用于检测大肠杆菌o157:h7的显色培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公布了一种用于检测大肠杆菌O157:H7的显色培养基，培养基含有琼脂、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，还含有山梨醇、肌醇、中性红、β-半乳糖苷酶显色底物Ⅰ5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖、β-半乳糖苷酶显色底物Ⅱ邻硝基苯-β-D-半乳糖苷、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、牛胆盐、亚碲酸钾、头孢克肟。本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌O157:H7，检测灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴别，目标菌落大肠杆菌O157:H7颜色不同于现有技术，为科研人员提供了更多选择。
【专利说明】用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物检测的培养基，尤其涉及一种用于检测大肠杆菌0157:H7 的显色培养基。
【背景技术】
[0002] 出血性大肠杆菌（enterohemorrhage E. Coli，EHEC)是大肠杆菌的一个亚型,EHEC 分为157、26、111血清型，主要致病菌株为0157:H7,可引起感染性腹泻，因能引起人类的出 血性肠炎而得名。
[0003] 肠出血性大肠杆菌大肠杆菌0157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇以及编码的 β-葡萄糖醛酸苷酶无活性外，其它常见的特征与大肠埃希氏菌基本相似。传统迟缓发酵山 梨醇-麦康凯（SMAC)培养基可作为对0157:Η7筛选的培养基。在SMAC培养基上，0157:Η7 菌落无色，而发酵菌株呈粉红色，在梅里埃的显色培养基上，0157:Η7菌落呈蓝绿色，在科玛 嘉的显色培养基上，〇157:Η7菌落呈品红色，在国内厂家生产的显色培养基上，0157:Η7菌 落呈紫红色。专利CN201110375648公布了一种能将阪崎肠杆菌和不发酵山梨醇但β-葡萄 糖醛酸苷酶阳性与区分的显色培养基。相比PCR法、金标试纸法、乳胶凝集法、酶联免疫吸 附法、DNA探针技术等快速检测方法，以显色培养基为基础的特异性显色生化鉴定技术能刚 好地与传统方法接轨，同时能将检测、计数和初步鉴别一次完成，大幅度提高检的速度和准 确性，检测成本较低，因此应用前景广阔。在通过多种显色培养基同时筛选菌种时，存在因 显色相同或相近而导致实验误差，需要开发不同显色方案的显色培养基以满足科研需求。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基。
[0005] 本发明的所采用的技术方案为：
[0006] -种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有：琼脂 15-20g、蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化钠5-10g，还含有山梨醇10-20g、肌醇4-7g、 中性红0.005-0. 03g、β-半乳糖苷酶显色底物I 0.05-0. 2g、β-半乳糖苷酶显色底物 II l-3g、异丙基-β-D-硫代批喃半乳糖苷0. 05-0. 2g、牛胆盐l-5g、亚締酸钾l-5mg、头孢 克月亏 0· Ol-O. 06mg。
[0007] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物I为5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖。
[0008] 优选的，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖在IOOOmL培养基中的含量为0· lg。
[0009] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物II为邻硝基苯-β -D-半乳糖苷。
[0010] 优选的，邻硝基苯-β -D-半乳糖苷在IOOOmL培养基中的含量为2g。
[0011] 优选的，山梨醇在IOOOmL培养基中的含量为15g，肌醇在IOOOmL培养基中的含量 为5g，中性红在IOOOmL培养基中的含量为0. Olg。
[0012] 优选的，每IOOOmL培养基含有琼脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g， 山梨醇15g、肌醇5g、中性红0. Olg、β -半乳糖苷酶显色底物I 0. lg、β -半乳糖苷酶显色 底物II 2g、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克月亏 0. 04mg〇
[0013] 本发明在培养基中添加了山梨醇和中性红，除大肠杆菌0157 :H7外的大肠菌群发 酵山梨醇产酸，在pH指示剂中性红作用下显示出红色色泽，而大肠杆菌0157 :H7不利用山 梨醇而呈现无色菌落。
[0014] 本发明在培养基中添加了 β -半乳糖苷酶显色底物I和β -半乳糖苷酶显色底物 II，大肠菌群在β -半乳糖苷酶作用下分解底物，游离出显色剂，使菌落呈现出显色剂的色 泽。
[0015] 胆盐可抑制样品中大部分的革兰氏阳性球菌，包括牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去 氧胆酸钠和混合胆盐。本发明在培养基中添加了胆盐。
[0016] 本发明在培养基中添加了，可抑制样品中部分的革兰氏阴性杆菌如大肠菌群以及 容易扩散生长的变型杆菌的抗生素亚碲酸钾和头孢克肟。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 本发明的显色培养基为大肠杆菌0157 :Η7的检测提供了一种新的显色方案，为科 研工作者在进行多种显色培养基同时筛选菌种时提供更多选色方案，避免因目标菌落显色 相同或相近导致的非系统误差。
[0019] 本发明的显色培养基能快速、准确、简便地从大肠菌群中鉴别出大肠杆菌0157 : Η7。
【具体实施方式】
[0020] -种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有：琼脂 15-20g、蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化钠5-10g，其特征在于，还含有山梨醇10-20g、 肌醇4-7g、中性红0. 005-0. 03g、β -半乳糖苷酶显色底物I 0. 05-0. 2g、β -半乳糖苷酶 显色底物II l_3g、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0. 05-0. 2g、牛胆盐l-5g、亚碲酸钾 l-5mg、头孢克肟(λ 01-0. 06mg。
[0021] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物I为5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖。
[0022] 优选的，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖在IOOOmL培养基中的含量为0. lg。
[0023] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物II为邻硝基苯-β -D-半乳糖苷。
[0024] 优选的，邻硝基苯-β -D-半乳糖苷在IOOOmL培养基中的含量为2g。
[0025] 优选的，一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼 脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性红0. Olg、β -半乳 糖苷酶显色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. lg、β -半乳糖苷酶显色底物II邻 硝基苯-β -D-半乳糖苷2g、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾 2mg、头孢克厢0. 04mg。
[0026] 本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌0157 :H7的方法，包括如下步骤：
[0027] (1)制备显色平板：每IOOOmL去离子水中加入上述显色培养基除β -半乳糖苷酶 显色底物II邻硝基苯-β -D-半乳糖苷、亚碲酸钾、头孢克肟外的原料，搅拌，加热煮沸至完 全溶解，待冷至约50°C，加入过滤除菌的邻硝基苯-β-D-半乳糖苷、亚碲酸钾、头孢克肟， 混匀，倒平板，备用；
[0028] (2)接种培养：将样品或含样品的增菌液接种到显色平板上，37°C培养22?26h ;
[0029] (3)结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1?3mm、边缘整齐的外黄心 绿或黄绿色的菌落，说明该样品存在大肠杆菌0157 :H7,其它肠道菌或被抑制或为显示红 色。
[0030] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
[0031] 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷购买自Sigma公司。
[0032] 实施例1
[0033] -种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性红0. Olg、β -半乳糖苷酶 显色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. 15g、β -半乳糖苷酶显色底物II邻硝基 苯-β -D-半乳糖苷lg、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、 头孢克肟〇. 〇4mg。
[0034] 实施例2
[0035] -种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性红0. Olg、β -半乳糖苷 酶显色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. 2g、β -半乳糖苷酶显色底物II邻硝基 苯-β -D-半乳糖苷lg、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、 头孢克肟〇. 〇4mg。
[0036] 实施例3
[0037] -种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性红0. Olg、β -半乳糖苷酶 显色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. 05g、β -半乳糖苷酶显色底物II邻硝基 苯-β -D-半乳糖苷3g、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、 头孢克肟〇. 〇4mg。
[0038] 实施例4
[0039] -种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性红0. 01g、β -半乳糖苷酶 显色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. 05g、β -半乳糖苷酶显色底物II邻硝基 苯-β -D-半乳糖苷2. 5g、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾 2mg、头孢克厢0. 04mg。
[0040] 实施例5
[0041] -种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性红0. 01g、β -半乳糖苷 酶显色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. lg、β -半乳糖苷酶显色底物II邻硝基 苯-β -D-半乳糖苷2g、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、 头孢克肟〇. 〇4mg。
[0042] 实施例6
[0043] 将 E. coli 0157:H7NCTC12900、E. coli 0157:H7882364、E. coli 0157:H7ATCC43895、E. coli 0157:H7ATCC43888、E. coli ATCC35218、E. coli ATCC8739、 E.coli CMCC(B)44102、E.coli CMCC(B)44103、E.coli 8099、E.coli ATCC25922、 E. sakazakii ATCC51329、C. freundii ATCC8090、E. aerogenes CMCC(B)45103、S. arizona CMCC(B)47001、P. vulgaris CMCC(B)49027等15种标准菌株分别制成适当浓度的标准菌悬 液（浓度为108?109cfu/mL)，分别划线接种到用实施例5显色培养基制成的平板上，37°C 培养18?24h。特异性实验结果见表1。
[0044] 由实验结果可知，4株E. coil 0157:H7均显示黄绿色，为阳性菌株。对于非目标 菌，菌落颜色可与目标菌E. coil 0157:H7相区分；杂菌受抑制。以上实验结果本发明的用 于检测大肠杆菌E. coil 0157 :H7的显色培养基具有较高的特异性。
[0045] 表1大肠杆菌E. coli 0157: H7显色培养基的特异性显色试验结果
【权利要求】
1. 一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每lOOOmL培养基含有琼脂15-20g、 蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化钠5-10g，其特征在于，还含有山梨醇10-20g、肌醇 4_7g、中性红0. 005-0. 03g、0 -半乳糖苷酶显色底物I 0. 05-0. 2g、0 -半乳糖苷酶显色底 物II l_3g、异丙基-D-硫代批喃半乳糖苷0. 05-0. 2g、牛胆盐l-5g、亚締酸钾l-5mg、头 孢克肟 〇? 01-0. 〇6mg。
2. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于， 3 -半乳糖苷酶显色底物I为5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -半乳糖。
3. 根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于， 5_溴-4-氯-3-吲哚-P -半乳糖在lOOOmL培养基中的含量为0. lg。
4. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于， 3 -半乳糖苷酶显色底物II为邻硝基苯-0 -D-半乳糖苷。
5. 根据权利要求4所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于，邻 硝基苯-D-半乳糖苷在1000mL培养基中的含量为2g。
6. 根据权利要求1-5任意一项所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特 征在于，山梨醇在l〇〇〇mL培养基中的含量为15g，肌醇在1000mL培养基中的含量为5g，中 性红在1000mL培养基中的含量为0. 01g。
7. 根据权利要求6所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于， 每1000mL培养基含有琼脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇 5g、中性红O.Olg、￠-半乳糖苷酶显色底物I 0. lg、￠-半乳糖苷酶显色底物Il2g、异丙 基-0 -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐1. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克月亏0. 04mg。
8. 根据权利要求6所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于， 每1000mL培养基含有琼脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇 5g、中性红O.Olg、￠-半乳糖苷酶显色底物I 0. lg、￠-半乳糖苷酶显色底物Il2g、异丙 基-0 -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐1. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克月亏0. 04mg。
【文档编号】C12Q1/04GK104388521SQ201410681697
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】金京勋 申请人:苏州嘉禧萝生物科技有限公司