将具有N-糖基化活性的分离的蛋白质冷冻、冻干或固定，并且储存在合适条件下，所述条件允许该蛋白质保持活性。[0159]本公开还提供本文描述的任何经遗传工程化的细胞的基本上纯的培养物。如用于本文，经遗传工程化的细胞的"基本上纯的培养物"是这样的细胞培养物，其中所述培养物中活细胞总数的低于约40%(即，低于约：35%;30%;25%;20%;15%;10%;5%;2%;1%;0.5%;0.25%;0.1%;0.01%;0.001%;0.0001%;或甚至更低）是除所述经遗传工程化的细胞之外的活细胞，例如，细菌、真菌（包括酵母）、支原体或原生动物细胞。术语"约"在本文上下文中指相关的百分比可以比指定百分比高或低所述指定百分比的15%。因此，例如，约20%可以是17%-23%。这样的经遗传工程化的细胞的培养物包括细胞和培养、储存或转运培养基。培养基可以是液体、半固体（例如，胶状培养基）或是冷冻的。培养物包括培养在液体培养基中或培养在半固体培养基中/上的细胞、或储存或转运培养基（包括冷冻储存或转运培养基）中储存或转运的细胞。培养物可以在培养容器或储存容器或基底(例如，培养皿、烧瓶或管或储存小瓶或管）中。[0160]本文描述的经遗传工程化的细胞可以如下储存，例如，作为冷冻细胞悬液，例如，在含有冷冻保护剂如甘油或蔗糖的缓冲剂中，作为冻干的细胞。或者，它们可以例如作为干燥的细胞制备物储存，通过例如流化床干燥或喷雾干燥，或任何其它合适的干燥方法。[0161]产牛N-糖基化改夺的分子的方法[0162]本文描述产生目标分子的改变的N-糖基化形式的方法。所述方法通常涉及使目标分子与来自经遗传工程化的细胞（例如，真菌细胞（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans或本文所述的任何其它相关的双态性酵母细胞）、植物细胞或动物细胞（例如，线虫、昆虫、植物、鸟、爬行动物或哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、沙鼠、犬、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴或人））的一种或多种N-糖基化活性接触。所述方法可以是基于细胞的或不基于细胞的。[0163]基于细胞的方法可以包括向经遗传工程化而具有至少一种经修饰N-糖基化活性的细胞（例如，真菌细胞（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans或本文所述的任何其它相关的双态性酵母细胞）中引入编码在该细胞中经历N-糖基化的目标分子的核酸，其中所述细胞以改变的N-糖基化形式产生所述目标分子。所述目标分子可以是，例如，蛋白质如任何本文所述的目标蛋白。在目标蛋白是脂质的实施方案中，核酸可以是编码一种或多种促进脂质合成的酶的核酸。[0164]通过对细胞进行遗传工程化来产生的修饰的类型在本文描述（参见随附实施例和上文的"遗传工程化的细胞"）。[0165]用于引入核酸的方法是本领域已知的并且记载在随附实施例和上文中。[0166]在遗传工程化的细胞中引入或表达目标分子（例如，目标蛋白）可以导致运输目标分子通过细胞的内质网和/或高尔基体，由此产生目标分子的改变的N-糖基化形式。[0167]在对目标分子进行加工之后（例如，在经遗传修饰的细胞中），目标分子（例如，目标蛋白）的改变的N-糖基化形式可以含有一种或多种N-聚糖结构。例如，目标分子的改变形式可以含有一种或多种特定的N-具体结构如Man5GlcNAc2(结构式I或VII;图4)，Man8GlcNAc2(结构式I;图4)，Man9GlcNAc2(结构式II;图4)，Man3GlcNAc2(结构式XIV;图4)，Glc1Man5GlcNAc2(结构式VIII;图4)，或Glc2Man5GlcNAc2(结构式IX;图4)("Man"是甘露糖；"Glc"是葡萄糖；而"GlcNAc"是N-乙酰葡糖胺）。[0168]产生自经遗传工程化的细胞的N-糖基化改变的目标分子可以是均质的（S卩，全部N-糖基化改变的分子含有相同的特定N-聚糖结构）或者可以是基本上均质的。"基本上均质"是指改变的目标分子是由经遗传工程化的细胞产生的改变N-糖基化的目标分子的至少约25%(例如，至少约27%，至少约30%，至少约35%，至少约40%，至少约45%，至少约50%，至少约55%，至少约60%，至少约65%，至少约70%，至少约75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%或至少约95%或至少约99%)。[0169]在经遗传工程化的细胞包括一种或多种影响N-聚糖磷酸化的N-糖基化活性的情况下，目标分子的改变的N-糖基化形式可以具有至少约25%(例如，至少约27%，至少约30%，至少约35%，至少约40%，至少约45%，至少约50%，至少约55%，至少约60%，至少约65%，至少约70%，至少约75%或至少约80%)的它的甘露糖基残基是磷酸化的。[0170]在遗传工程化的细胞的任何遗传修饰在诱导信号（例如，化学或物理信号）存在下为诱导型或条件性的情况下，可以任选地将所述遗传工程化的细胞在引入核酸之前、过程中或之后在诱导剂存在下培养。例如，在引入编码目标蛋白的核酸之后，可以将所述细胞曝露于化学诱导剂，所述化学诱导剂能够促进一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质的表达。在多种诱导信号诱导一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质条件性表达的情况下，可以使细胞与多种诱导信号接触。[0171]在通过一种或多种N-糖基化活性加工之后，将改变的目标分子分离。所述改变的目标分子可以保持在酵母细胞内或在细胞裂解时释放，或者所述改变的目标分子可以经由编码序列（外源核酸所固有的或工程化至表达载体中的）提供的机制分泌至培养基中，所述编码序列指导所述分子从细胞分泌。细胞裂解物或培养基中改变的目标分子的存在可以通过多种用于检测分子存在的标准规程来验证。例如，在改变的目标分子是蛋白质的情况下，这样的规程可以包括，但不限于，使用对于所述改变的目标蛋白（或目标蛋白本身）特异性的抗体进行的免疫印迹或放射免疫沉淀，对于所述改变的目标蛋白（或目标蛋白本身）特异性的配体进行的结合，或测试改变的目标蛋白（或目标蛋白本身）的特异性酶活性。[0172]在一些实施方案中，可以将分离的改变的目标分子冷冻、冻干或固定，并且储存在合适条件下，例如，所述条件允许改变的目标分子保持生物学活性。[0173]可以对目标分子的改变的N-糖基化形式进一步进行体内加工（例如，在经遗传工程化的细胞中），或者可以在从经遗传工程化的细胞或细胞培养基分离之后进行体外加工。进一步加工可以包括对改变的目标分子的一种或多种N-聚糖残基的修饰或对改变的目标分子的N-聚糖残基之外的修饰。改变的目标分子的额外的加工可以包括添加（共价或非共价结合）异源模块如聚合物或载体。进一步的加工也可以包括对改变的目标分子进行的酶或化学处理。酶处理可以包括使改变的目标分子与一种或多种糖苷酶（例如，甘露糖苷酶或甘露聚糖酶）、磷酸二酯酶、磷脂酶、糖基转移酶或蛋白酶接触足以诱导对所述改变的目标分子的修饰的时间。酶处理也可以包括使所述改变的目标分子与能够从1&11561(：嫩(32去除一种或多种葡萄糖残基的酶接触，所述酶例如，但不限于，甘露糖苷酶或葡糖苷酶II的α和/或β亚基。化学处理可以例如包括使改变的目标分子与酸（例如氢氟酸）接触足以诱导对所述改变的目标分子的修饰的时间。特定条件下的氢氟酸处理特异性地去除与聚糖以磷酸二酯键连接的甘露糖残基，同时在聚糖上保留磷酸。改变的目标分子可以通过从一个或多个N-聚糖添加或去除磷酸基团来进一步加工。例如，可以使改变的目标分子与甘露糖基激酶或甘露糖基磷酸酶接触。[0174]在一些实施方案中，任何文描述的改变的目标分子可以在分离之后与异源模块附接，例如，使用酶或化学方法。"异源模块"是指与改变的目标分子结合（例如，共价或非共价）的任何成分，所述成分不同于原始存在于所述改变的目标分子之上的成分。异源模块包括，例如，聚合物、载体、佐剂、免疫毒素或可检测（例如，荧光、发光或放射性）的模块在一些实施方案中，可以向改变的目标分子添加额外的N-聚糖。[0175]应该理解的是，可以，但不需要在遗传工程化的细胞中加工目标分子。例如，本公开还包括无细胞的产生具有改变的N-糖基化形式的目标分子的方法，所述方法包括使目标分子在N-糖基化条件下与制备自细胞（例如，真菌细胞（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans或本文描述的任何其它相关的双态性酵母细胞）、植物细胞或动物细胞（例如，线虫、昆虫、植物、鸟、爬行动物、或哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、沙鼠、犬、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴或人））的细胞裂解物接触的步骤，所述细胞经遗传工程化而具有至少一种经修饰的N-糖基化活性，其中使目标分子与所述细胞裂解物接触产生目标分子的改变的N-糖基化形式。[0176]"N-糖基化条件"是指将混合物（例如，目标分子和细胞裂解物的混合物）在允许改变的N-糖基化的条件下温育（如上所述）。[0177]用于获得细胞裂解物（在所述裂解物中保留一种或多种N-糖基化活性的活性或完整性）的合适方法可以包括使用合适的缓冲液和/或抑制剂，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制剂，其保护或最小化细胞裂解物中N-糖基化活性的改变。这些抑制剂包括，例如，螯合剂如乙二胺四乙酸（EDTA)、乙二醇双（P-氨基乙醚）N，N，N1，Nl-四乙酸（EGTA)，蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟化物（PMSF)、抑肽酶、亮抑肽酶、抗痛素等，和磷酸酶抑制剂如磷酸盐、氟化钠、钒酸盐等。抑制剂可以这样选择，即它们不干扰或仅最小程度负面影响N-糖基化活性或感兴趣的活性。用于获得含有酶活性的裂解物的合适的缓冲剂和条件记载在，例如，Ausubel等CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),Johnffiley&Sons,NewYork(1999);Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress(1988)；HarlowandLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1999)；TietzTextbookofClinicalChemistry,3rded.BurtisandAshwood,eds.ff.B.Saunders,Philadelphia,(1999)中。[0178]可以将细胞裂解物进一步加工以使当地消除或最小化干扰物质的存在。如有需要，可以通过多种本领域技术人员熟知的方法将细胞裂解物分级，所述方法包括亚细胞分级和层析技术，如离子交换、疏水和反向、大小排阻、亲和、疏水电荷诱导层析等（参见，例如，Scopes,ProteinPurification!PrinciplesandPractice,thirdedition,Springer-Verlag,NewYork(1993)；Burton和Harding,J.Chromatogr.A814:71-81(1998))〇[0179]在一些实施方案中，可以制备细胞裂解物，其中全部细胞器保持完整和/或有功能。例如，裂解物可以含有完整的糖面内质网、完整的光面内质网或完整的尚尔基体中的一种或多种。用于制备含有完整的细胞器的裂解物和测试细胞器的功能性的合适方法记载在，例如，Moreau等（1991)J.Biol.Chem.266(7):4329-4333;Moreau等（1991)J.Biol.Chem.266(7):4322-4328;Rexach等（1991)J.CellBiol.114(2):219-229;和Paulik等(1999)Arch.Biochem.Biophys.367(2):265-273中；将它们每一篇的公开内容通过所述整体并入本文。[0180]本公开还提供产生具有改变的N-糖基化形式的目标分子的方法，其包括使目标分子在N-糖基化条件下与一种或多种具有N-糖基化活性的分离的蛋白质接触的步骤，其中使所述目标分子与一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质接触产生目标分子的改变的N-糖基化形式，并且其中所述一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质制备自经遗传工程化而具有至少一种经修饰的N-糖基化活性的细胞（例如真菌细胞（例如，解脂西洋蓍霉、Arxulaadeninivorans或本文描述的任何其它相关的双态性酵母细胞）、植物细胞或动物细胞（例如，线虫、昆虫、植物、鸟、爬行动物、或哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、沙鼠、犬、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴或人））。[0181]可以使用如上所述的标准技术将一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质纯化。可以使目标分子与一种或多种蛋白质在合适的缓冲液中接触足以诱导对目标分子的修饰的时间，如例如，Lee和Park(2002)30(6):716-720以及Fujita和Takegawa(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.282(3):678-682中所述，将所述公开内容通过所述完整并入本文。[0182]在一些实施方案中，可以使目标分子仅与一种具有N-糖基化活性的蛋白质接触。在一些实施方案中，可以使目标分子与超过一种具有N-糖基化活性的蛋白质接触。可以使目标分子与超过一种蛋白质同时或相继接触。在将目标分子与超过一种具有N-糖基化活性的蛋白质相继接触的情况下，可以，但不需要，将目标分子在一个或多个步骤之后纯化。即，可以使目标分子与蛋白活性A接触，然后在将所述分子与蛋白活性B接触之前进行纯化j等等。[0183]在无细胞方法的一些实施方案中，在使目标分子与一种或多种N-糖基化活性接触之前将目标分子与固相支撑物连接可能是有利的。这样的连接能够使N-糖基化修饰之后的纯化更简单。合适的固相支撑物包括，但不限于，多孔测定平板、颗粒（例如，磁性或编码颗粒）、柱或膜。[0184]用于检测目标分子的N-糖基化（例如，改变的N-糖基化）的方法包括DNA测序仪辅助型（DSA)、荧光团辅助型糖电泳（FACE)(如随附实施例中所述）或表面增强型激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOFMS)。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中，例如，将糖蛋白变性，其后固定在例如膜上。然后可以将糖蛋白用合适的还原剂如二硫苏糖醇（DTT)或β-巯基乙醇还原。蛋白质的巯氢基可以使用酸如碘乙酸来羧化。然后，可以使用酶如N-糖苷酶F将N-聚糖从蛋白质释放。任选地，N-聚糖可以通过还原性氨基化重建和衍生化。然后可以将衍生化的N-聚糖浓缩。适合用于N-聚糖分析的仪器包括，例如，ABIPRISM?377DNA测序仪（AppliedBiosystems)。数据分析可以使用例如GENESCAN?3.1软件（AppliedBiosystems)进行。任选地，可以将分离的甘露糖蛋白进一步用一种或多种酶处理以确认它们的N-聚糖状态。示例性的酶包括，例如，α-甘露糖苷酶或α-1，2甘露糖苷酶，如随附实施例中所述。另外的N-聚糖分析方法包括，例如，质谱（例如，MALDI-T0F-MS)，正相、反相高压液相层析（HPLC)和离子交换层析（例如，当未标记聚糖时使用脉冲电流计检测，而如果对聚糖进行了合适的标记则使用UV吸光度或焚光）。还参见Callewaert等（2001)Glycobiology11(4):275-281和Freire等（2006)Bioconjug.Chem.17(2):559-564,将它们每一篇的公开内容通过所述整体并入本文。[0185]可由N-糖基化改夺的分子处理的病症[0186]本文描述的分离的、N-糖基化改变的分子（例如，N-糖基化改变的蛋白质或多萜醇）可以用于治疗多种疾病，所述疾病可以通过施用一种或多种N-糖基化改变的分子来治疗（例如，N-糖基化改变的蛋白质）。能够通过施用N-糖基化改变的分子（例如，改变的N-糖蛋白或改变的N-糖基化的多萜醇）治疗或预防的一些特定医学状况的实例在下节中评述。[0187](i)代谢紊乱[0188]代谢紊乱是影响个体人（或动物）细胞内能力产生的病症。大多数代谢紊乱是遗传性的，尽管一些可以因饮食、毒素、感染等而"获得"。遗传性代谢紊乱也称作代谢的先天性缺陷。概括而言，遗传性代谢紊乱是由遗传缺陷引起的，所述缺陷导致缺失或不正确地构建细胞代谢过程中的一些步骤所必须的酶。最大几类的代谢紊乱是糖代谢的紊乱、氨基酸代谢的紊乱、有机酸代谢的紊乱（有机酸尿症（organicacidurias))，脂肪酸氧化和线粒体代谢的紊乱，P卜啉代谢的紊乱，嘌呤或嘧啶代谢的紊乱，类固醇代谢的紊乱，线粒体功能的紊乱，过氧化物酶体功能的紊乱和溶酶体贮积病（LSD)。[0189]能够通过使用一种或多种本文描述的N-糖基化改变的分子（或其药物组合物）来治疗的代谢紊乱的实例包括，例如，遗传性血色病（hereditaryhemochromatosis)、眼皮肤白化病（oculocutaneousalbinism)、蛋白C(proteinCdeficiency)、I型遗传性血管性水肿（typeIhereditaryangioedema)、先天性薦糖酶-异麦芽糖酶缺乏(congenitalsucrase-isomaltasedeficiency)、克-纳二氏II型（Crigler-NajjartypeII)、Laron综合征（Laronsyndrome)、遗传性髓过氧化物酶（hereditaryMyeloperoxidase)、原发性甲状腺机能减退（primaryhypothyroidism)、先天性长QT综合征（congenitallongQTsyndrome)、酪氨酸结合球蛋白缺乏（tyroxinebindingglobulindeficiency)、家族性高胆固醇血症（familialhypercholesterolemia)、家族性乳糜微粒血症（familialchylomicronemia)、a0-脂蛋白血症（a0-lipoproteinema)、低原生质脂蛋白A水平（lowplasmalipoproteinAlevels)、伴有肝损伤的遗传性气肿（hereditaryemphysemawithliverinjury)、先天性甲状腺机能减退（congenitalhypothyroidism)、成骨不全（osteogenesisimperfecta)、遗传性血纤维蛋白原过少(hereditaryhypofibrinogenemia)、α_1抗膜凝乳蛋白酶缺乏（a-Iantichymotrypsindeficiency)、肾原性尿崩症（nephrogenicdiabetesinsipidus)、垂体神经部尿崩症(neurohypophysealdiabetesinsipidus)、腺苷脱氨酶缺乏（adenosinedeaminasedeficiency)、佩-迈二氏病（PelizaeusMerzbacherdisease)、IIA型冯维勒布兰德病(vonWillebranddiseasetypeIIA)、结合性因子V和VIII缺乏（combinedfactorsVandVIIIdeficiency)、迟发性脊椎骨飯发育不全（spondylo-epiphysealdysplasiatarda)、无脉络膜（choroideremia)、I细胞病（Icelldisease)、白顿氏病（Battendisease)、共济失调性毛细血管扩张症（ataxiatelangiectasias)、常染色体显性多囊性肾病（ADPKD-autosomaldominantpolycystickidneydisease)、微绒毛包含病(microvillusinclusiondisease)、结核性硬化（tuberoussclerosis)、Lowe眼脑肾综合征（oculocerebro-renalsyndromeofLowe)、肌萎缩性侧索硬化（amyotrophiclateralsclerosis)、骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome)、裸淋巴细胞综合征（Barelymphocytesyndrome)、丹吉尔病（Tangierdisease)、家族性肝内胆汁郁积（familialintrahepaticcholestasis)、X连锁的脑白质肾上腺萎缩症（X-linkedadreno-leukodystrophy)、Scott综合征（Scottsyndrome)、1型和2型海-普二氏综合征（Hermansky-Pudlaksyndrometypesland2)、左尔威格氏综合征（Zellwegersyndrome)、肢根点状软骨发育异常（rhizomelicchondrodysplasiapuncta)、常染色体隐性原发性高草酸尿（autosomalrecessiveprimaryhyperoxaluria)、MohrTranebjaer综合征（MohrTranebjaergsyndrome)、脊髓延髓肌萎缩（spinalandbullarmuscularatrophy)、原发性睫运动障碍（primaryciliarydiskenesia)(卡塔格内氏综合征（Kartagener'ssyndrome))、巨人症和肢端肥大症（giantismandacromegaly)、乳溢（galactorrhea)、艾迪逊氏病（Addison'sdisease)、肾上腺性男性化（adrenalvirilism)、库兴氏综合征（Cushing'ssyndrome)、酮酸中毒（ketoacidosis)、原发性或继发性酸固酮增多症（primaryorsecondaryaldosteronism)、米-迪综合征（MillerDiekersyndrome)、无脑回（Iissencephaly)、运动神经元病（motorneurondisease)、阿史尔氏综合征（Usher'ssyndrome)、威-阿二氏综合征（Wiskott-Aldrichsyndrome)、奥佩齐氏综合征（Optizsyndrome)、亨廷顿氏病（Huntington'sdisease)、遗传性胰腺炎(hereditarypancreatitis)、抗磷脂综合征（anti-phospholipidsyndrome)、重叠结缔组织病（overlapconnectivetissuedisease)、斯耶格伦氏综合征（Sj0gren'Ssyndrome)、僵体综合征（stiff-mansyndrome)、Brugada综合征（Brugadasyndrome)、芬兰型先天性肾病综合征（congenitalnephriticsyndromeoftheFinnishtype)、杜-约二氏综合征（Dubin-Johnsonsyndrome)、X连锁低磷酸盐血症（X-linkedhypophosphosphatemia)、佩德里得综合征（Pendredsyndrome)、婴儿期持续性高血胰岛素低血糖（persistenthyperinsulinemichypoglycemiaofinfancy)、遗传性球形红细胞增多症（hereditaryspherocytosis)、无血楽酮蓝蛋白血症（aceruloplasminemia)、婴儿神经元錯样脂褐质沉积症（infantileneuronalceroidlipofuscinosis)、假性软骨发育不全和多发性骨骨后发育不良（不全）（pseudoachondroplasiaandmultipleepiphyseal)、Stargardt样黄斑发育不良（Stargardt-likemaculardystrophy)、X连锁夏-马-图三氏病（X-linkedCharcot-Marie-Toothdisease)、常染色体显性视网膜色素变性（autosomaldominantretinitispigmentosa)、Wolcott-Rallison综合征（Wolcott-Rallisonsyndrome)、库兴氏病（Cushingisdisease)、月支带肌营养不良（limb-girdlemusculardystrophy)、IV型粘多糖IC积病（mucoploy-saccharidosistypeIV)、芬兰遗传性家族性淀粉样变性(hereditaryfamilialamyloidosisofFinish)、安德森氏病（Andersondisease)、肉瘤（sarcoma)、慢性髓单核细胞性白血病（chronicmyelomonocyticleukemia)、心肌病(cardiomyopathy)、面生殖发育异常（faciogenitaldysplasia)、Torsion病（Torsiondisease)、亨廷顿和脊髓小脑萎缩（Huntingtonandspinocerebellarataxias)、hereditaryhyperhomosyteinemia、多神经病（polyneuropathy)、下运动神经元病（lowermotorneurondisease)、色素性视网膜炎（pigmentedretinitis)、血清阴性多关节炎(seronegativepolyarthritis)、间质月市纤维化（interstitialpulmonaryfibrosis)、雷诺氏现象（Raynaud'sphenomenon)、韦格纳氏肉芽肿病（Wegner'sgranulomatosis)、蛋白尿（preoteinuria)、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-IcUCDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、006-1113、〇06-11(3、〇06-11(1、埃-当二氏综合征出]116^-0&111〇88711(11'〇1116)、多发性外生骨琉（multipleexostoses)、格里斯塞利氏综合征（Griscellisyndrome)(I型或2型）或X连锁性非特异性脑力发育迟缓（X-Iinkednon-specificmentalretardation)。此外，代谢紊乱还可包括溶酶体IC积病例如，但不限于，法布里氏病、法勃氏病（Farberdisease)、高歇尔氏病、GM1神经节糖苷沉积症（GM^gangliosidosis)、泰-沙二氏病、桑德霍夫氏病(Sandhoffdisease)、GM2激活病（GM2activatordisease)、克腊伯氏病（Krabbedisease)、异染性脑白质营养不良（metachromaticleukodystrophy)、尼-皮二氏病（Niemann-Pickdisease)(A、B和C型）、赫勒氏病（Hurlerdisease)、沙伊氏病（Scheiedisease)、Hunter病（Hunterdisease)、桑菲列普氏病（Sanfilippodisease)、莫尔基奥氏病（Morquiodisease)、马-垃病（Maroteaux-Lamydisease)、透明质酸酶缺乏（hyaluronidasedeficiency)、天门冬酰氨酸葡萄糖胺尿症（aspartylglucosaminuria)、岩藻糖苷IC积病(fucosidosis)、甘露糖昔过多症（mannosidosis)、谢尔德氏病（Schindlerdisease)、1型唾液酸缺乏病（sialidosistype1)、旁姆普氏病、致密性成骨不全（Pycnodysostosis)、錯样脂褐质沉积症（ceroidlipofuscinosis)、胆固醇醋沉积病（cholesterolesterstoragedisease)、乌尔曼氏病（Wolmandisease)、多发性硫酸醋酶缺乏（Multiplesulfatasedeficiency)、乳液唾液异常增多（galactosialidosis)、粘脂积病(mucolipidosis)(II、III和IV型）、胱氨酸病（cystinosis)、唾液酸IC积病（sialicacidstoragedisorder)、伴有马-斯二氏综合征的乳糜微粒留滞病（chylomicronretentiondiseasewithMarinesco-Sjogrensyndrome)、海-普二氏综合征（Hermansky-Pudlaksyndrome)、切-希二氏综合征（Chediak-Higashisyndrome)、Danon病（Danondisease)或Geleophysic发育不良（Geleophysicdysplasia)〇[0190]代谢紊乱的症状多种多样，并且可以包括如下的一种或多种，例如，贫血、疲劳、容易挫伤（bruisingeasily)、血小板低、肝增大、脾增大、骨豁脆弱（skeletalweakening)、肺损伤、感染（例如，胸部感染或肺炎）、肾损伤、进行性脑损伤、发作、胎奠过厚、咳嗽、哮鸣、唾液或粘液过量产生、气短（shortnessofbreath)、腹痛、肠或消化道闭塞（occludedbowelorgut)、生育力问题、鼻内息肉、件状指/趾甲和皮肤（clubbingofthefinger/toenailsandskin)、手或脚疼痛（paininthehandsorfeet)、血管角质瘤（angiokeratoma)、排汗减少、角膜和晶状体混池（cornealandlenticularopacities)、白内障（cataracts)、二尖辦脱垂和/或回流（mitralvalveprolapseand/orregurgitation)、心脏肥大（cardiomegaly)、温度不耐受、行走困难、吞咽困难、进行性视力丧失、进行性听力丧失、张力减退、巨舌、反射消失、下腰痛、睡眠呼吸暂停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前凸或脊柱侧凸。应理解的是，由于缺陷或缺乏蛋白质和所导致疾病表型（例如，代谢紊乱的症状显现）的不同性质，给定病症将通常仅出现对于特定病症为特征性的症状。例如，患有法博氏病的患者可以出现上述症状中的特定亚组，例如，但不限于，温度不耐受、角膜眩晕（cornealwhirling)、疼痛、皮瘆、恶心或腹泻。患有高歇尔氏综合征（Gauchersyndrome)的患者可以出现脾大、肝硬变、惊厥、张力过高、呼吸暂停、骨质疏松或皮肤变色。[0191]除了施用本文描述的一种或多种N-糖基化改变的分子，代谢紊乱也可以通过适当的营养和维生素（例如，辅因子疗法）、物理疗法和疼痛药物疗法来治疗。[0192]依赖于给定代谢紊乱的特定性质，患者可以在任何年龄出现这些症状。在许多情况下，症状可以在儿童期或成人期早期出现。例如，法博氏病的症状可以在年轻时（earlyage)出现，在10或11周岁的年龄。[0193]如用于本文，"有风险发展出代谢紊乱"（例如本文所述的代谢紊乱）的受试者是具有发展出紊乱的倾向（predisposition)的受试者，即，由于酶中的突变而产生的发展出代谢紊乱的遗传倾向，所述酶例如a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、a-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶Β、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明质酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。显然，"有风险发展出代谢紊乱"的受试者不是感兴趣的物种中的全部受试者。[0194]"疑似患有病症"的受试者是具有病症（例如，代谢紊乱或任何其它本文所述的病症）的一种或多种症状（例如，任何本文所述的那些症状）的受试者。[0195](ii)癌症[0196]癌症是一类这样的疾病或病症，其特征在于细胞不受控制的分裂和这些细胞扩散的能力，所述扩散或者通过侵入直接生长进入相邻组织或者通过转移植入远距离位点（其中癌细胞经过血流或淋巴系统转运）。癌症可以侵袭各个年龄的人，但是风险有随年龄增加的趋势。癌症的类型可以包括，例如，肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌（hematologicalcancer)、神经组织癌（neuraltissuecancer)、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌或膀胱癌。[0197]如用于本文，"有风险发展出癌症"的受试者是具有发展出癌症的倾向的受试者，即，发展出癌症的遗传倾向，例如，肿瘤抑制基因中的突变（例如，BRCA1、p53、RB或APC中的突变）或已经曝露于能够导致癌症的条件。因此，当受试者已经曝露于诱变或致癌水平的特定化合物（例如，香烟烟雾中的致癌化合物例如丙烯醛、砷、苯、苯并蒽（Benz{a}anthracene)、苯并花（Benzo{a}pyrene)、针-210(氡）、氨基甲酸醋（Urethane)或氯乙稀）时，所述受试者也可以是"有风险发展出癌症"的受试者。此外，当受试者已经曝露于例如大剂量的紫外线或X线辐射或曝露于（例如感染）引起肿瘤/与肿瘤相关的病毒如乳头状瘤病毒、EB病毒（Epstein-Barrvirus)、乙型肝炎病毒或人T-细胞白血病-淋巴瘤病毒时，所述受试者可以是"有风险发展出癌症"的受试者。从上文可以清楚的是"有风险发展出癌症"的受试者不是感兴趣的物种中的全部受试者。[0198]"疑似患有癌症"的受试者是具有癌症的一种或多种症状的受试者。癌症的症状是本领域技术人员熟知的并且包括，但不限于，乳腺肿块、乳头变化、乳腺囊中、乳腺疼痛、体重减轻、虚弱、过度疲劳、进食困难、食欲丧失、久咳、恶化的呼吸急促（worseningbreathlessness)、咳血、血尿、血便、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、腹胀、气胀、腹膜腔积液（fluidinperitonealcavity)、阴道出血、便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎（感染、发热、疼痛）、疼痛、吐血、大量出汗（heavysweating)、发热、高血压、贫血、腹泻、黄疸、眩晕、寒战、肌肉痉挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移和胰腺转移、吞咽困难等。[0199]除了施用一种或多种本文所述的N-糖基化改变的分子，也可以通过化疗剂、电离福射、免疫治疗剂或超高温治疗剂来治疗癌症。化疗剂包括，例如，顺铂（cisplatin)、卡钼（carboplatin)、丙卡巴餅（procarbazine)、氮芥（mechlorethamine)、环磷酰胺（cyclophosphamide)、喜树碱（camptothecin)、阿霉素（adriamycin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑（melphalan)、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、白消安、亚硝基脲、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素（daunorubicin)、多柔比星（doxorubicin)、博来霉素（bleomycin)、普卡霉素、丝裂霉素（mitomycin)、依托泊苷（etoposide)、verampil、鬼白毒素（podophyllotoxin)、他莫昔芬（tamoxifen)、紫杉醇（taxol)、（transplatinum)、5-氟尿喃啶（5-flurouracil)、长春新碱（vincristin)、长春碱（vinblastin)和甲氨蝶呤(methotrexate)〇[0200](iii)炎性病症[0201]如用于本文，"炎性病症"是指其中一种或多种物质（例如，非天然存在于受试者中的物质），藉由白细胞（例如，B细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞或树突细胞）的作用，不适当地引发病理学应答（例如，病理学免疫应答）的过程。因此，所述炎性应答中涉及的这些细胞称作"炎性细胞"。不适当地引发的炎性应答可以是其中没有外源物质（例如，抗原、病毒、细菌、真菌）存在于受试者中或受试者上的应答。不适当地引发的应答可以是其中自身成分（例如，自体抗原）被炎性细胞靶向的应答（例如，自身免疫病如多发性硬化）。不适当地引发的应答也可以是在程度或持续时间方面不适当的应答，例如，过敏反应。因此，不适当地引发的应答的原因可以是存在微生物感染（例如，病毒、细菌或真菌的）。炎性病症的类型（例如，自身免疫病）可以包括，但不限于，骨关节炎、类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis(RA))、脊椎关节病（spondyloarthropathies)、POEMS综合征(POEMSsyndrome)、克朗氏病（Crohn'sdisease)、多中心性卡斯尔氏病（multicentricCastleman'sdisease)、系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus(SLE))、多发性硬化（MS)、肌营养不良（musculardystrophy(MD))、胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus(IDDM))、皮肌炎（dermatomyositis)、多肌炎（polymyositis)、炎性神经病（inflammatoryneuropathies)例如归伯二氏综合征(GuillainBarresyndrome)、脉管炎（vasculitis)例如韦格纳肉芽肿病（Wegener'sgranulomatosus)、结节性多动脉炎（polyarteritisnodosa)、风湿性多肌痛（polymyalgiarheumatica)、颞动脉炎（temporalarteritis)、舍格伦综合征（Sjogren'ssyndrome)、贝赛特氏病（Bechet'sdisease)、丘-施二氏综合征（Churg-Strausssyndrome)或高安氏动脉炎（Takayasu'sarteritis)。炎性病症还包括特定类型的变态反应例如鼻炎（rhinitis)、鼻窦炎（sinusitis)、荨麻瘆（urticaria)、寻麻瘆（hives)、血管性水肿(angioedema)、特应性皮炎（atopicdermatitis)、食物变态反应（foodallergies)(例如，(坚果变态反应（nutallergy))、药物变态反应（drugallergies)(例如，青霉素）、昆虫变态反应（insectallergies)(例如，针对蜂螯的变态反应）或肥大细胞病（mastocytosis)。炎性病症也可包括溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis)和哮喘（asthma)。[0202]"有风险患上炎性病症"的受试者是指具有一种或多种炎性病症的家族史（例如，一种或多种炎性病症的遗传倾向）的患者或曝露于一种或多种炎症诱导条件的受试者。例如，受试者可能已经曝露于病毒或细菌超抗原，例如，但不限于，葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxins)(SEs)、酿胺链球菌外毒素（streptococcuspyogenesexotoxin)(SPE)、金黄色葡萄球菌中毒性休克-综合征毒素（staphylococcusaureustoxicshock-syndrometoxin)(TSST-1)、链球菌促有丝分裂外毒素（streptococcalmitogenicexotoxin)(SME)和链球菌超抗原（streptococcalsuperantigen)(SSA)。从上文可以清楚的是"有风险发展出炎性病症"的受试者不是感兴趣的物种中的全部受试者。[0203]"疑似患有炎性病症"的受试者是出现炎性病症的一种或多种症状的受试者。炎性病症的症状是本领域熟知的并且包括，但不限于，发红、肿胀（例如，关节肿胀）、触碰发热的关节（jointsthatarewarmtothetouch)、关节痛、僵硬、关节功能丧失、发热、寒战、疲劳、精力丧失（lossofenergy)、头痛、食欲丧失、肌肉僵硬、失眠、瘙痒、鼻塞、喷嚏、咳嗽、一种或多种神经学症状如眩晕、发作或疼痛。[0204]除了施用一种或多种本文所述的N-糖基化改变的分子之外，炎性病症也可以通过非类固醇抗炎药（NSAID)、缓解病情的抗风湿药（DMARD)、生物反应调节剂或皮质类固醇来治疗。生物反应调节剂包括，例如，抗TNF剂（例如，可溶性TNF受体或对TNF特异性的抗体如adulimumab、英夫利昔单抗（infliximab)或依那西普（etanercept)[0205]使用N-糖基化改变的分子（或其药物组合物）、适用于治疗（例如，预防或改善其一种或多种症状）任何本文所述的病症的方法在下节中陈述。[0206]药物组合物和治疗方法[0207]N-糖基化改变的分子（例如，目标分子如目标蛋白的改变的N-糖基化形式）可以并入药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的所述分子和一种或多种佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。可接受的稀释剂、载体和赋形剂通常不负面影响受体的体内稳态（例如电解质平衡）。可接受的载体包括生物相容性、惰性或生物可吸收的盐、缓冲剂、寡糖或多糖、聚合物、粘度改善剂（viscosity-improvingagent)、防腐剂等。一种示例性载体是生理盐水（0.15MNaCl，pH7.0-7.4)。另一种示例性载体是50mM磷酸钠、IOOmM氯化钠。关于配制和施用药物组合物的技术的进一步细节可以在例如Remington'sPharmaceuticalSciences(MaackPublishingCo.,Easton,Pa.)中找到。也可以将辅助性活性化合物(supplementaryactivecompound)并入组合物中。[0208]含有N-糖基化改变的分子的药物组合物的施用可以是系统的或局部的。可以将药物组合物这样配制，即令它们适用于胃肠外和/或非胃肠外施用。具体使用方式(administrationmodality)包括皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、鞘内、口服、直肠、口腔、局部、鼻、眼、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴、阴道和子宫内施用。[0209]施用可以通过定期注射所述药物组合物的推注（bolus)，或者可以是不间断或连续地通过从外部储器（reservoir)(例如，IV包）或内部储器（例如，生物可腐蚀性植入物（bioerodableimplant)、生物人工器官（bioartificialorgan)或植入的产生N-糖基化改变的分子的细胞集落）进行静脉内或腹膜内施用。参见，例如，美国专利Nos.4,407,957、5,798,113和5,800,828,将它们通过所述整体并入本文。药物组合物的施用可以使用合适的递送手段（deliverymeans)来实现，所述递送手段例如：泵（参见，例如，AnnalsofPharmacotherapy，27:912(1993);Cancer,41:1270(1993);CancerResearch,44:1698(1984)，通过所述整体并入本文）；微囊化（参见，例如，美国专利Nos.4,352,883;4,353,888;和5,084,350,通过所述整体并入本文）；连续释放聚合物植入物（continuousreleasepolymerimplant)(参见，例如，Sabel,美国专利No.4,883,666,通过所述整体并入本文）；大囊化（macroencapsulation)(参见，例如，美国专利Nos.5,284,761、5,158,881、4,976,859和4,968,733,和公开的PCT专利申请W092/19195、WO95/05452,将它们每一篇的公开内容通过所述整体并入本文）；皮下、静脉内、动脉内、肌肉内注射或注射至其它合适部位；或在胶囊、液体、片剂、丸剂（pill)或延长释放制剂（prolongedreleaseformulation)中口服施用。[0210]胃肠外递送系统的实例包括乙烯-乙酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵（osmoticpump)、可植入输注系统（implantableinfusionsystem)、泵递送（pumpdelivery)、囊化细胞递送（encapsulatedcelldelivery)、脂质体递送（liposomaldelivery)、针递送注射（needle-deliveredinjection)、无针注射（needle-lessinjection)、喷雾器(nebulizer)、雾化器（aerosolizer)、电穿孔和经皮贴片（transdermalpatch)。[0211]适合于胃肠外施用的制剂通常含有N-糖基化改变的分子的无菌含水制备物，其优选与受体的血液等渗（例如，生理盐水溶液）。制剂可以以单位剂量或多剂量形式存在。[0212]适合于口服施用的制剂可以作为离散单位如胶囊、扁囊剂（cachet)、片剂或锭剂(lozenges)存在，其各自含有预定量的N-糖基化改变的分子；或含水液体中或非水液体中的悬液，如糖楽·、酏剂、乳剂或饮剂（draught)。[0213]可以将适合于局部施用的N糖基化改变的分子（例如，目标分子例如目标蛋白的改变的N-糖基化形式）向哺乳动物（例如，人患者）作为例如乳膏（cream)、喷雾、泡沫、凝胶、软膏（ointment)、油膏（salve)或干燥摩擦剂（dryrub)施用。干燥摩擦剂可以在施用部位再水合。N-糖基化改变的分子也可以直接注入（例如，浸入并干燥）其后可以进行局部应用的绷带、纱布或贴片。也可以将N-糖基化改变的分子以半液态、凝胶（gelled)态或完全液态保持在用于局部施用的绷带、纱布或贴片中（参见，例如，美国专利No.4,307,717，将其内容通过所述整体并入本文）。[0214]可以向需要的受试者以本领域技术人员可以确定的给药方案施用治疗有效量的药物组合物。例如，可以向受试者施用组合物，例如，以每剂〇.01μg/kg-10,000μg/kg受试者体重的剂量系统性施用。在另一实例中，剂量是每剂Iμg/kg-100μg/kg受试者体重。在另一实例中，剂量是每剂Iμg/kg-30μg/kg受试者体重，例如，每剂3μg/kg-?ομg/kg受试者体重。[0215]为了优化治疗效力，可以首先以不同的给药方案施用N-糖基化改变的分子。单位剂量和方案依赖于多种因素，包括，例如，哺乳动物的种类、其免疫状态、哺乳动物的体重。通常，组织中N-糖基化改变的分子的水平可以使用适合的、作为临床测试流程一部分的筛查测定法监测，例如，来测定给定治疗方案的效力。[0216]N-糖基化改变的分子的给药频率在医疗工作者（medicalpractitioner)(例如，医生或护士）的技术和临床判断范围之内。通常，施用方案通过临床试验建立，所述试验可以建立最适施用参数。然而，从业者可以根据受试者的年龄、健康、重量、性别和医疗状态改变这些治疗方案。给药频率可以依赖于治疗是预防性还是治疗性的而变化。[0217]这些N-糖基化改变的分子（例如，目标分子例如目标蛋白的改变的N-糖基化形式）或其药物组合物的毒性和治疗效力可以通过已知的药学方法在例如细胞培养物或实验动物中测定。这些方法可以用于例如测定LD50(对群体的50%致死的剂量）和ED50(在群体的50%中治疗有效的剂量）。毒性和治疗效果的剂量比是治疗指数并且可以表示为LD50/ED50的比例。展现高治疗指数的药物组合物是优选的。尽管可以使用展现毒性副作用的药物组合物，应该注意设计使这些化合物靶向患病组织的部位以尽量减小对正常细胞的损害（例如，非靶细胞），并且由此降低副作用。[0218]从细胞培养测定法和动物研宄获得的数据可以用于配制用于适当受试者（例如，人患者）中的剂量范围。这些药物组合物的剂量通常在如下循环浓度的范围内，所述浓度包括ED50且几乎无毒或无毒。剂量可以在这个范围内依赖于采用的剂量形式和使用的施用途径而变化。对于如本文所述使用的药物组合物（例如，用于治疗受试者中的代谢紊乱），最初可以从细胞培养测定法估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现包括在细胞培养物中测定的IC50(即，实现对症状的最大抑制的一半的药物组合物浓度）的循环血浆浓度范围。这种信息可以用于更精确地测定在人中有用的剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相层析测量。[0219]如本文所定义的，"治疗有效量"的N-糖基化改变的分子是能够在受治疗的受试者中产生期望的医学结果的分子的量（例如，改善代谢紊乱的一种或多种症状或减少癌细胞增殖）。N-糖基化改变的分子的治疗有效量（即，有效剂量）包括毫克或微克量的所述化合物每千克受试者或样品重量（例如，约1微克每千克至约500毫克每千克，约100微克每千克至约5毫克每千克，或约1微克每千克至约50微克每千克）。[0220]受试者可以是任何哺乳动物，例如，人（例如，人患者）或非人灵长类（例如，黑猩猩（chimpanzee)、狒狒（baboon)或猴（monkey))、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、马、牲畜类型（例如，牛、猪、绵羊或山羊）、犬、猫或鲸。[0221]可以将本文描述的N-糖基化改变的分子或其药物组合物与另一治疗作为联合疗法向受试者施用，所述另一治疗例如用于代谢紊乱（例如，溶酶体贮积病）的治疗。例如，联合疗法可以包括向受试者（例如，人患者）施用一种或多种额外的为受试者提供治疗益处的剂（agent)，所述受试者患有或有风险发展出（或疑似患有）代谢紊乱（例如，溶酶体贮积病）。由此，化合物或药物组合物和所述一种或多种额外的剂同时施用。或者，可以首先及时（intime)施用N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质或多猫醇），并其次及时施用所述一种或两种额外的剂。可以首先及时施用所述一种或两种额外的剂，并其次及时施用N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质或多萜醇）。化糖基化改变的分子可以替代或加强先前施用或当前施用的疗法。例如，当用本发明的N-糖基化改变的分子治疗时，一种或多种额外的剂的施用可以停止或减少，例如，以较低水平施用。也可以保持先前疗法的施用。在一些情况下，可以将先前疗法保持到N-糖基化改变的分子的水平（例如，剂量或进度（schedule))达到足以提供治疗效果的水平。可以联合施用两种疗法。[0222]应该理解的是在先前治疗有特定毒性的情况（例如，具有显著副作用谱的用于代谢紊乱的治疗）下，N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质或多萜醇）的施用可以用于将先前治疗的量抵消和/或减少到足以给出相同或改进的治疗益处、但是没有毒性的水平。[0223]在一些情况下，当向受试者施用本发明的N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质、多萜醇或与多萜醇连接的脂质）或药物组合物时，将第一种疗法中断。可以监测受试者的第一种预先选择的结果，例如，代谢紊乱的一种或多种症状的改善，例如任何本文所述的那些（见上文）。在一些情况下，在观察到第一种预先选择的结果的情况下，减少或中断使用N-糖基化改变的分子（例如，N-糖基化改变的蛋白质或N-糖基化改变的多萜醇）的治疗。然后在使用N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质或多萜醇）的治疗之后，可以监测受试者第二种预先选择的结果，例如，代谢紊乱的症状的恶化。当观察到所述第二种预先选定的结果时，可以恢复或增加向受试者施用N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质或多萜醇），或恢复所述第一种治疗的施用，或对受试者施用N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质、多萜醇或与多萜醇连接的脂质）和第一种治疗二者或量增加的N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质或多萜醇）和所述第一种治疗方案。[0224]N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质或多萜醇）也可以与用于疾病（例如，代谢紊乱）的一种或多种症状的治疗一起施用。例如，N-糖基化改变的分子（例如，蛋白质、多萜醇或与多猫醇连接的脂质）可以与例如疼痛用药（painmedication)共同施用（例如，同时或通过上述联合方案）。[0225]应该理解的是在一些实施方案中，N-糖基化改变的分子是其中改变的糖基化使所述分子产生医学相关产物的能力增加的分子。例如，N-糖基化改变的分子可以是能够产生治疗性产物（例如，小分子或治疗性肽）的酶，所述酶的活性通过糖基化增加或优化。这些产物和使用所述产物的方法在本公开的范围之内。[0226]本文所述的任何药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或散发器(dispenser)中。[0227]本申请具体涉及如下项：[0228]1.产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法，所述方法包括：[0229]提供解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞，所述细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性；和[0230]向细胞中引入编码目标蛋白的核酸，其中所述细胞以改变的糖基化形式产生所述目标蛋白。[0231]2.项1的方法，还包括分离所述目标蛋白的改变的N-糖基化形式。[0232]3.项1或2的方法，其中所述目标蛋白是外源蛋白。[0233]4.项1-3中任一项的方法，其中所述目标蛋白是内源蛋白。[0234]5.项1-4中任一项的方法，其中所述目标蛋白是哺乳动物蛋白。[0235]6.项5的方法，其中所述目标蛋白是人蛋白。[0236]7.项1-6中任一项的方法，其中所述目标蛋白是病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。[0237]8.项7的方法，其中所述融合蛋白是病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子或趋化因子与抗体或其抗原结合片段的融合物。[0238]9.项1-8中任一项的方法，其中所述目标蛋白是与溶酶体贮积病（LSD)相关的蛋白质。[0239]10.项1-9中任一项的方法，其中所述目标蛋白是葡糖脑苷酯酶或半乳糖脑苷酯酶。[0240]11.项1-9中任一项的方法，其中所述目标蛋白选自下组：a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、a-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶Β、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明质酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。[0241]12.项1-11中任一项的方法，其中所述改变的N-糖基化形式包括一种或多种N-聚糖结构。[0242]13.项12的方法，其中所述一种或多种N-聚糖是Man5GlcNAc2。[0243]14.项12的方法，其中所述一种或多种N-聚糖是Man8GlcNAc2。[0244]15.项12的方法，其中所述一种或多种N-聚糖是Man9GlcNAc2。[0245]16.项12的方法，其中所述一种或多种N-聚糖是Man3GlcNAc2。[0246]17.项12的方法，其中所述一种或多种N-聚糖是Glc1Man5GlcNAc2。[0247]18.项12的方法，其中所述一种或多种N-聚糖是Glc2Man5GlcNAc2。[0248]19.项12-18中任一项的方法，其中所述目标蛋白的改变的N-糖基化形式是均质的。[0249]20.项12-18中任一项的方法，其中所述目标蛋白的改变的N-糖基化形式基本上是均质的。[0250]21.项20的方法，其中含有改变的糖基化的改变的目标分子之部分是至少约20%〇[0251]22.项20的方法，其中含有改变的糖基化的改变的目标分子之部分是至少约30%〇[0252]23.项20的方法，其中含有改变的糖基化的改变的目标分子之部分是至少约40%〇[0253]24.项19-23中任一项的方法，其中所述改变的糖基化是Man5GlcNAc2。[0254]25.项19-23中任一项的方法，其中所述改变的糖基化是Man8GlcNAc2。[0255]26.项19-23中任一项的方法，其中所述改变的糖基化是Man9GlcNAc2。[0256]27.项19-23中任一项的方法，其中所述改变的糖基化是Man3GlcNAc2。[0257]28.项19-23中任一项的方法，其中所述改变的糖基化是GlClMan5GlcNAc2。[0258]29.项19-23中任一项的方法，其中所述改变的糖基化是Glc2Man5GlcNAc2。[0259]30.项1-29中任一项的方法，其中所述细胞经遗传工程化而缺乏至少一种N-糖基化活性。[0260]31.项30的方法，其中N-糖基化活性是ALG3活性。[0261]32.项30的方法，其中N-糖基化活性是OCHl活性。[0262]33.项30的方法，其中N-糖基化活性是MNSl活性。[0263]34.项30的方法，其中N-糖基化活性是MNN9活性。[0264]35.项1-34中任一项的方法，其中所述至少一种修饰包含缺失编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因。[0265]36.项1-35中任一项的方法，其中所述至少一种修饰包含表达具有N-糖基化活性的蛋白质的突变形式。[0266]37.项1-36中任一项的方法，其中所述至少一种修饰包含引入或表达RNA分子，所述RNA分子干扰具有N-糖基化活性的蛋白质的功能性表达。[0267]38.项1-37中任一项的方法，其中所述至少一种修饰包含表达具有N-糖基化活性的蛋白质。[0268]39.项38的方法，其中所述表达的蛋白质是由细胞中的外源核酸编码的蛋白质。[0269]40.项38的方法，其中所述N-糖基化活性是葡萄糖基转移酶活性。[0270]41.项38-40中任一项的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是ALG6。[0271]42.项38的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是α-甘露糖苷酶。[0272]43.项38的方法，其中所述α-甘露糖苷酶靶向内质网。[0273]44.项42或43的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是融合蛋白，所述融合蛋白包含α-甘露糖苷酶多肽和HDEL内质网保留肽。[0274]45.项42的方法，其中所述α-甘露糖苷酶具有5.1以下的最适pH。[0275]46.项38的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是能够从Man5GlcNAc^除葡萄糖残基的蛋白质。[0276]47.项38或46的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是具有α-1，3-葡糖苷酶活性的蛋白质。[0277]48.项46或47的方法，其中所述蛋白质是葡糖苷酶II。[0278]49.项46-48中任一项的方法，其中所述蛋白质包含葡糖苷酶II的α和/或β亚基。[0279]50.项46的方法，其中所述蛋白质是变聚糖酶。[0280]51.项1的方法，其中所述细胞经遗传工程化而包含至少两种经修饰的N-糖基化活性。[0281]52.项51的方法，其中所述至少两种经修饰的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。[0282]53.项1的方法，其中所述细胞经遗传工程化而包含至少三种经修饰的N-糖基化活性。[0283]54.项51的方法，其中所述至少三种经修饰的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。[0284]55.项38-54中任一项的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是外源蛋白。[0285]56.项38-54中任一项的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是哺乳动物蛋白。[0286]57.项56的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是人蛋白。[0287]58.项38-54中任一项的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是低等真核生物蛋白。[0288]59.项45的方法，其中所述低等真核生物是真菌、锥虫或原生动物。[0289]60.项58的方法，其中所述低等真核生物选自下组布氏锥虫、哈茨木霉和曲霉属。[0290]61.项1-60中任一项的方法，其中修饰包含表达能够影响目标蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物学活性变体。[0291]62.项61的方法，其中所述能够影响甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物学活性变体是MNM。[0292]63.项61的方法，其中所述能够影响甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物学活性变体是PNOl。[0293]64.项61的方法，其中所述能够影响甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物学活性变体是ΜΝΝ6。[0294]65.项61-64中任一项的方法，其中糖蛋白中至少约30%的甘露糖残基是磷酸化的。[0295]66.项1-65中任一项的方法，其中所述细胞未经遗传工程化而成为OCHl活性缺陷的。[0296]67.项1-66中任一项的方法，还包括对糖蛋白的额外加工。[0297]68.项67的方法，其中所述额外加工发生在体外。[0298]69.项67的方法，其中所述额外加工发生在体内。[0299]70.项67-69中任一项的方法，其中所述额外加工包括向修饰的糖蛋白添加异源丰旲块。[0300]71.项55的方法，其中所述异源模块是聚合物或载体。[0301]72.项67-71中任一项的方法，其中所述额外加工包括对所述目标蛋白的改变的N-糖基化形式进行酶处理或化学处理。[0302]73.项67的方法，其中所述额外加工包括用甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基转移酶处理所述目标蛋白的改变的N-糖基化形式。[0303]74.项72的方法，其中所述额外加工包括用氢氟酸处理所述目标蛋白的改变的N-糖基化形式。[0304]75.项67-74中任一项的方法，其中所述额外加工包括将所述目标蛋白的改变的N-糖基化形式磷酸化。[0305]76.具有改变的N-糖基化的分离的蛋白质，其中所述蛋白质是通过项1-75中任一项的方法产生的。[0306]77.分离的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞，所述细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性。[0307]78.项77的分离的细胞，其中N-糖基化活性是ALG3活性。[0308]79.项77或78的分离的细胞，其中N-糖基化活性是OCHl活性。[0309]80.项77-79中任一项的分离的细胞，其中N-糖基化活性是丽Sl活性。[0310]81.项77-79中任一项的分离的细胞，其中N-糖基化活性是MNN9活性。[0311]82.项77-79中任一项的分离的细胞，其中所述修饰包含缺失编码具有N-糖基化活性的蛋白质的基因。[0312]83.项77-79中任一项的分离的细胞，其中所述修饰包含表达具有N-糖基化活性的蛋白质的突变形式。[0313]84.项77-83中任一项的分离的细胞，其中所述修饰包含引入或表达RNA分子，所述RNA分子干扰具有N-糖基化活性的蛋白质的功能性表达。[0314]85.项77-83中任一项的分离的细胞，其中所述修饰包含表达具有N-糖基化活性的蛋白质。[0315]86.项85的分离的细胞，其中所述N-糖基化活性是葡萄糖基转移酶活性。[0316]87.项85或86的分离的细胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是ALG6。[0317]88.项85的分离的细胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是α-甘露糖苷酶。[0318]89.项88的分离的细胞，其中所述α-甘露糖苷酶靶向内质网。[0319]90.项88或89的分离的细胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是融合蛋白，所述融合蛋白包含α-甘露糖苷酶多肽和HDEL内质网保留肽。[0320]91.项85的分离的细胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是能够从Man5GlcNAc2去除葡萄糖残基的蛋白质。[0321]92.项85或91的分离的细胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是具有α-1，3-葡糖苷酶活性的蛋白质。[0322]93.项91或92的分离的细胞，其中所述蛋白质是葡糖苷酶II。[0323]94.项91-93中任一项的分离的细胞，其中所述蛋白质包含葡糖苷酶II的α和/或β亚基。[0324]95.项91的分离的细胞，其中所述蛋白质是变聚糖酶。[0325]96.项77-95中任一项的分离的细胞，其中所述细胞经遗传工程化而包含至少两种经修饰的N-糖基化活性。[0326]97.项96的分离的细胞，其中所述至少两种经修饰的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。[0327]98.项77-97中任一项的分离的细胞，其中所述细胞经遗传工程化而包含至少三种经修饰的N-糖基化活性。[0328]99.项98的分离的细胞，其中至少三种经修饰的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。[0329]100.利要求77-99中任一项的分离的细胞，其中所述细胞未经遗传工程化而成为OCHl活性缺陷的。[0330]101.项85-100中任一项的分离的细胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白质是人蛋白。[0331]102.项77-101中任一项的分离的细胞，其中所述修饰包含表达能够促进经修饰的糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物学活性变体。[0332]103.项102的分离的细胞，其中所述能够影响甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物学活性变体是MNM。[0333]104.项103的分离的细胞，其中所述影响甘露糖基磷酸化的蛋白质或其生物学活性变体是PNOl。[0334]105.-种治疗病症的方法，所述病症可以通过施用具有改变的N-糖基化的蛋白质来治疗，所述方法包括：[0335]向受试者施用项76的蛋白质，[0336]其中所述受试者是患有或疑似患有可以通过施用具有改变的N-糖基化的蛋白质来治疗的受试者。[0337]106.项105的方法，其中所述病症是代谢紊乱。[0338]107.项106的方法，其中所述代谢紊乱是溶酶体贮积病（LSD)。[0339]108.项107的方法，其中溶酶体贮积病是高歇尔氏病、泰-沙二氏病、旁姆普氏病、尼-皮二氏病或法布里氏病。[0340]109.项105-108中任一项的方法，其中所述蛋白质是与LSD相关的蛋白质。[0341]110.项109的方法，其中所述蛋白质是葡糖脑苷酯酶或α-半乳糖苷酶。[0342]111.项109的方法，其中所述蛋白质选自下组：a-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-己糖胺酶、β-D-甘露糖苷酶、a-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶Β、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙酰半乳糖胺酶、天冬氨酰葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、β-D-葡糖醛酸酶、透明质酸酶、a-L-甘露糖苷酶、α-神经氨酸酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。[0343]112.项105-111中任一项的方法，其还包括确定所述受试者是否患有可以通过施用具有改变的N-糖基化的蛋白质来治疗的疾病。[0344]113.项105-112中任一项的方法，其中所述受试者是人。[0345]114.产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目标蛋白与制备自解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞的细胞裂解物接触，所述细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性，其中使所述目标蛋白与所述细胞裂解物接触导致该目标蛋白的改变的N-糖基化形式。[0346]115.产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目标蛋白与一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质接触，其中所述一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质获得自解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞，所述细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性，并且其中使所述目标分子与所述一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质接触导致该目标蛋白的改变的N-糖基化形式。[0347]116.解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞的基本上纯的培养物，所述培养物中的大量经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性。[0348]117.项87的基本上纯的细胞培养物，其中所述细胞培养物含有一种或多种细胞亚群，每个亚群包含不同的经修饰的糖基化活性。[0349]118.分离的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。[0350]119.分离的核苷酸序列，其包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%相同的序列。[0351]120.由项118或119的分离的核苷酸序列编码的多肽。[0352]121.分离的核酸，其包含：[0353](a)核苷酸序列，其在高严紧条件下与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的补体杂交；或[0354](b)所述核苷酸序列的补体。[0355]122.包含项118-121中任一项的核酸序列的载体。[0356]123.包含项118-121中任一项的核酸序列的表达载体。[0357]124.包含项123的表达载体的培养的细胞或所述细胞的子代，其中所述细胞表达所述多肽。[0358]125.产生蛋白质的方法，所述方法包括在允许表达所述多肽的条件下培养项124的细胞。[0359]126.项125的方法，其还包括在培养细胞之后，从细胞或培养细胞的培养基分离多肽。[0360]以下是本发明的实践的实施例。不应将它们理解为以任何方式对本发明范围的限制。实施例[0361]实施例L质粒、引物和菌株[0362]表1含有在本文所述实验中所用载体（例如，表达载体）和缺失盒的构建中使用的全部质粒的列表。在所述实验中使用了解脂西洋蓍霉的MTLY60菌株。[0363]表2含有在以下实施例中使用的引物（引物的名称）和引物应用的列表。[0364]表1[0365]【权利要求】1.产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法，所述方法包括：提供解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞，所述细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性；和向细胞中引入编码目标蛋白的核酸，其中所述细胞以改变的糖基化形式产生所述目标蛋白。2.具有改变的N-糖基化的分离的蛋白质，其中所述蛋白质是通过权利要求1的方法产生的。3.分离的解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞，所述细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性。4.一种治疗病症的方法，所述病症可以通过施用具有改变的N-糖基化的蛋白质来治疗，所述方法包括：向受试者施用权利要求2的蛋白质，其中所述受试者是患有或疑似患有可以通过施用具有改变的N-糖基化的蛋白质来治疗的受试者。5.产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目标蛋白与制备自解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞的细胞裂解物接触，所述细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性，其中使所述目标蛋白与所述细胞裂解物接触导致该目标蛋白的改变的N-糖基化形式。6.产生目标蛋白的改变的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目标蛋白与一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质接触，其中所述一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质获得自解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞，所述细胞经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性，并且其中使所述目标分子与所述一种或多种具有N-糖基化活性的蛋白质接触导致该目标蛋白的改变的N-糖基化形式。7.解脂西洋蓍霉或Arxulaadeninivorans细胞的基本上纯的培养物，所述培养物中的大量经遗传工程化而包含至少一种经修饰的N-糖基化活性。【文档编号】C12P21/00GK104480140SQ201410681757【公开日】2015年4月1日申请日期:2008年4月3日优先权日:2007年4月3日【发明者】尼科.L.M.卡尔沃尔特,沃特.弗维肯,卡伦.J.马塞尔德波尔克,史蒂文.C.J.盖森斯,芒娜.古尔法尔申请人:奥克西雷恩英国有限公司