专利名称：运用分子杂交－酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌检验技术，具体地讲是运用分子杂交—酶联免疫显色方法检测致病细菌，特别是坂崎肠杆菌的技术。
背景技术：
坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是革兰氏阴性细菌，属肠杆菌科肠杆菌属。1980年被命名为坂崎肠杆菌前该菌被称为产黄色素阴沟肠杆菌。是临床上很少见的病原菌，其引起的脑膜炎、败血症、坏死性小肠结肠炎在全世界范围内均有报告。并有不断增多的趋势，大多数病例发生在婴幼儿，而且病程短，在一些情况下病死率达80％。虽然坂崎肠杆菌的传染源不很清楚，但婴儿配方奶粉起到了传播媒介的作用。特别是2002年11月26日国家质检总局发布公告2002年第120号。主要内容是暂停办理美国惠氏公司生产的某些批号的配方奶粉的报检通关和相关的检验检疫手续，对已进口的相关产品进行监督销毁处理，原因是美国食品与药品管理局(FDA)在上述产品中检出坂崎肠杆菌。
发明内容
目前我国尚没有食品中和临床上检测坂崎肠杆菌的标准方法，美国FDA 2002年8月发布的坂崎肠杆菌分离计数方法，依然沿用了“三管”增菌法检测坂崎肠杆菌。需要经过前增菌、分离培养、生化鉴定等经典的检验方法检测目标菌。试验时间长，处理样品量小，而且灵敏度和特异性都相对较低。针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种运用分子杂交技术检测坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的方法。
本发明的技术方案如下1.探针设计根据坂崎肠杆菌16s和23s rRNA基因间区的DNA序列，设计6条特异性寡核苷酸探针，其序列如下。
探针序列一GCTGCTGCATTTCTCCGTAATAAGGAATGCGCGGTGTGT探针序列二CAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAA GACTTCTTC探针序列三GTAAAGAAGCAGGGTTGTCTGCGAAAGCGAAGTC探针序列四GCGAAAGCGAAGTCCCTTTCGTCTAGAGGCCCAGGACA探针序列五ACTCCGCAGGAGTTGAAGAGGTTTAACTACG探针序列六TGCAAGATACAACCCCGCAGGAGTTGAAGAGG2.PCR引物设计和靶DNA序列的扩增用PCR方法扩增待测样品中全部原核微生物的16s和23s rRNA基因间区的DNA片段，PCR引物的核苷酸序列如下。
引物序列一GCTCGTGTNGTGANATGTTGCCA引物序列二GCGATTTCYGAATGGGGRAAGGG其中N代表4种碱基中的任意一种；Y代表碱基C或T中的任意一个；R代表碱基A或G中的任意一个。
PCR反应体系中各组分构成比例如下成分 浓度 加样量PCR缓冲液 10倍 5μLMgCl220mmol/ 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L2μL引物序列二 10μmol/L2μL
dNTPs 每种10mmol/L 0.3μLDIG-dUTP 1mmol/L0.3μLDNA样品 2μL双蒸水 33.1μL总体积 50μLPCR扩增程序为1)95℃ 10min2)95℃ 30s3)55℃ 20s4)72℃ 30s5)95℃ 30s，重复5次6)95℃ 30s7)68℃ 30s8)95℃ 30s，重复25次9)72℃ 2min3.PCR扩增产物的地高辛标记按照Roche公司地高辛标记与检测试剂盒的使用说明，对从待测样品中扩增出的16s和23s rRNA基因间区DNA片段进行地高辛标记。
(1)设计特异性寡核苷酸探针，用于核酸分子杂交检测；(2)PCR扩增待测样品中全部原核微生物的16s和23s rRNA基因间区的DNA片段，然后进行地高辛标记；4.寡核苷酸探针与地高辛标记的PCR产物的分子杂交将浓度为1mmol/L的寡核苷酸探针溶液0.1μL点在尼龙膜上，在长波紫外灯下交联5-10min，然后与地高辛标记的PCR产物杂交，方法如下。
预杂交预杂交液先预热到杂交温度(50℃)，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入塑料袋中，加入预杂交液，封好口，50℃预杂交30min。
PCR扩增产物的热变性地高辛标记的PCR产物加热到95℃，保持10min，然后插入冰浴中冷却。
DNA杂交把预杂交好的尼龙膜装入塑料袋，加入变性的地高辛标记的PCR产物10μL，再加入1mL杂交液，封好口，按照Roche公司地高辛标记与检测试剂盒的使用说明，于50℃杂交1h。杂交结果通过酶联免疫显色技术显色，用肉眼观察，可发现能与坂崎肠杆菌PCR产物进行杂交的特异性探针显示出蓝色杂交斑点。
与现有技术相比，本发明的有益效果是该方法具有检测准确、特异性强的特点，可以快速、准确的鉴定特异的目标细菌。首先，避免了反复培养，节约时间；而且DNA-DNA杂交鉴定方法较生理生化的鉴定方法更为准确，不受培养条件和细菌生理状态的影响。本发明填补了使用DNA分子杂交方法进行坂崎肠杆菌检测的空白。
图1某进口品牌婴儿配方奶粉的DNA杂交结果图2某品牌出口鱼肉粉的DNA杂交结果图3某品牌进口狗咬胶的DNA杂交结果具体实施方式
实施例1样本某进口品牌婴儿配方奶粉，常规微生物培养和生化检测出坂崎肠杆菌疑似菌落。
1.DNA抽提取增菌液1mL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000r/min，离心5min，弃去上清液，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10min，补加TE缓冲液500μl，振荡混匀。加等体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，12000r/min，离心3min，吸取上清液，重复酚抽提。吸取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30min，于12000r/min离心5min。弃去上清，加70％冰乙醇振荡洗涤一次，室温下12000r/min，离心5min，弃上清。加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR扩增PCR反应混合物成分成分 浓度 加样量PCR缓冲液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL0.3μL引物序列一10μmol/L 2μL引物序列二10μmol/L 2μLdNTPs 每种10mmol/L 0.3μLDIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA样品 2μL双蒸水 33.1μL总体积 50μLPCR扩增条件1)95℃ 10min2)95℃ 30s3)55℃ 20s4)72℃ 30s5)95℃ 30s，重复5次6)95℃ 30s7)68℃ 30s8)95℃ 30s，重复25次9)72℃ 2min3.靶DNA扩增产物与尼龙膜上探针的杂交预杂交预杂交液先预热到杂交温度(50℃)，把分别点入寡核苷酸探针序列一、二、三、四的尼龙膜放入塑料袋中，加入预杂交液，封好口，50℃预杂交30min。
PCR扩增产物的热变性地高辛标记的PCR产物加热到95℃，保持10min，然后插入冰浴中冷却。
DNA杂交把预杂交好的尼龙膜装入塑料袋，加入变性的地高辛标记的PCR产物10μL，再加入1mL杂交液，封好口，按照Roche公司地高辛标记与检测试剂盒的使用说明，于50℃杂交1h。杂交结果通过酶联免疫方法显色。结果表明，尼龙膜上的sak1、sak2、sak3和sak4处均深为蓝色斑点，此为阳性杂交结果，表明样品中含有坂崎肠杆菌，而阴性对照样品未出现蓝色斑点(图1)。
图1中的各个点分别是(1)阳性对照(2)探针序列一(3)探针序列二
(4)探针序列三(5)探针序列四(6)阴性对照待测样品经常规微生物培养，使用生化检测仪进行检测，结果表明被测样品98％为坂崎肠杆菌，其中一个菌株命名为fps6。这说明用探针序列一、二、三、四对样品中坂崎肠杆菌的检测结果是可信的。
实施例2样本某品牌出口鱼肉粉，常规生化法检测出坂崎肠杆菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例1。
2.PCR扩增PCR反应混合物的成分同实施例1。
PCR扩增条件1)95℃ 10min2)95℃ 30s3)55℃ 20s4)72℃ 30s5)95℃ 30s，重复5次6)95℃ 30s7)72℃ 30s8)95℃ 30s，重复25次9)72℃ 2min3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交方法同实施例1。所用寡核苷酸探针为序列三、四、五、六。杂交结果表明，尼龙膜上的sak3、sak4、sak5和sak6均出现深蓝色斑点，此为阳性杂交结果，表明样品中含有坂崎肠杆菌，而阴性对照样品未出现蓝色斑点(图2)。
图2中的各个点分别是(1)阳性对照(2)探针序列三(3)探针序列四(4)探针序列五(5)探针序列六(6)阴性对照待测样品经常规微生物培养，使用生化检测仪进行检测，结果表明被测样品100％为坂崎肠杆菌，其中一个菌株命名为fis5。这说明用探针序列三、四、五、六对样品中坂崎肠杆菌的检测结果是可信的。
实施例3样品某品牌进口狗咬胶，常规生化检测出坂崎肠杆菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例1。
2.PCR扩增PCR反应混合物的成分同实施例1。
PCR扩增条件同实施例2。
3.靶DNA扩增产物与尼龙膜上探针的杂交方法同实施例1。所用寡核苷酸探针为序列一、二、三、四。杂交结果表明，尼龙膜上的sak1、sak2、sak3、sak4均无蓝色斑点产生，此为阴性杂交结果，表明样品中不含有坂崎肠杆菌(图3)。
图3中的各个点分别是(1)阳性对照(2)探针序列一(3)探针序列二(4)探针序列三(5)探针序列四(6)阴性对照待测样品经常规微生物培养，使用生化检测仪进行检测，结果表明被测样品100％为团聚肠杆菌，其中一个菌株命名为dot3。这进一步说明，用探针序列一、二、三、四对样品中坂崎肠杆菌的检测结果是可信的。
此外，还进行了肠杆菌属和肠杆菌科道的其他细菌的对照平行实验，发现阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、团聚肠杆菌、大肠杆菌、蜂房哈夫尼亚氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、宋内氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等均不产生杂交斑点。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法<130>041106<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>1gctgctgcat ttctccgtaa taaggaatgc gcggtgtgt 39<210>2<211>36<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<223>
<400>2cagagtctct caaactcgca gcacgaagac ttcttc36
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<221>misc_feature<222>(1)..(38)<223>
<400>4gcgaaagcga agtccctttc gtctagaggc ccaggaca 38<210>5<211>31<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>
<400>5actccgcagg agttgaagag gtttaactac g 31<210>6<211>32<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>
<400>6tgcaagatac aaccccgcag gagttgaaga gg32
<210>7<211>23<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(23)<223>
<400>7gctcgtgtag tgacatgttg cca 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(23)<223>
<400>8gcgatttctg aatggggcaa ggg 2权利要求
1.一种运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于，所设计的特异性寡核苷酸探针序列如下探针序列一GCTGCTGCATTTCTCCGTAATAAGGAATGCGCGGTGTGT探针序列二CAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAAGACTTCTTC探针序列三GTAAAGAAGCAGGGTTGTCTGCGAAAGCGAAGTC探针序列四GCGAAAGCGAAGTCCCTTTCGTCTAGAGGCCCAGGACA探针序列五ACTCCGCAGGAGTTGAAGAGGTTTAACTACG探针序列六TGCAAGATACAACCCCGCAGGAGTTGAAGAGG
2.根据权利要求1所述的运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于，用PCR方法扩增待测样品中全部原核微生物的16s和23s rRNA基因间区的DNA片段，然后对扩增片段进行地高辛标记，PCR引物的核苷酸序列如下引物序列一GCTCGTGTNGTGANATGTTGCCA引物序列二GCGATTTCYGAATGGGGRAAGGG其中N代表4种碱基中的任意一种；Y代表碱基C或T中的任意一个；R代表碱基A或G中的任意一个。
3.根据权利要求1所述的运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于，还包括由上述6条探针序列衍生出来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反义互补序列，或它们的变体，或它们的部分序列，或由上述几条序列的全部或部分拼接的序列。
4.根据权利要求1所述的运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)设计特异性寡核苷酸探针，用于核酸分子杂交检测；(2)PCR扩增待测样品中全部原核微生物的16s和23s rRNA基因间区的DNA片段，然后进行地高辛标记；(3)将寡核苷酸探针和地高辛标记的PCR产物进行分子杂交；(4)杂交结果通过酶联免疫显色技术显色；(5)显色结果用肉眼观察，可发现对坂崎肠杆菌进行杂交的特异性探针显色。
5.根据权利要求4所述的的运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于PCR反应体系中各组分构成比例如下成分 浓度 加样量PCR缓冲液10倍 5μLMgCl220mmol/ 5μLTaq DNA聚合酶5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L2μL引物序列 10μmol/L2μLdNTPs每种10mmol/L 0.3μLDIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA样品 2μL双蒸水33.1μL总体积50μL
6.根据权利要求4所述的的运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于，PCR方法中扩增程序为1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)95℃30s，重复5次6)95℃30s7)68℃30s8)95℃30s，重复25次9)72℃2min
7.根据权利要求4所述的一种运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于，将浓度为1mmol/L的寡核苷酸探针溶液0.1μL点在带有正电荷的尼龙膜上，在长波紫外灯下交联5-10min。
8.根据权利要求4所述的的一种运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于，PCR产物的地高辛标记及其与寡核苷酸探针的杂交，方法如下*预杂交预杂交液先预热到杂交温度(50℃)，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入塑料袋中，加入预杂交液，封好口，50℃预杂交30min。*PCR扩增产物的热变性地高辛标记的PCR产物加热到95℃，10min，然后插入冰浴中冷却。*地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜上的探针DNA杂交把预杂交好的尼龙膜装入塑料袋，加入变性的地高辛标记的PCR产物10μL，再加入1mL杂交液，封好口，50℃杂交1h，温和搅动。
9.根据权利要求1所述的的运用分子杂交—酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌的方法，其特征在于，由本发明设计的6条专一性寡核苷酸探针在基因芯片检验坂崎肠杆菌中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种运用分子杂交－酶联免疫显色技术检测坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的方法，属于细菌检测技术，特别是运用分子杂交方法检测致病细菌的技术。其技术方案是，用PCR方法扩增待测细菌的16s和23s rRNA基因间区序列，并用地高辛标记PCR产物，然后与设计的一组特异性寡核苷酸探针杂交，经酶联免疫显色后，可以精确地判断待测样品中是否含有坂崎肠杆菌。该方法的优点是，省去了重复的细菌培养筛选环节，节约时间；分子杂交鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
文档编号G01N33/535GK1635155SQ20041007270
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者黄熙泰, 刘寅, 蔡小宁, 杨晓川 申请人:南开大学