专利名称：Hiv tat-cd4杂合分子及其使用方法
技术领域：
本发明总体上涉及含有HIV Tat多肽和CD4分子的至少一部分(例如，CD4最小 组件、CD4模拟物等)的免疫原性组合物。本文所述的免疫原性组合物结合于HIVEnv 蛋白(例如单体或低聚的gpl20、 gpl40或gpl60)，并引起Env蛋白中的构象变化， 从而暴露出保守的、隐藏的功能性表位。本发明还涉及采用这些免疫原性组合物作 为^ HIV Env多肽的单分子或双分子复合物的一部分来引发对众多HIV亚型的免疫发明背景人免疫缺陷病毒(HIV-1，也称为HTLV-III、 LAV或HTLV-III/LAV)是一种获得性 免疫缺陷综合征(AIDS)及相关病症的病原。(参见例如Barre-Sinoussi等，(1983) 220:868-871; Gallo等，(1984) &/e"ce 224:500-503; Levy等，(1984)&/e"ce 225:840-842; Siegal等，(1981) J她d 305:1439-1444; Guyader等，(1987)326:662-669)。HIV-1、 HIV-2和SIV包膜蛋白是一种约160kd的糖蛋白(gp160)。在宿主细胞受 到病毒感染期间，gpl60经宿主细胞蛋白酶切割形成gpl20和整合膜蛋白gp41。gp41 部分锚定在病毒体的双层膜中，而gpl20片段则突出于周围环境中。gpl20和gp41更为共价地连接，游离的gpl20可从病毒体的表面释放出来并感染细胞。此外，--旦结合到Eiw多肽的受体(即CD4)上，Eiw多肽发生明显的结构重排。在该构象变化 之后，暴露出CCR5或其它趋化因子结合的共同受体结合位点。此趋化因子受体结 合位点的暴露反过来介导了病毒进入宿主细胞中。参见例如Wyatt， R.等，(1998) tV","m 393:705-711; Kwong， R等，(1998) Ato"w 393:648-659。Env似乎是诱导对HIV的体液免疫应答的主要靶标。然而，已知抗gpl20的抗体 通常不具有广泛的抗不同HIV株的抗体应答，且单独的gpl20不会诱导产生广泛的 中和抗体。参见例如Javaherian， K.等，(1989)尸rac. Ato/. Jc^/. 86:6786-6772; Matsushita, M.等，(1988) / F ra/. 62:2107-2144; Putney， S.等，(1986) Sc/ewce 234:1392-1395; Rushe， J. R.等，(1988) ZVoc.淑Jcac/. 园85: 3198-3202; Matthews, T. (1986)尸rac. Ate/. Jcad Sc/. 83:9709-9713; Nara, P丄.等，(1988) J. F/ra/. 62:2622-2628; Palker， T丄等，(1988) ZVoc. A^/. ^cad Sc/. 85:1932-1936)。并且，虽然中和抗体通常是在人体中发生HIV感染的情况下产生，这些抗体不能 提供持久的抗病毒效果，其部分原因可能在于"中和逃避"病毒突变体的产生以及 S致病相关的宿主免疫系统总体上的降低。参见例如Barre-Sinoussi， F.等，(1983) W置e 220:868-871; Robert隱Guroff， M.等，(1985) Atowre (伦敦)316:72-74; Weis， R.等，(1985) Atoi^e(伦敦)316:69-72; Weis， R.等，(1986) A^we (伦敦)324:572-575。 虽然如此，仍然广为支持初期HIV-1暴露后存在的预先存在的中和抗体可能具有保 护作用，例如通过与侵入的病毒体接触和降低或防止它们对耙细胞的感染性并防止 体内病毒从细胞到细胞的传播。参见例如Hu等，(1992)Sc/e"ce 255:456-459; Burton， D.， R.和Montefiori, D.(1997) AKW ll(增刊A): 587-598; Montefiori和Evans (1999) J/AS^m. //ww. 15(8):689-698; Bolognesi， D.R等，(1994) J朋./"/. M^/. 8:603-611; Haynes， B.， F.等，(1996) Sc,e"ce; 271:324-328。已鉴别了多类可能有效的中和抗体。例如，已从大部分受感染的个体中鉴别出了 千扰gpl20和CD4结合的众多活性抗体的亚型。参见例如Kang，C.-Y.等，(1991) /Voc. Ato/. ^cad 88:6171-6175 ; McDougal ， J.S.等，(1986) 乂 /7"ww"0/.137:2937-2944。单克隆抗体，例如IgGlbl2、2G12(Mo等，(1997)J :6869-6874)、 PA14 (Trkola等，(2001) /K/ra/. 75(2):579-88)以及2F5均具有中和效果。还可参见， Trkola等，(1995) / Wra/. 69:6609-6617; D，Sousa等，(1997) J./"/e". Zto. 175:1062-1075。确信在CD4结合于Env之后，其它抗体也可结合于趋化因子受体结合区。参 见例如Thali等，(1993) / Wra/. 67:3978-3988)。此外，为了产生针对仅在结合CD4 后暴露的CD4结合位点区的抗体，多个研究组已尝试通过给予Erw与CD4(例如可 溶性CD4，称为"sCD4")结合的复合物或Env与CD4模拟物(例如CD4M33)结合 的复合物来产生中和抗体。参见例如Martin等，(2003) Ato说'o&c/mo/. 21(1):71-76。此外，WO 04/037847中描述了可用于产生免疫应答的Env-CD4复合物。可推测， 通过靶向结合于CD4后暴露在Env蛋白中的构象表位，Env-CD4(sCD4)复合物能够 诱导众多的中和抗体。然而，如果将sCD4与佐剂一起给予的话，需要认真考虑发生 自身免疫应答的可能性。此外，WO 04/037847中描述了杂交Env-CD4多肽。除了上述的进展以外，仍然需要例如在作为疫苗给药时，能够在对象中引发针对 多种HIV株和亚型的免疫应答的其它分子(例如中和和/或保护性抗体)。本发明通过 提供含有HIV Tat多肽和CD4分子的免疫原性组合物来解决这些和其它问题，所述 CD4分子作为还含有HIV Env多肽的单分子复合物或者作为含有HIV Tat/CD4小蛋 l'l部分和Env部分的双分子复合物的 一部分。发明概述本发明通过提供含有CD4多肽或CD4样分子及骨架多肽的杂合分子来解决这些 和其它问题。在一个优选的实施方式中，所述骨架多肽是侵袭素多肽或其片段。在 另--个优选的实施方式中，所述骨架多肽是Tat多肽或其片段。优选地，未产生对 Eiw结合组分(例如，CD4分子)的免疫应答。然而，杂合分子结合Env从而导致Env 构象改变并使Env表位暴露，因而更容易产生该表位的中和抗体。因此，本文所述 的杂合分子可使得用于抗CD4-Env的有用抗体得以产生(包括中和抗体和其它免疫 应答)，同时降低或避免不为所需的对CD4非Env结合区的免疫应答。还提供了Env 与本文所述杂合分子的复合物，以及抗这些分子的抗体。因此，在一方面，本发明包括含有CD4蛋白或CD4模拟物和衍生自HIV Tat蛋 白的多肽的杂合体。在某些实施方式中，所述CD4蛋白包含CD4最小组件，而所述 Tat蛋白包含衍生自一种或多种全长Tat蛋白的多肽。在其它实施方式中，所述Tat 多肽包含HIV-lTat蛋白的片段(例如，任何HIV-lTat蛋白的86个氨基酸的片段)。 所述CD4最小组件优选是人CD4序列。在某些实施方式中，所述杂合分子还含有一 种或多种其它多肽，例如免疫调节多肽(细胞因子等)，和域一种或多种Eiw多肽。在另一方面，本发明包括本文所述的杂合分子和HIVEnv多肽的复合物。优选地， 形成所述复合物以使得隐藏表位在Env多肽中暴露。可通过以下方式使得HIV Eiw 多肽和杂合分子复合交联(例如使用甲醛)；使用固定剂(例如福尔马林)；和/或在适 宜的条件下自发地复合。在另一方面，本发明包括编码本文所述杂合分子一个或多个部分的多核苷酸(例 如，操作性连接的编码CD4和Tat的多核苷酸序列)。所述编码CD4多肽的多核苷酸 可以是毗连或非毗连的，此外还可位于一种或多种Tat多肽编码序列的5'端、3'端和 /或内部(嵌入其中)。所述Env多肽也可以编码所述Env多肽的多核苷酸的形式提供， 作为免疫原性组合物的一部分。在一些优选的实施方式中，本发明的多核苷酸被修饰(例如，密码子优化)以提高 在哺乳动物细胞体内(为给予本发明的多核酸)或体外(为制造本发明的多肽)的表达。任选地，其它序列可包含在本文所述的融合蛋白内。此外，当文中所述的任何多 核苷酸被表达时，所述杂合体融合蛋白优选与HIVEnv多肽复合以使隐藏表位在Env 多肽中暴露。再在另一方面，本发明包括含有任何本文所述分子(例如，多核苷酸和/或多肽)的 免疫原性组合物。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物还含有一种或多种佐剂。在还有的另一方面中，本发明包括含有任何本文所述的分子(例如，多核苷酸 和/或多肽)的细胞。当用作多核苷酸时，所述序列优选操作性连接于与在所选细 胞中表达相容的控制元件。所述细胞可为例如哺乳动物细胞(例如BHK、 VERO、 HT1080、 293、 RD、 COS-7和CHO细胞)；昆虫细胞(例如粉纹夜蛾(7Wc/^/7/M^m')(Tn5)或SW细胞)；细菌细胞；酵母细胞；植物细胞；抗原递呈细胞；选自以 下的淋巴细胞巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、干细胞或 其祖细胞；原代细胞；无限增殖细胞；禾卩/或肿瘤衍生的细胞。在另一方面，本发明包括用于哺乳动物对象中的载体，其中所述载体包含操 作性连接于与对象中表达相容的控制元件的任何本文所述的多核苷酸。再在另一方面，本发明包括一种产生结合于HIV Env隐藏表位的抗体的方法， 所述方法包括如下步骤在允许对象中产生抗体(例如中和抗体、单克隆抗体、多克隆抗体)的条件下，将本文所述的任何杂合分子(例如，融合蛋白)给予对象。 在某些实施方式中，随后对所述对象中产生的抗体进行分离。 在进一步的方面，本发明包括一种产生任何本文所述的杂合体融合蛋白的方法，所述方法包括在适于产生所述融合蛋白的条件下，孵育任何本文所述的细 胞。在进一步的方面，本本发明包括一种产生本文所述的任何杂合分子与HIV Env 的复合物的方法，所述方法包括在适于产生融合蛋白与HIVErw的复合物的条 件下，孵育本文所述的Tat-CD4杂合分子(或编码所述分子的多核苷酸)。再在另 -方面，本发明包括一种在对象中诱导免疫应答(例如，体液应答如中 和抗体应答和/或细胞免疫应答)的方法，所述方法包括给予对象其量足以在所 述对象中诱导免疫应答(例如，针对隐藏Env表位的应答)的任一本文所述的分子 (例如，多核苷酸，多肽和/或免疫原性组合物)。在某些实施方式中，所述方法包 括离体转染细胞并将该转染细胞重新引入所述对象中。在其它实施方式中，所 述方法包括，例如，在与所述表达盒在所述对象中的表达和多肽在所述对象中的 产生相容的条件下，通过将任一本文所述的多核苷酸和/或载体递送入所述对象而 对所述对象进行DNA免疫。在其它实施方式中，所述方法包括(a)在初免步骤中给予包含任一本文所述的多核苷酸的第一组合物；禾n(b)以足以在对象中诱导免疫应答的量给予包含任一本文所述的多肽的第二组合物作为增强剂。在本文所述 的任一方法中，所述载体可包含非病毒载体或病毒载体，如逆转录病毒载体(慢 病毒载体)。此外，可采用例如微粒运载体(例如包被在金或钩微粒上，并可使用 基因枪将所述包被的颗粒递送入所述对象)或包封在脂质体制剂中来引入所述多 核苷酸和/或载体。在本文所述的任何方法中，所述对象可为哺乳动物，例如人或非人哺乳动物，所述引入可通过如下方式进行肌内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服和/或静脉内方式。本发明包括以下实施方式1. 一种杂合分子组合物，其含有骨架多肽和CD4小蛋白，当所述杂合分子结合 HIV Erw多肽时所述杂合分子诱导所述HIV Env多肽发生构象改变。2. 实施方式1所述的组合物，，其中，所述骨架多肽选自侵袭素或tat多肽. 2A.实施方式1或2所述的组合物，其中，所述骨架多肽是异源多肽。2B.实施方式1或2所述的组合物，其中，所述骨架多肽是同源(homolgous)多肽。3. —种杂合分子组合物，其含有HIVTat多肽或其片段；和CD4小蛋白，其中， 所述杂合分子结合HIVEnv多肽。4. 如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中，所述CD4小蛋白是含有CD4 的氨基酸残基15-85的CD4最小组件。 5. 如实施方式1-3中任一项所述的组合物，其中，所述Tat多肽包括全长Tat多 肽或其变体。6. 如实施方式5所述的组合物，其中，所述Tat多肽是全长Tat多肽或其变体的 片段，其包含Tat蛋白氨基酸残基1-86，根据SEQIDNO:2或其变体编号。7. 如实施方式1-6中任一项所述的组合物，其还含有一种或多种其它异源多肽。8. 如实施方式7所述的组合物，其中，所述一种或多种其它异源多肽选自病毒多 肽、免疫调节多肽或细菌多肽。9. 如实施方式8所述的组合物，其中，所述其它异源多肽是病毒多肽，所述病毒 是HIV。10. 如实施方式1-9中任一项所述的组合物，其中，所述HIVtat多肽或其片段、CD4小蛋白和其它异源多肽中的一种或多种以编码所述多肽、其片段或小蛋白的多 核苷酸提供。11. 一种免疫原性组合物，其含有如实施方式1-9中任一项所述的组合物且还包 含HIV Env多肽。12. 如实施方式11所述的免疫原性组合物，其中，所述Env多肽包括gp120。13. 如实施方式11所述的免疫原性组合物，其中，所述Env多肽包括低聚gp 140。14. 如实施方式11所述的免疫原性组合物，其中，通过将实施方式1-10中任一 所述的组合物与Env交联而将实施方式1-10中任一项所述的组合物复合。15. 如实施方式14所述的免疫原性组合物，其中，如实施方式1-13中任一项所 述的组合物与Eiw用固定剂交联。16. 如实施方式15所述的免疫原性组合物，其中，所述固定剂包括甲醛。17. 如实施方式15所述的免疫原性组合物，其中，所述固定剂包括戊二醛 (gluteraldehyde)。18. 如实施方式11所述的免疫原性组合物，其中，如实施方式1-13中任一项所 述的组合物与Env多肽自发形成复合物。19. 如实施方式11所述的免疫原性组合物，其中，如实施方式1-13中任一项所 述的组合物包含CD4最小组件-Tat融合蛋白。20. 如实施方式11-19中任一项所述的免疫原性组合物，其还含有佐剂。21. —种多核苷酸，其编码HIV tat多肽或其片段、CD4小蛋白和其它异源多肽 中的至少一种。22. 如实施方式21所述的多核苷酸，其还编码Eiw多肽。23. —种细胞，其含有实施方式21或22所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸 操作性连接于与在所选细胞中表达相容的控制元件。24. 如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。25. 如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞选自BHK、 VERO、 HT1080、 293、 RD、 COS-7或CHO细胞。26. 如实施方式24所述的细胞，其中，所述细胞是CHO细胞。27. 如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是昆虫细胞。28. 如实施方式27所述的细胞，其中，所述细胞是粉纹夜蛾(7Hctop/認'am')(Tn5) 或Sf9昆虫。29.如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是细菌细胞。30.如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是酵母细胞。31.如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是植物细胞。32.如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是抗原递呈细胞。33.如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是选自以下的淋巴细胞巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、干细胞或其祖细胞。34. 如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是原代细胞。35. 如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是无限增殖细胞。36. 如实施方式23所述的细胞，其中，所述细胞是肿瘤衍生的细胞。37. --种用于哺乳动物对象的基因递送载体，其包含用于所述对象的合适的基因 递送载体，其中所述载体包括如实施方式21或22所述的多核苷酸，且其中所述多 核苷酸操作性连接于与在所述对象中表达所述多核苷酸相容的控制元件。38. —种制备结合于HIVEiw功能性表位的抗体的方法，所述方法包括以下步骤 在允许在所述对象中产生抗体的条件下给予该对象如实施方式11-20中任一项所述 的免疫原性组合物。39. 如实施方式38所述的方法，还包括分离所述对象中产生的抗体的步骤。40. 如实施方式38或39所述的方法，其中，所述抗体是中和抗体。41. 如实施方式38或39所述的方法，其中，所述抗体引起ADCC活性。42. 如实施方式38-41中任一项所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。43. 如实施方式38-42中任一项所述的方法，其中，所述抗体是多克隆抗体。44. 一种制备含有与CD4蛋白复合的HIVEnv多肽序列的多肽的方法，所述方法 包括在产生所述多肽的条件下孵育如实施方式23-36中任一项所述的细胞。45. —种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予其量足以在所述对象 中诱导免疫应答的如实施方式11-20中任一项所述的组合物。46. —种对对象进行DNA免疫的方法，所述方法包括在与在所述对象中表达所 述表达盒相容的条件下在所述对象中引入如实施方式37所述的基因递送载体。47.如实施方式46所述的方法，其中，所述基因递送载体是非病毒载体。48.如实施方式46所述的方法，其中，所述载体用微粒运载体递送。49.如实施方式48所述的方法，其中，所述载体包被在金或钨微粒上，并使用基因枪将所述包被的颗粒递送入所述对象。50.如实施方式46所述的方法，其中，所述载体包封在脂质体制剂中。51.如实施方式46所述的方法，其中，所述载体是病毒载体。52.如实施方式51所述的方法，其中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。53.如实施方式51所述的方法，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。54.如实施方式46所述的方法，其中，所述对象是哺乳动物。55.如实施方式54所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。56.-种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括在允许所述多核苷酸表达并产生所述多肽的条件下用实施方式37所述的基因递送载体转染所述对象的细胞，从而引起对所述多肽的免疫应答。57. 如实施方式56所述的方法，其中，所述载体是非病毒载体。58. 如实施方式57所述的方法，其中，所述载体用微粒运载体递送。59. 如实施方式58所述的方法，其中，所述载体包被在金或鸨微粒上，并使用基 因枪将所述包被的颗粒递送入所述对象。60. 如实施方式59所述的方法，其中，所述载体包封在脂质体制剂中。61. 如实施方式56所述的方法，其中，所述载体是病毒载体。62. 如实施方式61所述的方法，其中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。63. 如实施方式62所述的方法，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。64. 如实施方式56所述的方法，其中，所述对象是哺乳动物。65. 如实施方式64所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。66. 如实施方式56所述的方法，其中，所述转染离体进行且所述转染的细胞被重新引入所述对象。67. 如实施方式56所述的方法，其中，所述转染在所述对象体内进行。68. 如实施方式56所述的方法，其中，所述免疫应答是体液免疫应答。69. 如实施方式56所述的方法，其中，所述免疫应答是细胞免疫应答。70. 如实施方式56-69中任一项所述的方法，其中，所述基因递送载体通过肌内、 粘膜内、鼻内、皮下、皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内方式给予。71. —种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括(a) 在初免步骤中给予第一组合物，其中所述第一组合物包含如实施方式21或 22所述的多核苷酸；和(b) 以足以在所述对象中诱导免疫应答的量给予第二组合物作为增强剂，其中所 述第——:组合物包含如实施方式1-20中任一项所述的组合物。72. 如实施方式71所述的方法，其中，所述第一组合物或第二组合物还含有佐剂。73. 如实施方式71所述的方法，其中，所述第一组合物还含有编码HIV Gag多 肽的序列。74. 如实施方式71所述的方法，其中，所述第二组合物还含有HIVGag多肽。 通过本文的揭示，本发明的这些和其它实施方式对于本领域的技术人员而言将会是很容易理解的。附图简述图l描述了人CD4蛋白的基本氨基酸序列(GenBank登录号NP—000607) (SEQ ID NO: 1)。图2描述了 B亚型菌株HXB2的示例性H1V-1 Tat蛋白的基本氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。图3描述了 SF162的另一种示例性HIV-1 Tat蛋白的基本氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。图4是描述涉及env结合的CD4小蛋白的示意图。所示CD4最小组件(深灰色) 对应于SEQ ID NO: 1的第15-85号残基，其通过Cysl6和Cys84间存在的二硫键获 得结构稳定化。图5是描述本文所述示例性CD4最小组件-Tat杂合分子的示意图。所示第一 CD4 最小组件Tat杂合分子从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-20， CD4 (SEQID NO: l)的残基15-85(CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基30-86。所示第二杂合分子 从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-30， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基40-86。所示第三杂合分子从N末端到C末端方 向包括Tat蛋白的残基1-40， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)； 和Tat蛋白的残基50-86。所示第四杂合分子从N末端到C末端方向包括Tat蛋白 的残基1-50， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基 60-86。图6描述了 4种示例性CD4最小组件-Tat杂合分子的氨基酸序列。这些杂合分子 的Tat组分衍生自HIV bm隔离群。所示杂合分子的第一氨基酸序列(SEQ ID NO: 4) 从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-20， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基30-86。所示杂合分子的第二氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-30， CD4 (SEQ ID NO: l)的残 基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基40-86。所示杂合分子的第三氨基酸序 列(SEQ ID NO: 6)从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1 -40， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基50-86。所示杂合分子的第四氨基 酸序列(SEQIDNO:7)从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-50， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基60-86。图7描述了 4种示例性CD4最小组件-Tat杂合分子的氨基酸序列。这些杂合分子 的Tat组分衍生自HIV SF 162隔离群。所示杂合分子的第一氨基酸序列(SEQ ID NO: 8)从N术端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-20， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基30-86。所示杂合分子的第二氨基酸序列(SEQ ID NO: 9)从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-30， CD4 (SEQ ID NO: l)的残 基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基40-86。所示杂合分子的第三氨基酸序 列(SEQ ID NO: 10)从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-40， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基50-86。所示杂合分子的第四 氨基酸序列(SEQIDNO: ll)从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基1-50， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基60-86。图8描述了来自HIVbru隔离群的Tat蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)与来自 HIV SF162隔离群的Tat蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)的比对。图9描述了各种Tat-CD4融合构建物的表达结果。
发明详述除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员熟知的蛋白质化学、病 毒免疫生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。这些技术在文献中有全面的说明。参见例如T.E.Creighton的tf歪^廣，錄賴/〃分f特丝;；f7V^e/".' 5YrM"wes 她/ecw/flr /VopeWe51」(W.H.Freeman and Company, 1993); Nelson L.M.和Jerome H.K.的(f分f J^激方兹0/Z/r贵够》^//F/Woco/s /" M"/zo^ /" Mo/ecw/wMW/c/"e;，第17巻，1999; Sambrook等，(f分f克摩,实验皇手U fMo/ecw/or C7om'"gv J Z^6ora/or少(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); F.M.Ausubel等的(f分f生激^观,方兹JVCwr"W尸rotoco/5 /" Mo/ecw/ar历o/og^ ， Greene Publishing Associates & Wiley Interscience New York;禾口 Lipkowitz禾卩Boyd 的祭遂》Wev/ews Comp"tat""fl/ C/zem/Wr^)，第1巻隱现刊(Wiley-VCH， New York, New York, 1999)。必须注意的是在本说明书和所附的权利要求书中所用的单数形式"一个"、 " -种"和"所述"包括所涉及对象的复数，除非该内容清楚地另有说明。因此， 例如作为参考"一个多肽"包括两个或多个多肽的混合物等。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，不论在上文中或下文中，均以其 全文作为参考纳入本文。定义在本发明的描述中使用了以下术语，这些术语将具有如下所述的定义。 术语"多肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的任意聚 合物。该术语包括肽、寡肽、二聚体、多聚体等。这些多肽可衍生自天然来源或 可为合成或重组产生的。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、 磷酸化等。本文所定义的多肽通常由20种天然氨基酸组成Ala(A)、 Arg(R)、 Asn (N)、 Asp(D)、 Cys(C)、 Gln(Q)、 Glu (E)、 Gly (G)、 His (H)、 lie (1)、 Leu (L)、 Lys (K)、 Met(M)、 Phe(F)、 Pro(P)、 Ser (S)、 Thr (T)、 Trp (W)、 Tyr (Y)和Val (V)，也可包括任何多种已知氨基酸类似物，不论是天然存在的或是合成的类似物，例如但 不限于高异亮氨酸、氮亮氨酸(asaleucine)、 2-(亚甲基环丙基)甘氨酸、S-甲基半 胱氨酸、S-(丙烯-l-基)半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、高精氨酸、3-(3-羧基苯基)丙氨酸、环己基丙氨酸、含羞草氨酸、六氢吡啶羧酸、 4-甲基谷氨酸、刀豆氨酸、2,3-二氨基丙酸等。在下文中对可用于本发明的多肽 因子的其它例子进行说明。多肽或蛋白质的"几何形状"、"结构"或"三级结构"是指该蛋白质的整体三维结构。如本文所述，可通过例如以下的方法来确定所述几何形状晶体学研究、或者采用基于构成一级结构和二级结构的氨基酸间相互作用来预测几何形 状的各种程序或算法。"野生型"或"天然"多肽、多肽试剂或多肽药物是指天然存在的多肽序列， 及其相应的二级结构。"分离的"或"纯化的"蛋白质或多肽是一种从整个有机 体中分离和分立出来的蛋白质，在该有机体中所述蛋白质本质上是正常地结合 的。显而易见，该术语表示了各种纯度水平的蛋白质。典型的含纯化蛋白的组合物应是所述组合物中全部蛋白质中的至少约35%，优选至少约40-50%，更优选 至少约75-85%，最优选至少约90%或更多是所讨论的蛋白质。术语"CD4小蛋白"、"CD4最小组件"、"CD4模拟物"和"小CD4蛋白"可互 换使用，表示与env相互反应的任何多肽，优选由此暴露出CD4中或邻近CD4的功 能性表位(例如隐藏表位)和/或趋化因子受体或其它关键结合位点。因此，CD小蛋白 n丁小fCD4片段的全长，包括截短和缺失。此外，该术语包括了 CD4片段的功能和 结构同源物，即暴露Env蛋白上的隐藏表位的多肽。将Maddon等，(1985) CW/42:93; 和Littman等，(1988) Ce〃 55:541)中的人CD4的氨基酸序列纳入本文，并示于
图1 中(SEQIDNO: 1)。此外，该术语包括CD4片段的功能和结构同源物，即暴露Env 蛋卩]h的隐藏表位的模拟物和/或多肽。参见例如Martin等，(2003) 说'ofec/ . 21(1):71-76; Vita等，(1998)说'o/w me^ 47(1):93-100; Vita等，(1999)尸rac.淑/i^固96(23):1309卜13096。"骨架多肽"在文中包括以模拟天然CD4结合于erw时发生的构象改变的整体 构型将最小CD4分子呈递给Env的多肽。采用这种方式，含CD4最小组件的杂合分 子与Env的结合被增强，同时减弱了不希望的对CD4非Erw结合区的免疫应答。除 了提供CD4样结构(或骨架)，骨架多肽还可赋予本文所述的杂合分子其它功能。骨 架组分的其它功能包括但不限于免疫原性、佐剂性和/或免疫调节特性。通过用精 通本领域的技术人员已知的并如文中所述的方法检索结构数据库可鉴定与天然CD4
结构相似的蛋白质。也可参见国际申请PCT/US05/022801。骨架多肽可以是同源的(含 有单一多肽的序列)或异源的(含有一种以上多肽的序列)。骨架多肽可含有毗连或非 毗连的、天然产生的或人工的序列，只要掺有它们的杂合分子在杂合分子结合erw 时能够诱导env发生构象改变，从而暴露用于诱导例如防止或抑制HIV感染的中和 抗体的功能性表位即可。"Tat多肽"是指衍生自病毒反式激活(Tat)蛋白，优选衍生自HIV Tat的分子。 HIV Tat蛋白是长度通常在约86-101个残基之间的小蛋白质，已显示其对HIV感染 和未感染的细胞有许多功效。参见，例如，Opi等，(2002)/所o/. CAe肌277(39): 35915-35919。 Tat蛋白包括两个功能性区域， 一个是富含半胱氨酸(从约氨基酸20到氨基酸 31)的区域，另一个是碱性(从约氨基酸48到氨基酸47)区域。参见，例如，Jeang等， (1999) J.肌o/. C/zem. 274:28837-28840。对于本领域的一般技术人员显而易见的是， 來fl不同菌株的Tat蛋白在全长以及特定残基上可能与SEQ ID NO:2和3所示的示 例性Tat序列不同。来自任何隔离群的任何Tat蛋白可以方便地与本文所示的以及本 领域"知的序列进行比对，以确定相应的残基。文中，tat多肽包括人工造成或天然 产生的本文所述tat的删除、平截和其它变体。可根据任何数量的特性，例如它们作 为骨架的能力，来选择所述杂合分子的Tat多肽部分，从而以模拟CD4的整体构型 的方式将CD4分子呈递给Env，而无需考虑所用Tat多肽的长度。"Erw多肽"是指衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIVEiw的分子。HIV-1的包膜 蛋^是-1中约160 kd的糖蛋白(gp160)。在宿主细胞受到病毒感染期间，gpl60经宿 k细胞蛋白酶切割形成gpl20和整合膜蛋白gp41。 gp41部分锚定于(和跨越)病毒体 的双层膜，而gpl20片段则突出于周围环境中。由于gpl20和gp41间没有共价连接， 因此游离的gpl20可从病毒体表面释放出来，并感染细胞。Env多肽还可包括gpl40 多肽。Env多肽可作为单体、二聚体或多聚体存在。"gpl20多肽"是指衍生自Erw多肽的gpl20区的分子。所述gpl20多肽优选衍 生自HIVEnv。gp120的基本氨基酸序列具有约511个氨基酸，其多肽核心约为60,000 道尔顿。通过N连接糖基化对所述多肽进行大幅的修饰，以将其表观分子量提高到 120,000道尔顿。gpl20的氨基酸序列包含由5个超变区隔开的5个相对保守区。 HIV-1hxb—2(以下称"HXB-2")株gpl20基本序列中的18个半胱氨酸残基和gpl20序 列中约24个N连接糖基化位点中的13个在大多数gpl20序列(即便不是在所有gp120 序列)中的位置是相同的。超变区含有广泛的氨基酸取代、插入和缺失。除了这一变
异，大多数(即便不是所有)gp120序列保持了病毒的结合于病毒受体CD4的能力。 "gpl20多肽"包括单个亚单元和/或多聚体。Env多肽(例如gpl20、 gpl40和gpl60)包括由形成P折叠的4个反向平行(3-链 (strand)(0-2、 P-3、 0-20和e-21)构成的"桥接折叠"。由P链中的一对(0-2和f3 -3)推挤出两个环V1禾口V2。相对于HXB-2， P-2折叠大致存在于第119号氨基酸 残基(Cys)到第123号氨基酸残基(Thr)，而|3-3在大致存在于第199号氨基酸残基(Ser) 到第201号氨基酸残基201(11e)。相对于HXB-2， "V1/V2区"大致存在于第126位 氨基酸残基(Cys)到第196号氨基酸残基(Cys)。(参见例如Wyatt等，(1995) 乂 Wra/. 69: 5723- 5733; Stamatatos等，(1998) / 72:7840-7845)。由第二对P链(P -20和e -21)推挤出的是"小环"结构，在本文中也称为"桥接折叠小环"。在HXB-2中，P -20从约第422号氨基酸残基(Gln)延伸到第426号氨基酸残基(Met)，而P -21则从约 第430号氨基酸残基(Val)延伸到第435号氨基酸残基(Tyr)。在变体SF162, Met-426 是Arg(R)残基。相对于HXB-2，所述"小环"从约第427号氨基酸残基(Trp)延伸到 第429号氨基酸残基(Lys)。可相对于其它变体(例如HXB-2)，按例如WO 00/39303 巾所述，测定任何HIV变体的Env多肽gpl60氨基酸序列的比对。此外，本文所定义的"Env多肽"、"gpl20多肽"或"Tat多肽"不限于具有本文 所述的确切序列的多肽。事实上，HIV基因组处于一种持续变化的状态中，并包含 在各种隔离群间具有相对较高程度的变异性的多个可变区。很容易明白这些术语包 括获自任何已鉴别的HIV隔离群、新鉴别的隔离群以及这些隔离群的亚型的Etw(例 如gpl20)多肽和Tat多肽。除非另有说明，否则本文中参考HXB-2对结构特征进行 描述。本领域普通技术人员通过本文公开的内容和现有技术，采用例如序列比对程 序(例如BLAST和本文中所述的其它程序)或对结构特征进行的鉴别和比对(例如本 文所述的可用于鉴别P折叠区的程序如"ALB")能确定其它HIV变体的相应区域(例 如隔离群HIV Ib、 HIVSF2、 HIV-1SF162、 HIV-lSFm、 HIVLAV、 HIVLAI、 HIV画、HIV-1CM235、 HIV-1US4，获自不同亚型(例如亚型A-G和O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不同亚型(例 如HIV-2UC1和HIV-2uc2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV))。(参见例如以下文献中对这些和 其它相关病毒的描述(f錄毒学》(T/ra/ogy入第三版(W.K.Joklik编，1988); (f^^,谅 泰学》(Fwm^mema/Wra/ogj」，第二版(B.N. Fields和D.M.Knipe编，1991); (f疯毒学》 卩K/ra/og^，第三版(Fields， BN， DMKnipe， PMHowley编，1996， Lippincott-Raven， Philadelphia, PA)。修饰Env多肽的实际氨基酸序列可基于任何HIV变体。
另外，术语"Eiw多肽"(例如"gpl20多肽")和"Tat多肽"包括含有对天然序 列的其它修饰的蛋白质，例如其它内部缺失、插入、截短和取代。这些修饰可经仔 细考虑，如通过定点诱变，或可为偶然的，例如通过自然发生的突变事件。因此， 例如如果要对将用于疫苗组合物中的Env多肽修饰时，所述修饰较佳不会导致免疫 活性(即，引发对所述多肽的抗体应答的能力)丧失。类似地，如果要将所述多肽用于 诊断目的时，必须保留这一能力。"修饰的Eiw多肽"是一种已与含有本文所述CD4最小组件的融合蛋白复合的 Erw多肽(例如如上所述的gpl20)。该Env多肽可为单体或寡聚物。通常，复合Eiw(例 如gpl20)多肽使得CD4结合位点中或附近的表位暴露出来，并使得Env多肽得以正 确折叠(例如形成正确的几何形状)。此外，还可对VI和V2环区进行修饰(例如截短)。 虽然本文中没有穷举所用可能的Vl/V2修饰，应理解的是本发明中也包括了其它断 裂修饰。术语"杂合分子"和"融合分子"是指其中具有通常为共价或非共价连接的两种 或多种亚单位的分子。所述亚单位分子可为相同化学类型的分子，或可为不同化学 类型的分子。因此，如本文中所用，该术语是指包含CD4小蛋白和至少一种Tat多 肽的任何分子。融合分子包括但不限于融合多肽(例如，CD4多肽和非CD4多肽间 的融合体)以及融合核酸(例如，编码融合多肽的核酸)。当用于指代含有一个或多个 CD4最小组件的蛋ft质时，术语"融合蛋白"或"融合多肽"是指其中所含CD4氨 基酸序列(例如Eiw结合序列)和一种或多种异源(非CD4)多肽是在单一蛋白中表达的 多肽。所述CD4多肽可在其一侧或两侧侧接所述Tat多肽。野生型HIVTat的氨基酸 序列示于图2(SEQIDNO:2)。也可参见Ratner等，(1985)iVa&re 313:277-284。用于 构建本文所述融合蛋白的Tat片段的非限制性例子包括从大约第1-86号氨基酸残基 延伸的区域，编号根据SEQ IDNO:2确定。也可参见GenBank登录号P04606。"结合"是指融合分子的一种能力，该能力是融合分子与Eiw多肽发生特异性相 互作用，从而由该相互作用导致所述Eiw多肽发生构象变化，而该构象变化则使得 可使中和抗体更易产生的Env表位暴露出来。正常情况下，融合蛋白能分泌入培养有表达该蛋白质的生物体的生长培养基中。 然而，出于本发明的目的，也可在胞内回收这些多肽。可采用多种检测技术(例如聚 丙烯酰胺凝胶电泳等)和免疫学技术(例如免疫印迹法和免疫沉淀分析法，如国际申请 WO 96/04301中所述)很容易地测定分泌入生长培养基的分泌物。在细胞中发现与所述细胞中的成分结合(例如与内质网(ER)或高尔基体结合)的多肽(例如gpl20或其它Env多肽)时，或所述多肽存在于可溶性细胞成分中时，认为该 多肽是"胞内"产生的。本发明的多肽还可分泌入生长培养基，只要细胞内还保留 了足量的所述多肽，从而可采用本文所述的技术将其从细胞裂解物中纯化出。"免疫原性分子"或"免疫原性组合物"是指包含至少一个表位的分子，从而使 得该分子能在被给予该蛋白的个体中引发免疫反应，或者在诊断的情况下，该分子 能抗所讨论的HIV的抗体反应。"表位"是指特异性B细胞和/或T细胞能对其发生应答的抗原位点，使得包含 这一表位的分子能引发免疫反应或能与生物样品中存在的HIV抗体反应。该术语还 可与"抗原决定簇"或"抗原决定簇位点"互换使用。表位可包含以该表位独有的 空间构象存在的3个或更多个氨基酸。通常，表位由至少5个此类氨基酸构成，更 常见的是由至少8-10此类氨基酸构成。测定氨基酸空间构象的方法是本领域已知的， 包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。此外，可采用本领域熟知的技术很容易 地完成给定蛋白质中表位的鉴别，例如通过采用疏水性研究和通过定点血清学研究。 也可参见，Geysen等，Ato/. ^cflc/. (1984) 81:3998-4002(快速合成肽以测定给定抗原中免疫原性表位的常规方法)；美国专利4,708,871(用于鉴别和化学合 成抗原表位的方法)；以及Geysen等，Mo/ecw/w细m朋o/ogy (1986) 23:709-715 (鉴别 对给定抗体具有高亲和力的肽的技术)。可在显示一种抗体阻断另一种抗体与耙抗原 结合的简单的免疫分析中鉴别识别相同表位的抗体。"隐藏表位"通常是指仅在蛋白 质的某些构象中暴露出来的表位。"功能性表位"是指可诱导防止或限制HIV感染的抗体产生的表位。在一个具体 实施方式中，所述抗体是中和抗体。在另一实施方式中，所述抗体可例如引发ADCC 应答。本文所用的"免疫学应答"或"免疫应答"可包括当疫苗组合物中存在Eiw (例 如gpl20)多肽时，在对象中发生对该多肽产生的体液和/或细胞免疫应答。在免疫应 答中产生的抗体还可中和传染性和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒作用，从而 为受免疫的宿主提供保护。可采用本领域熟知的标准免疫分析法测定免疫学反应性， 例如通过竞争分析法。本文所用术语"抗体"包括获自多克隆和单克隆制剂以及下述物质的抗体(i)杂 交(嵌合)抗体分子(参见例如，Winter等，(1991) 7Va&" 349:293-299;和美国专利 4,816,567); (ii)F(ab，)2和F(ab)片段；(iii) Fv分子(非共价杂二聚体，参见例如，Inbar 等，(1972)尸rac Ato/.」cad t/W 69:2659-2662;禾BEhrlich等，(1980) S/oc/zem 19:4091-4096); (iv)单链Fv分子(sFv)(参见例如，Huston等，(1988)尸亂"SL4 85:5879-5883); (v) 二聚和三聚抗体片段构建物；(vi)人源化抗体分子(参 见例如，Riechm肌n等，(1988) Atowe 332:323-327; Verhoeyan等，(1988) Sc/e"ce 239: 1534-1536;和公开于1994年9月21日的英国专利申请GB 2,276,169); (vii)小抗体 或小体(minibody)(即在其C端包含寡聚区的sFv多肽链，所述寡聚区通过绞链区与 所述sFv分隔；参见例如Pack等，(1992) 5/ocfem 31:1579-1584; Cumber等，(1992) J./mm朋o/ogvl49B:120-126);以及(vii)获自这些分子的任何功能性片段，其中该片 段保留了对亲本抗体分子特异性结合的特性。因此，术语"抗体"是指含有至少一个抗原结合位点的多肽或多肽组。"抗原结 合位点"由 -个或多个抗体分子的可变区折叠形成，形成具内表面形状和电荷分布 与抗原表位的特性互补的三维结合位点，其使得特异性结合得以发生以形成抗体-抗 原复合物。可由重链和/或轻链结构域(分别为VH和VL)形成抗原结合位点，其形成 了对抗原结合有作用的超变环。术语"抗体"包括但不限于多克隆抗体、单克隆 抗体、嵌合抗体、改变的抗体、单价抗体、Fab蛋白和单结构域抗体。在很多情况下， 抗体与抗原结合的现象与其它配体/抗配体结合是等价的。如果需要得到多克隆抗体，用带有HCV表位的免疫原性多肽免疫所选哺乳动物 (例如小鼠、兔、山羊、马等)。收集获自受该免疫动物的血清，并根据已知方法进行 处理。如果含有针对HCV表位的多克隆抗体的血清包含对其它抗原的抗体，可通过 免疫亲和色谱纯化所述多克隆抗体。产生和处理多克隆抗血清的技术在本领域中是 已知的，参见例如，Mayer和Walker编(1987) (f潘應^7分f ^f激学^游免度众学方法》本领域技术人员还可很容易的生产抗HCV表位的单克隆抗体。通过杂交瘤制备 单克隆抗体的常规方法是熟知的。可通过细胞融合以及其它技术例如用癌基因DNA 直接转化B淋巴细胞或用埃-巴二氏病毒进行转染而产生无限增殖抗体产生细胞系。 参见例如M. Schreier等，(1980) (f^^)^^^术》f7/j6nVfoma recAm々"e"; Hammerling 等，(1981)， (f卓克蘑贫沐/〃 r潘應染文艨》fMo"oc/o"a/JW T-Ce〃 /fy6n'cfomcw」；Kennett等，(1980) (f卓J^虔贫沐》fMowc/o"fl/^""6oofe^);还可参见， 美国专利4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 和4,493,890。可根据各种特性即同种型、表位亲和力等对所产生的抗HCV表位的单 克隆抗体组进行筛选。如本文所用"单结构域抗体"(dAb)是包含与指定抗原特异性 结合的HL结构域的抗体。dAb不含VL结构域，但可含有已知各种抗体中存在的其 它抗原结合结构域，例如k和A区。制备dab的方法在本领域中是已知的。参见例 如，Ward等，Atowe 341: 544 (1989)。抗体也可包含VH和VL结构域，以及其它已知的抗原结合结构域。这些类型的 抗体和用于其制备的方法的例子在本领域中是已知的(参见例如美国专利4,816,467， 该专利纳入本文作为参考)，并包括以下抗体和方法。例如，"脊椎动物抗体"是指脊 椎动物的成四聚体形式的抗体或其聚集体，其包含通常聚集为"Y"形且可在链间具 有或不具有共价连接的轻链和重链。在脊椎动物抗体中，所述链的氨基酸序列与脊 椎动物中产生的那些抗体序列是同源的，不论是原位或体外产生(例如，在杂交瘤中 产生)。脊椎动物抗体包括例如纯化的多克隆抗体和单克隆抗体，它们的制备方法 在下文中有所描述。"杂合抗体"是其中的链分别与哺乳动物链同源并代表了它们的新组合的抗体， 从而使得两种不同的抗原通过四聚体或聚合物得以沉淀。在杂合抗体中， 一对重链 和轻链与抗第一抗原而产生的抗体中存在的重链和轻链是同源的，而第二对链则与 抗第二抗体而产生的抗体中存在的重链和轻链是同源的。这就产生了 "二价"特性， 即同时结合两种抗原的能力。还可用下文所述的嵌合链来形成这些杂交体。"嵌合抗体"是指其中的重链和/或轻链是融合蛋白的抗体。通常，该链氨基酸序 列的一部分与衍生自具体物种或具体种类的抗体中对应的序列是同源的，而链的其 余片段则与衍生自另一物种和/或种类中的序列同源。通常，轻链和重链的可变区模 拟衍生自脊椎动物某一物种的可变区或抗体，而恒定部分则与衍生自另一脊椎动物 物种的抗体中的序列同源。然而，该定义并不限于这一具体例子。还包括的是其中 重链和轻链中的一条或两条由模拟不同来源的抗体中的序列的序列组合构成，不论 这些来源是来自不同种类或不同起源物种，也不论该融合点是否在可变区/恒定区界 限。因此，可能产生其中的恒定区和可变区都不模拟已知抗体序列的抗体。因而使 得例如构建下述的抗体成为可能其可变区对特定抗原具有较高特异性亲和力的抗 体，或其恒定区可引发增强的补体结合的抗体，或使得具体恒定区具有的特性具有其它改进的抗体。另-一例子是"改变的抗体"，它是指其中在脊椎动物抗体中天然存在的氨基酸序
列已被改变的抗体。采用重组DNA技术，可对抗体进行重新设计以获得所需的特性。 可发生的变化是很多的，从改变一个或多个氨基酸到整个区域(例如恒定区)的重新设 计。恒定区中的改变通常是为了获得所需的细胞过程特性，例如改变补体结合、与 膜相互作用以及其它效应子功能。可对可变区进行改变以改变抗原结合特性。抗体 也可经工程化改造以有助于将分子或物质特异性递送到特异性的细胞或组织位点。 可通过分子生物学中已知的技术进行所需的改变，例如通过重组技术、定点诱变等。另一例子是"单价抗体"，它是指含有结合于第二重链的Fc(即，干)区的重链/轻 链二聚体的聚合物。这类抗体可逃避抗原性调整。参见例如Glennie等，A^&w 295: 712 (1982)。抗体定义中还包括抗体的"Fab"片段。"Fab"区是指重链和轻链的那 些与含有重链和轻链分枝部分的序列大致相同或类似的部分，已显示其可免疫结合 F特定的抗原，但缺乏效应子Fc部分。"Fab"包括一条重链和轻链(通常称为Fab') 的聚合物，以及含有2H和2L链(称为F(ab)2)的四聚体，它们能够选择性地与指定的 抗原或抗原家族反应。可将Fab抗体划分为上述的亚型类似物，即"脊椎动物Fab"、 "杂交Fab"、"嵌合Fab"和"改变的Fab"。产生抗体Fab片段的方法在本领域中是 已知的，这些方法包括例如蛋白质水解和通过重组技术的合成。"抗原-抗体复合物"是指由特异性结合于抗原表位的抗体形成的复合物。测定氨基酸序列"相似性"的技术在本领域中是熟知的。 一般而言，"相似性" 是指对两条或多条多肽的适当位置进行精确的氨基酸与氨基酸的比较，所述的适当 位置中氨基酸是相同的或具有类似的化学和/或物理性质，例如电荷或疏水性。然后 可测定比对多肽序列间的所称的"百分比相似性"。用于测定核酸和氨基酸序列的相 同性的技术在本领域中也是熟知的，包括测定基因的mRNA的核苷酸序列(通常通过 cDNA中间体)以及测定由其编码的氨基酸序列，并将此与第二条氨基酸序列相比较。 一般而言，"相同性"是指两条多核苷酸或多肽序列各自精确的核苷酸与核苷酸或氨 基酸与氨基酸对应关系。可通过测定两条或多条多核苷酸序列的"百分比相同性"来对它们进行比较。同 样，可通过测定两条或多条氨基酸序列的"百分比相同性"来对它们进行比较。两 条序列间的百分比相同性(不论是核酸或肽序列)通常描述为两条比对序列间的精确 配合数除以较短序列的长度，然后乘以100。可通过Smith和Waterman, (f应^教学 遂應^ f^c/vfl"c^ &y^/;//et/A^^emar/ra」2:482-489 (1981)中的局部同源性算法来提供 对核酸序列的大致比对。可使用Dayhoff的(f蛋^^^^f/7潜称房谱》f^/w 0/尸rato/" Se《wem:es朋d浙i/c^"eXM.0. Dayhoff编,5增干ll 3:353-358， National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.， USA)开发的评分矩阵，并通过Gribskov (M^/.」c^ 14(6):6745-6763 (1986))所述进行标准化，将该算法延伸到用于肽序 列。用于核酸和肽序列的该算法的执行方法由Genetics Computer Group (Madison, WI)在它们的BestFit应用程序中提供。用于该方法的默认参数在Wisconsin序列分析 打包程序指南第8版(1995)中有所描述(可购自Genetics Computer Group, Madison, WI)。用于计算序列间百分比相同性或相似性的其它同样使用的程序在本领域中是广 为所知的。例如，可采用Smith和Waterman的同源性算法，以默认评分表和六核苷酸位点 的缺口罚分来测定具体核苷酸序列与参比序列的百分比相同性。在本发明上下文中 建立百分比相同性的另一种方法是使用MPSRCH程序包，其版权属于爱丁堡大学 (University of Edinburgh), 由 John F. Collins禾口 Shane S. Sturrok开发，并由 IntelliGenetics ， Inc.(Mountain View ， CA)经销。在这套程序包中，可采用 Smith-Waterman算法，其中将默认参数用于评分表(例如，缺口开放罚分为12，缺口 延伸罚分为l， 一个缺口为6)。从产生的数据中，"匹配"值反映了 "序列相同性"。 用于计算序列间百分比相同性或相似性的其它适宜程序在本领域中是广为所知的， 例如比对程序BLAST,其也可使用默认参数。例如，可在BLASTN禾口 BLASTP中使用以下的默认参数遗传密码=标准；过滤=无；链=两条；截止=60;期望=10;矩阵=BLOSUM62;说明=50个序列；分类依据=HIGH SCORE;数据 库=非冗长，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻译物+ Swiss蛋白 + Spupdate + PIR 。可在下述因特网址上找到这些程序的详细描述 http:〃www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。本领域的技术人员能很容易地确定适当的搜索参数以用于上述程序中的给定序 列。例如，可根据所讨论序列的大小改变搜索参数。因此，例如本发明的代表性实 施方式中包括具有X个邻接核苷酸的分离的多核苷酸，其中(i)所述X个邻接核苷酸 与衍生自本文所述任一序列的Y个邻接核苷酸具有至少约50%的相同性，(ii) X等于 Y;以及(iii) X大于或等于6个、上限为5000个核苷酸，优选大于或等于8个核苷 酸到5000个核苷酸，更优选10-12个氨基酸、上限为5000个核苷酸，更优选15-20 个核苷酸、上限为本文所述的全长序列中存在的核苷酸数量(例如参见序列表和权利 要求书)，包括所有落于上述范围内的整数值。
通常而言，当把本发明的序列用作查询序列时，本发明的多肽和/或多核苷酸能或 可包括与本文所述的分子(例如与本发明要求保护的序列或其它序列)具有约80%-100%，大于80-85%，优选大于90-92%，更优选大于95%，最优选大于98%的 序列(包括落于这些所述范围内的整数值)相同性的相关序列。也存在测定特定多肽形成某种结构(例如0折叠)的可能性的计算机程序。本文中 所述的一个此类程序是用于蛋白质和多肽二级结构计算和预测的"ALB"程序。此 外，可从基本氨基酸序列预测出蛋白质二级结构，例如采用蛋白质晶体结构和比对 涉及晶体结构的蛋白质序列(例如采用可购自Chemical Computing Group Inc., Montreal, P.Q.， Canada的分子操作环境(MOE)程序)。在以下文献中描述了预测二级 结构的其它方法，例如Gamier等，(1996) Me^oA 266:540-553; Geourjon等，(1995)Com/n^. ^ p//c. 5/(wc/. 11:681-684; Levin (1997)尸ra,e/"10:771-776; 以及Rost等，(1993)Tkfo/ec.所o/. 232:584-599。还可通过如下方法测定同源性在可使同源区之间形成稳定双链体的条件下，使 多核苷酸杂交，然后用一种或多种单链特异性核酸酶消化，测定消化片段的大小。当通过上述的方法测定出两条DNA或两条多肽序列对于确定的分子长度具有至少 约80%-85%，优选至少约90%，最优至少约95%-98%的序列相同性时，则这两条 DNA或两条多肽序列是"基本上同源的"。如本文所用，基本上同源还指对特定的 DNA或多肽序列具有完全相同性的序列。可在例如对具体体系确定的严格条件下， 在Southern杂交实验中鉴别基本上同源的DNA序列。确定适宜的杂交条件是本领域 中的技术。参见例如Sambrook等，同上；(fZ)A^克虔j) fZWJ C/om'"gj，同上；tf樣 麼染文》(We"c/e/c//卢/cfcfl"o"」，同上。"编码序列"或"编码"所选蛋白质的序列是置于适宜的调控序列的控制下时， 可在体外或体内转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸序 列。所述编码序列边界是通过位于5'(氨基)端的起始密码子和位于3'(羧基)端的翻译 终止密码子确定的。编码序列可包括但不限于病毒核苷酸序列的cDNA，以及合成 和半合成的DNA序列和包含碱基类似物的序列。转录终止序列可位于所述编码序列 的3'端。"控制元件"是启动子序列、核糖体结合位点、多聚腺苷酸化信号、转录终止序 列、上游调控结构域、增强子等的总称，其在总体上提供用于宿主细胞中编码序列 的转录和翻译。所有这些控制元件并不是都总需存在，只要所需基因能转录和翻译 即可。当RNA聚合酶结合启动子序列并将所述编码序列转录为mRNA，后者随后被翻 译为由该编码序列编码的多肽时，控制元件在细胞中"引导编码序列的转录"。"操作性连接"是指一种元件的排列方式，其中对所述元件进行配置以执行它们 的常规功能。因此，操作性连接于编码序列的控制元件在RNA聚合酶的存在下能影 响该编码序列的表达。所述控制元件无需与该编码序列邻接，只要控制元件起到指 导编码序列表达的功能即可。因此，例如插入的未翻译但已转录的序列可存在于例 如启动子序列和编码序列之间，而该启动子序列仍可被认为"操作性连接"于该编 码序列。"重组体"在本文中用于描述核酸分子时是指基因组、cDNA、半合成或合成来 源的多核苷酸，按照其来源或生产方法分为(l)不与其天然结合的多核苷酸的全部 或部分结合；和/或(2)与其天然连接以外的多核苷酸连接。术语"重组体"用于描述蛋白质或多肽时是指由重组多核苷酸表达而产生的多肽。"重组宿主细胞"、"宿主细 胞"、"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物"及用于原核微生物或真核细胞系培养物作 为单细胞单元的其它此类术语可互换使用，是指能够或已经用作重组载体或其它转化DNA的受体的细胞，也包括已被转染的原代细胞的后代。应理解，由于随机突变 或刻意进行的突变的原因，单个亲本细胞的后代在形态学上或基因组中可不必完全 相同，或可不必与原始亲本的总DNA完全互补。通过有关特性(例如编码所需肽的 核苷酸序列的存在)辨别出的与亲本足够类似的亲本细胞的后代包含在本定义所预期 的后代中，并由上述的定义所覆盖。"脊椎动物对象"是指脊索动物亚门中的任何成员，包括但不限于人和其它灵 长类，包括非人灵长类，例如黑猩猩和其它猿和猴的种类；畜牧动物，例如牛、绵 羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类，例如小鼠、 大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养鸟类、野生鸟类和猎鸟，例如鸡、火鸡和其它鸫鸡类 鸟类、鸭、鹅等。该术语不限定具体的年龄。因此，同时覆盖了成体和新生个体。如本文所述"生物样品"是指从个体中分离的组织或液体样品，包括但不限于例 如血液、血浆、血清、粪便、尿、骨髓、胆汁、穿刺液、淋巴液、皮肤样品、皮 肤外部分泌物、呼吸道、肠内和生殖泌尿道样品、获自胃上皮和胃粘膜的样品、泪 液、唾液、乳汁、血细胞、器官、活组织，以及体外细胞培养成分，包括但不限于 由培养基中细胞和组织的生长得到的条件培养基质，例如重组细胞和细胞组分。
术语"标记"和"可检测标记"是指能被检测的分子，包括但不限于放射性同 位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶的底物、酶的辅因子、酶抑制剂、发色团、染 料、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素或半抗原)等。术语"荧光剂"是指在可 检测范围中可显示荧光的物质或其部分。可用于本发明的标记的具体例子包括但不限于荧光素、罗丹明、丹酰、伞形花内酯、得克萨斯红、鲁米诺、吖啶(acradimum) 酯、NADPH、 P-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶。概述本发明涉及包含CD4蛋白和/或CD4模拟物及Tat蛋白的融合分子、这些分子与 HIVEnv多肽的复合物，以及制备和使用这些分子和复合物的方法。在不受限于具体 的理论的条件下，由于CD4结合位点(和/或CCR结合位点)埋藏在Env的外部结构 域、内部结构域和Vl/V2结构域之间，因此产生针对Env的免疫应答似乎曾经很困 难。因此，虽然V1/V2结构域的缺失可使病毒更易被针对CD4位点的单克隆抗体中 和，但是与CD4结合前的Env的构象仍可阻止抗体应答。此外，当将全长或接近全 长的CD4(例如可溶性CD4或sCD4)用于诱导Env中的构象变化时，免疫系统还建立 了针对CD4非结合部分的应答。因此，本发明提供了含有与Tat蛋白组合的CD4的片段或模拟物的分子。所述 CD4组分通常不包括对其产生CD4免疫应答的区域但仍包括参与结合Eiw的序列。 因此，所述融合分子结合于Env但不引起不希望的免疫应答，例如对全长CD4的免 疫应答。此外，这些融合蛋白在Env中引起了暴露出CD4结合位点中或附近的一个 或多个表位(例如隐藏表位)的构象变化，然后使得针对Env的免疫应答(例如中和抗 体应答)得以发生，而不发生对CD4的不为所需的免疫应答。可将本文所述的多种形式的不同实施方式结合起来。CD4分子在本发明的实践中，杂合分子包含CD4分子。该杂合分子可与Env多肽复合以 改变Eiw多肽的构象并暴露引发中和抗体的表位。CD4的氨基酸序列是已知的(图1)，对CD4的结构研究显示该分子由4个胞 外免疫球蛋白样结构域(三个结构域含有二硫键连接的环)组成。也已知gpl20与 其受体(CD4)的结合诱导了 Env蛋白中的构象变化。然而，对于与gpl20的相互
作用而言，只有CD4的结构域l(Dl)才是决定性的(Arthos等，(1989) CW/57(3): 469-481; Truneh等，(1991) JS/o/C7zem 266(9):5942-5948)。结合CD4三维结构信息的突变分析、抗体竞争实验已显示与Dl中免疫球蛋白的互补决定区2(CDR2)同源的区域在结合gp 120中起到重要的作用(Ryu等，(1994)2(1): 59-74， Sullivan等，(1998) J闪W)/ 72(8):6332-6338)。事实上，gpl20:CD4复合物 的结构分析证实了 CD4的CDR2样环在CD4-gpl20相互作用中是很关键的(Choe & Sodroski (1992) J J，,>/mw騰De//c 5(2):204-210， Gizachew等，(1998)肠c/ 醒勿37(30): 10616-10625)。对与CD4和中和单克隆抗体17b的Fab部分复合的gpl20的结晶学结构分析 (Kwong等，(1998) tV"化"393:648-659)表明CD4结构域Dl的大表面(742 A2)与 即120上大的凹陷(800 A2)相结合。CD4界面由22个残基组成，通过混合的疏水 性、静电、氢键相互作用对结合gpl20发挥作用。该界面的大尺寸和复杂性使得 在小分子中再现该功能性表位成为一种挑战，并解释了开发gpl20-CD4相互作用 的小分子抑制剂的难度。Vita等，(1998) S/o，/;/we^ 47: 93-100。然而，尽管在 gpl20-CD4相互作用表面上存在着众多的残基，对激素-受体系统的研究显示蛋白 质-蛋白质界面处的结合能可能仅由少数残基主导。Clackson和Wells (1995) Sc/e"ce 267(5196):383腳386。gpl20结合于CD4后，似乎也暴露出了独特的中和表位，例如由单克隆抗体 CG10识别的表位(Gershoni等，(1993) F證6 / 7(12):1185-1 187)。事实上，虽然 获自实验株的单体gpl20蛋白引发初级隔离群中和抗体的免疫原性很差(Mascola 等，(1996)/173:340-348)，但是似乎可识别暴露在Env表面的某些表 位的单克隆抗体一旦结合于其CD4受体，也已显示出可中和不同初级隔离群。 参见例如命名为17b的抗体(Thali等，(1993) J K>o/ 67(7):3978-3988)。然而，采 用与受体/复合受体复合的Env进行的交叉分化(cross-clade)初级隔离群中和抗体 应答已对gp41融合结构域的免疫原性起到作用。Lacasse等，(1999) Sc/wce 283: 357-362。此外，对评估gpl20-CD4复合物作为用于诱导高亲合力和初级隔离群中和抗 体的潜在疫苗候选物的尝试已受到了以下关切的阻碍即可能会针对CD4自身 产生免疫应答，并由此产生自身免疫和安全性问题。(D'Souza等，(1997)J/w/e" 流175:1056-1062， DeVico等，(1995) PW柳21 1(2):583-588)。因此，本发明优选采用小于全长的CD4蛋白或CD4模拟物。所述CD4分子与 HIV Tat蛋白组合形成不诱导对CD4的免疫应答的杂合体Env-结合分子。该杂合分 子优选通过CD4最小组件结合于Env蛋白或与Erw蛋白复合。在某些实施方式中， 该融合蛋白的所述CD4最小组件部分包含SEQIDNO: 1的第15-85号氨基酸残基或 与CD4最小组件具有结构相似性的分子(例如在Martin等，(2003) Ato. 21(1): 71-76中所述的CD4模拟物)。可根据本文所述测定结构相似性。如图4所示，包含 SEQ ID NO: 1第15-85号氨基酸残基的CD4小蛋白几乎完全埋藏在gpl20结合口袋 中。此外，该CD最小组件是通过存在于Cysl6和Cys84间的二硫桥来稳定的。通过本说明书，本领域的技术人员能很容易地测定与本文所述CD4最小组件具 有结构和/或氨基酸相似性的氨基酸序列。此外，可对这些同系物(结构或序列)中的 任何一种进行进一步的修饰。该修饰可影响结构和/或功能。例如，可对小蛋白进行 氨基酸取代、添加和/或缺失，从而保护或增强gpl20结合结构。可化学合成用于本发明实施中的任一 CD4分子。优选i也，该合成是在允许和促 进该小蛋白有效折叠为结合gpl20和暴露CD4结合位点中或附近的表位的条件下进 行的。例如，可在产生类似于CD4的圆二色性的条件下合成该小蛋白，而不考虑天 然序列中的突变。Tat多肽本文所述杂合分子的Tat多肽组分可衍生自任何已知的HIV隔离群、新鉴别的隔 离群以及这些隔离群的亚型。本文中参考SF162或HXB-2对结构特征进行描述。本 领域普通技术人员通过本文公开的内容和现有技术，采用例如序列比对程序(例如 BLAST和本文中所述的其它程序)或对结构特征进行的鉴别和比对(例如本文所述的 可用于鉴别P折叠区的程序如"ALB")能确定其它HIV变体的相应区域(例如隔离 群HIV肌、HIV-1SF162、 HIV-1SFI7。、 HIVLAV、 HIVLAI、 HIV顧、HIV-1CM235、 HIV-1US4， 获自不同亚型(例如亚型A-G禾P O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不同亚型(例如 HIV-2uc,和HIV-2uc2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV))。(参见例如以下文献中对这些和其 它相关病毒的描述(f疯毒学》Wra/ogKJ，第三版(W. K. Joklik编，1988); if基欲錄 毒学》fF,t/awe"to/Wra/ogy」，第二版(B. N. Fields和D. M. Knipe编，1991); f疯毒 学》(T/ra/ogy」，第三版(Fields， BN， DM Knipe， PM Howley编，1996， Lippincott-Raven， Philadelphia, PA)。 Tat多肽的实际氨基酸序列可基于任何HIV变体。
因此，可根据它们作为骨架的能力在内的许多特性选择所述杂合分子的Tat多肽 部分，从而以模拟CD4的整体构型的方式将CD4分子呈递给Eiw。采用这种方式， 含CD4最小组件的杂合分子与Erw的结合被增强，同时减弱了不希望的对CD4非 Erw结合区的免疫应答。通过用精通本领域的技术人员已知的并如文中所述的方法检 索结构数据库可鉴定与野生型CD4结构相似的蛋白质。也可参见2004年6月提交的 美国临时申请序列号60/578,151。Tat组分除了能提供CD4样结构(或骨架)外，Tat多肽可能还赋予本文所述的杂合 分子其它功能。Tat组分的其它功能包括但不限于免疫原性、佐剂性和/或免疫调节 特性。已知HIV-1 Tat能诱导强体液和细胞应答，且还知道用Tat疫苗免疫动物能抵 抗病原性SHIV感染。参见，例如，Agwale等，(2002)尸rac. A^/.」cad WSvl 99(15):10037-10041; Opi等，(2002) 乂 C/zew. 277(39):35915-35919。因此，在某 些实施方式中，优选Tat组分(例如全长或接近全长的Tat多肽)在对象中诱导免疫 应答(例如，Tat特异性免疫应答)。或者，在某些实施方式中，所述Tat多肽的一个 或多个免疫原性区域或表位优选被修饰以降低或消除其免疫原性和/或毒性。因此，设计了含有插入Tat多肽不同区域(例如，用于CD4的Erw结合部分的Tat 多肽"骨架")编码序列的CD4最小组件的融合分子。图5显示了本文所述的示例性 融合分子。也可参见实施例1以及图6和7。图5所示的第一杂合分子从N末端到C 末端方向包括Tat蛋白的残基1-20， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组 件)；和Tat蛋白的残基30-86。图5所示的第二杂合分子从N末端到C末端方向包 括Tat蛋白的残基1-30， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat 蛋白的残基40-86。图5所示的第三杂合分子从N末端到C末端方向包括Tat蛋白 的残基1-40， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基 50-86。图5所示的第四杂合分子从N末端到C末端方向包括Tat蛋白的残基l-50， CD4 (SEQ ID NO: l)的残基15-85 (CD4最小组件)；和Tat蛋白的残基60-86。本文所述的融合蛋白还可含有其它多肽，其中包括但不限于 一种或多种病原体(例如，病毒如HIV、 HBC、 HCV、 HAV、 RSV、流感病毒等，或细菌)的抗原性多肽、 免疫调节多肽如细胞因子、趋化因子，等等。例如，所述融合蛋白可包含Tat-CD4 杂合分子能够结合的Erw多肽。采用这种方式，单个融合蛋白可作为复合物以暴露 被CD4暴露的表位。该融合蛋白还可包含其它HIV多肽，例如来自相同或不同HIV 毒株的Gag、尸o/、绘/、 / ev、 Taf、 F戸、^/"或其免疫原性片段中的一种
或多种。所述tat多肽可作为多肽或编码该tat多肽的多核苷酸提供。在一些实施方式中， 所用Tat多核苷酸序列经密码子优化。Env多肽本文所述复合物的Erw多肽部分可衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIVEnv。如上 所述，HIV-1的包膜蛋白是约160 kd的糖蛋白(gp160)。在宿主细胞受到病毒感染期 间，gpl60经宿主细胞蛋白酶切割形成gp120和整合膜蛋白gp41。gp41部分锚定于(并 跨越)病毒体的双层膜中，而gpl20片段则突出于周围环境中。由于gpl20和gp41 间没有共价连接，游离的gpl20可从病毒体的表面上释放出来并感染细胞。Env多肽 还可包括gpl40多肽。在某些实施方式中，复合物中的Erw多肽组分是单体或二聚体。在优选的实施方 式中，所述Erw多肽组分是低聚的Eiw多肽。HIV-lsF2株(以下称为"SF2")的Erw 多肽前体的基本序列是已知的。参见例如国际申请WO04/037847的图1，该申请全 文纳入本文作为参考。gpl20氨基酸序列(包括前导序列)约从第1号氨基酸延伸到第 509号氨基酸。所述多肽含有约24个N连接的糖基化位点，这些位点在大部分(即使 不是所有)的gpl20序列中是相同的。正如它们的名称所表示，不同株之间的超变区 含有众多氨基酸取代、插入和缺失。尽管有这一变异，大部分(即便不是所有)Erw多 肽序列保持了病毒的结合病毒受体CD4的能力。此外，可相对于其它变体(例如 HXB-2)对任一 HIV变体的Env多肽氨基酸序列的比对进行测定，如WO 00/39303 中所述。在另一实施方式中，所述Env多肽包含低聚形式的Env，例如低聚的gpl40 (o-gpl40)。结合或复合于本文所述CD4-Tat杂合分子的Env多肽可衍生自任何已知的HIV 隔离群，以及新鉴别的隔离群及这些隔离群的亚型。在本文中参考SF2或HXB-2来 描述结构特征。釆用例如，序列比对程序(例如BLAST和本文中所述的其它程序)或 对结构特征进行鉴别和比对(例如本文所述的可鉴别P折叠区的程序如"ALB")，本 领域普通技术人员通过本文公开的内容和现有技术能确定其它HIV变体(例如隔离群 HIV lb、 HIV-1SF162、 HIV-lSF17o、 HIVLAV、 HIVlai、 HIV丽、HIV-1CM235、 HIV-1US4， 获自不同亚型(例如亚型A-G和O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不同亚型(例如 HlV-2ud和HIV-2uc2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV))中的相应区域。(参见例如以下文献 中对这些和其它相关病毒的描述(f谅毒学》r^o/og^，第三版(W.K.Joklik编，1988);(f基磁錄毒,J1 (Fw"^me"M/ F ro/ogy」，第二版(B.N. Fields和D.M.Knipe编，1991);(f錄毒学JYK/ra/ogv」，第三版(Fields， BN， DM Knipe， PM Howley编，1996， Lippincott-Raven， Philadelphia, PA)。 Env多肽的实际氨基酸序列可基于任何HIV变体。与本文所述的融合蛋白结合和/或复合的所述Eiw多肽可包括对天然序列的其它 修饰，例如其它内部缺失、插入和取代。这些修饰可经仔细考虑，如通过定点诱变， 或可为偶然的，例如通过自然发生的突变事件。因此，例如如果要将Erw多肽用于 疫苗组合物中时，所述修饰必须不会导致免疫活性(即，引发针对所述多肽的抗体应 答的能力)的丧失。类似地，如果要将所述多肽用于诊断目的时，必须保留这一能力。 本文所述的Erw多肽可为单体或寡聚物。多肽的产生可采用各种方法来产生本发明的CD4分子(例如CD4最小组件)、Tat多肽、Eiw 多肽和融合蛋白，这些方法都是本领域熟知的。在一个实施方式中，采用本领域中熟知的重组技术来产生所述多肽。从这一角度 可在感兴趣多肽的已知序列的基础上设计寡核苷酸探针，并用于探测基因组 或cDNA文库中编码所述多肽的基因。然后，可采用标准技术对该基因进行进一步 的分离，例如在全长序列的所需部分用限制性内切酶截短该基因。类似地，可采用 已知的技术从含有该基因的细胞和组织中直接分离出该基因，例如苯酚抽提并对序 列进行进一步的操作以产生所需的截短物。参见例如Sambrook等，同上，关于用于 获得和分离DNA的技术的描述。可基于巳知的序列，通过合成法产生编码所述融合蛋白的组分和/或Env多肽的 基因。可将该核苷酸序列设计为具有用于所需具体氨基酸序列的合适密码子。通常 使以标准方法制备的寡核苷酸的重叠来组装完整的序列，并组装成完整的编码序列。 参见例如Edge (1981) Atowre 292:756; Nambair等，(1984)肠騰223:1299; Jay等， (1984)J说'o/.C7^附.259:6311; Stemmer等，(1995) 164:49-53。可很容易地采用重组技术来克隆编码所选多肽的基因，然后可通过置换适宜的碱 基，在体外对基因进行诱变，以获得所需氨基酸的密码子。该变化可包括小至造成 单个氨基酸变化的一个碱基对的改变，或可包括多个碱基对的变化。或者，可用与 亲本核苷酸序列(通常为对应于RNA序列的cDNA)杂交的错配引物，在低于错配双 链解链温度的条件下，引起该突变。可通过将引物长度和碱基组合保持在相对较窄的范围内，以及将突变碱基保持在中心位置来使得该引物具有特异性。参见例如Innis 等，(1990)，《PCR应用用于功能性基因组的方法》(PCRApplications: Protocols for Functional Genomics); Zoller和Smith, M"/20tfcfe，0/. (1983) 100:468。可用DNA聚合酶来实现引物延伸，克隆出产物，并选出通过引物延伸链的分离而得到的含有 突变DNA的克隆。可采用突变引物作为杂交探针来完成筛选。也可将该技术应用于 产生多位点突变。参见例如Dalbie-McFarland等，尸rac. Ato/. Jcad (1982) 79:6409。一旦所需多肽的编码序列被分离或合成，就可将它们克隆到用于表达的任何适合载体或复制子中。通过本文的教导将很明确的是可通过构建以各种组合操作性连接编码CD4小蛋白和异源序列的多核苷酸的表达构建物来产生编码多肽和/或融合蛋白的多种载体。这些组合的非限制性例子在实施例中有所讨论。 本领域技术人员已知多种克隆载体，对于适当克隆载体的筛选只是选择的问题。用于克隆的重组DNA载体以及它们可转化的宿主细胞的例子包括人噬菌体(大肠杆 菌(Eco//))、 pBR322 (大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230 (革兰氏阴性菌)、 pGV1106 (革兰氏阴性菌)、pLAFRl(革兰氏阴性菌)、pME290 (非大肠杆菌革兰氏阴 性菌)、pHV14 (大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(^c/〃^犯tofe))、 pBD9 (杆菌属)、pIJ61 (链 霉菌属)、pUC6(链霉菌属)、YIp5(酵母菌属)，YCpl9(酵母菌属)和牛乳头瘤病毒(哺 乳动物细胞)。总体上可参见，(fDA^克/t^(DA^ C7om'"g)巻1&11，同上；Sambrook 等，同上；B.Perbal，同上。昆虫细胞表达系统(例如杆状病毒系统)为本领域技术人员所知，并在例如 Summers和Smith, f第"55号淳jg"/F;l^农f试验公叛》(Texw爿ghcw/^ra/五x; en'we^ 1Stat/cW&//e^Wa755" (1987)中有所描述。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料 和方法可从诸如Invitrogen， SanDiegoCA以试剂盒形式购得("MaxBac"试剂盒)。也可用植物表达系统产生本文所述的蛋白质。通常而言，这类系统采用以病毒为 基础的载体转染植物细胞，使其具有异源基因。关于这类系统的描述可参见例如Porta 等，舰说她c/z. (1996) 5:209-221;和Hackland等，AcA. (1994) 139:1-22。病毒系统(例如Tomei等，《/ Wra/. (1993) 67:4017-4026和Selby等， / F ra/. (1993) 74:1103-1113中描述的基于牛痘的感染/转染系统)也可用于本发明。在该系统 中，首先在体外用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的牛痘病毒重组体转染细胞。该聚合
酶显示出精密的特异性其仅转录带有T7启动子的模板。感染后，用感兴趣的由T7启动子驱动的DNA转染细胞。通过牛痘病毒重组体在胞质中表达的聚合酶将转 染的DNA转录成RNA，然后由宿主的翻译机制将该RNA翻译成蛋白质。该方法提 供了高水平的、瞬时的、由细胞质产生的大量的RNA及其翻译产物。可将该基因置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子(本文将 这些元件总称为"控制"元件)的控制下，从而使得编码所需多肽的DNA序列在用 含该表达构建物的转染宿主细胞中转录成RNA。所述编码序列可含有或不含信号肽 或前导序列。在本发明中，可使用天然存在的信号肽或异源序列。可由宿主在翻译 后加工过程中去除所述前导序列。参见例如美国专利4,431,739; 4,425,437; 4,338,397。 该序列包括但不限于TPA前导序列以及蜜蜂二甲双胍(mellitin)信号序列。能调控与宿主细胞的生长相关的蛋白质序列表达的其它调控序列也是需要的。这 些调控序列是本领域技术人员所知的，其例子包括响应化学或物理刺激(包括调控化 合物的存在)时，能使基因表达起始或停止的那些调控序列。载体中也可存在其它类 型的调控元件，例如增强子序列。可在插入载体前，将控制序列和其它调控序列与所述编码序列连接。或者，可将 该编码序列直接克隆入已含有控制序列和适当的限制性位点的表达载体中。在某些情况下，可能需要对编码序列进行修饰，从而使其能以适宜的方向与控制 序列连接；S卩，保持正确的阅读框。可通过使编码该蛋白质的序列部分缺失、插入 序列和/或取代该序列中的一个或多个核苷酸来制备突变体或类似物。用于修饰核苷 酸序列的技术(例如定点诱变)为本领域技术人员熟知。参见例如Sambrook等，同上； (TZ)M4克麿》(DA^ C/o"/"gj，巻I和II，同上；(f^^^j^^fTVewc/e/c/^^Vfea^^, 同上。然后用表达载体转化适宜的宿主细胞。多种哺乳动物细胞系是本领域中已知的， 包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的无限繁殖细胞系，例如但不限于中 国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细 胞癌细胞(例如Hep G2)、 Vero293细胞等。类似地，可将细菌宿主(例如大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌和链球菌属)用于本表达构建物中。可用于本发明中的酵母宿主除其它 外特别包括啤酒酵母(Sacc/zaraw;;cM cereWw'ae)、白色念珠菌(Cawcfe/fl a/6/cara)、 麦芽聚糖念珠菌(Ca"J/(ia wa/fc^a)、多态汉逊酵母(7/arae"wa/;7o/3;mw77/za)、脆性克鲁 维酵母(A7w"eromj;ce5/rag"/力、乳糖克鲁维酵母(^7M"era/^c^ /acto)、吉利蒙德氏 毕赤酵母(尸/cWa gw/〃e〃'ww7c///)、甲醇毕赤酵母(尸/c/w'a/ flWon's)、裂殖稷酒酵母(Sc/w'zo Sacc/zaramyces /ww6e)禾口角率月旨耳卩氏酵母(rarraw/a /^o/>^/cfl)。使用杆状病毒表达载体 的昆虫细胞除其它外特别包括埃及伊蚊(^^fey aegKp^、苜蓿尺蠖(」^ogra; /^ ca/z》r"/ca)、 家蚕won9 、 黑月复果虫竜(Z>osop/2〃a me/a"ogafWe/^ 、 草i也夜虫我 (5^oc/o,ra如g一油」禾口粉纹夜蛾。根据所选的表达系统和宿主，可通过在可使得感兴趣的蛋白质表达的条件下培养 经上文所述的表达载体转化的宿主细胞来生产本发明的蛋白质。对适宜培养条件的 选择在本领域技术范围内。在一个实施方式中，例如为了产生Erw多肽，转化细胞将多肽产物分泌到周围的 培养基中。所述载体中可包含某些调控序列以促进所述蛋白产物的分泌，例如采用 组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)前导序歹lJ、干扰素(？或oc-)信号序列或获自己知分泌 蛋白的其它信号肽序列。然后可采用本文所述的各种技术分离该分泌的多肽产物， 例如采用标准纯化技术，例如(但不限于)羟磷灰石树脂、柱层析、离子交换色谱、 分子排阻色谱、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和层析、免疫沉淀法等。或者可采用可裂解细胞但能保持所述多肽(例如Env)基本上完整的化学、物理或 机械方法来破裂转化细胞。还可采用例如去污剂或有机溶剂去除细胞壁或膜的成分 以发生多肽渗漏来获得胞内蛋白。这些方法是本领域技术人员已知的并描述于例如 (f蛋y^质/密必应L. 实錄遂展》(7Vote/"尸w〃y ca"o"」/ ; //ca"o"5.'爿/Vac/Zca/ /i/7/7roflc/2」(E丄.V. Harris和S. Angal编，1990)。例如，用于本发明的细胞破裂方法包括但不限于声裂法或超声波破裂法；搅动 法；液相或固相萃取；热处理；冻融法；干燥法；爆发性减压法；渗透休克法；用 包括蛋白酶(例如胰蛋白酶、神经氨酸苷酶和溶菌酶)在内的裂解酶处理；碱处理；以 及使用去污剂和溶剂，例如胆汁盐、十二烷基磺酸钠、Triton、 NP40和CHAPS。用 于破裂细胞的具体方法很大程度上只是一个选择的问题，其取决于其中有多肽表达 的细胞的类型、培养条件和任何所用的预处理。细胞破碎后，通常通过离心去除细胞碎片，采用标准的纯化技术对胞内产生的 多肽进行进一步纯化，所述技术包括但不限于柱色谱、离子交换色谱、分子排阻 色谱、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和层析、免疫沉淀法等。例如，获得本发明的胞内Env多肽的一种方法涉及亲和纯化，例如采用抗Erw 特异性抗体进行的免疫亲和层析，或凝集素亲和层析。尤为优选的凝集素树脂是识
别甘露糖部分的那些树脂，例如但不限于源自以下物质的树脂雪花莲(Gfl/fl"^M w'vafc)凝集素(GNA)、兵豆(丄era cw/Z"a〃X)凝集素(LCA或小扁豆凝集素)、豌豆(尸&wm ra"vwm)凝集素(PSA或豌豆凝集素)、黄水仙(A^^'^Ry /wewcfo"(^c/M^y)凝集素(NPA) 和熊葱04///"附w"/m^m)凝集素(AUA)。适宜的亲和树脂的选择在本领域的技术范围 内。亲和纯化后，可采用本领域熟知的常规技术(例如上述的任何技术)对多肽进行进 一步的纯化。很容易化学合成相对较小的多肽(即长度最大约为50个氨基酸)，例如通过肽领域 技术人员已知的多种技术中的任何一种来合成。 一般而言，这些方法将一个或多个 氨基酸顺序添加到正在增长的肽链。通常，用适宜的保护基团保护第一个氨基酸的 氨基或羧基。然后可在适于形成酰胺键的条件下，通过加入具有适当保护的互补(氨 基或羧基)基团的序列中下一个氨基酸，将受保护或衍生的氨基酸附着于惰性固相载 体或用于溶液中。然后从新添加的氨基酸残基上去除保护基团，然后加入下一个氨 基酸(适当保护的)，依此类推。在所需的氨基酸已以适当的顺序连接后，依次去除或 同时去除剩余的保护基团(如果采用了固相合成技术的话，去除任何固相载体)，以得 到最终的多肽。通过对该通用步骤做出简单改变，可一次性将多个氨基酸加入生长 链，例如通过将受保护的三肽与适当的受保护的二肽偶联(在不使手性中心外消旋的 条件下)，以在脱保护之后形成五肽。关于固相肽合成技术可参见例如J. M. Stewart 和J. D. Young， (f^V^/t^成j) fSo/W P/zaw^",/z^^(Pierce Chemical Co.， Rockford， IL 1984)和G. Barany和R.B. Merrifield， (f嚴游分界、^成*主激,》f77ze 尸e/^/tfe.'y4"a(y57J， 5y"f/zew'" 5/o/ogy」，E. Gross禾口 J. Meienhofer编，巻2， (Academic Press, New York, 1980)，第3-254页；关于经典溶液合成可参见例如M. Bodansky， (f嚴^^^^"够》(7V/"";p/M 。/尸印"cfe ^"A^^)(Springer-Verlag， Berlin 1984)和E. Gross禾口 J. Meienhofer编的(f嚴游分桥、^成/〃全欽学;；(TAe^"a/"&， /5_y"，历o/ogy」，巻1 。典型的保护基团包括叔丁氧羰基(Boc)、 9-芴甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz); 对-甲苯磺酰基(Tx); 2,4-二硝基苄基；苄基(Bzl);联苯异丙氧基羧基-羰基、叔-戊氧 基羰基、异冰片基羰基、o-溴苯氧基羰基、环己基、异丙基、乙酰基、o-硝基苯磺酰基等。典型的固相载体是交联聚合载体。其可包括二乙烯基苯交联的苯乙烯基聚合物，例如二乙烯基苯-羟甲基苯乙烯共聚物、二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯 基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。也可通过其它方法化学制备本发明多肽的类似物，例如通过同时多重肽合成方法。参见例如Houghten尸rac.編.^cad 腦(1985) 82: 5131-5135;美国专利 4,631,211。Env-杂合分子复合物可通过多种方式使Env与本文所述的Tat-CD4分子复合。在某些实施方式中，采 用一种或多种交联剂或固定剂如甲醛、福尔马林、戊二醛(glutyraldehyde)等复合Eiw 和Tat-CD4分子。出于免疫目的，需要将Tat-CD4与Env交联以保持暴露Env蛋白 中CD4可诱导表位，以靶向疫苗应用中的功能性表位。存在以下方法1) 经典交联传统的共价交联蛋白质的方法是采用优先与赖氨酸侧链反应的非 特异性交联剂，如甲醛或戊二醛。由于CD4和env界面上存在一些赖氨酸残基，因 此这些交联剂对于交联CD4-env复合物有效。然而，在初步研究中，我们已显示这 些反应剂还会修饰env的抗原性表面，这表现为部分保留17b和4.8d活性。因此， 为确定最佳条件，我们需要测试不同条件，如pH、缓冲液和交联接头浓度。2) 改进的交联策略基于较新的化学机制评价了其它交联剂，如具有不同接头 长度和反应性的同-和异-双官能试剂。然而，较为理想的是通过单个氨基酸残基的特 异性共价键连接Tat-CD4和Eiw，从而可保存Env暴露的抗原性表面。3) 使Env中的特定氨基酸残基突变以交联特异性交联Tat-CD4与Erw的一种 可用方法是将涉及半胱氨酸残基硫醇基的特定的连接(linkage)策略性地掺入env。然 而，这种策略将涉及Tat-CD4和env之间的二硫键，这将必然涉及CD4结合位点。 此外，二硫键不是最稳定的共价键。另一种策略是，通过特异性共价键将含CD4小蛋白的融合蛋白与包膜连接，所 述共价键不会干扰包膜暴露的抗原表面，却能暴露出通常不可接近的隐藏保守表位， 从而可例如产生抗体应答。此外，还可通过用编码本文所述融合蛋白和/或一种或多种Erw多肽的构建物共 转染宿主细胞来产生适宜的复合物。在某些实施方式中，所述Env多肽是融合蛋白 的一部分。因此，可顺式或反式完成共转染，即通过使用独立的载体或使用同时带 有Erw和含CD4及Tat的组合物的单一载体来完成共转染。如果使用单一载体完成 的话，两种基因可由单套控制元件驱动。或者，Env-和CD4/Tat-编码序列可存在于 独立的表达盒中的载体上，由独立的控制元件驱动。表达后，蛋白质可自发结合。 或者，可通过将不论是纯化形式或半纯化形式的分别形成的独立蛋白质混合在一起 来形成复合物，甚至可通过将其中培养过表达所述蛋白质的宿主细胞的培养基混合来形成该复合物。参见1996年2月15日提交的国际申请WO 96/04301中对此类复合物的描述。抗体抗Env-杂合CD4-Tat分子复合物表位(以及因CD4结合于Env而暴露的隐藏表位) 的单克隆和多克隆抗体在诊断和治疗应用中尤为有用，例如中和抗体可用于被动免 疫治疗。单克隆抗体尤可用于产生抗独特型抗体。抗独特型抗体是载有需要为其产生保护的感染剂的抗原的"内部图像"的免疫球 蛋白。产生抗独特型抗体的技术在本领域中是已知的。参见例如Grzych(1985)，A^& 316:74; MacNamara等，(1984)， S"'e"ce 226:1325， Uytdehaag等，(1985)， J/纖,/. 134:1225。这些抗独特型抗体也可用于HIV的治疗和/或诊断。对病毒抗原的免疫分析可采用例如针对病毒表位的单克隆抗体、针对一种病毒 多肽表位的单克隆抗体的组合、针对不同病毒多肽表位的单克隆抗体、针对相同病 毒抗原的多克隆抗体、针对不同病毒抗原的多克隆抗体、或单克隆和多克隆抗体的 组合。免疫分析实验方法可基于例如竞争或直接反应或夹心型分析。实验方法也可例 如，使用固相载体或可通过免疫沉淀而进行。大部分分析涉及使用标记的抗体或多 肽。该标记可为例如荧光、化学发光、放射性或染料分子。扩增探针的信号的分 析法也是已知的。其中的例子是使用生物素和抗生物素蛋白、酶标记和介导的免疫 分析(例如ELISA分析法)的分析法。可将酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于测定抗原或抗体浓度。该方法取决于酶与 抗原或抗体的结合，并采用所结合酶的活力作为定量标记。为了测定抗体，将己知 的抗原固定于固相(例如微量培养板或塑料杯)，与测试血清稀释液一起孵育，洗涤， 与用酶标记的抗免疫球蛋白一起孵育，再次洗涤。适于标记的酶在本领域中是已知 的，包括例如辣根过氧化物酶。通过加入特定的底物来测定结合于固相的酶活力， 并通过比色法测定产物的形成或底物的消耗。结合的酶的活力与结合的抗体的量是 直接的函数关系。
为了测定抗原，将已知的特异性抗体固定于固相，加入含抗原的测试材料，孵育 后洗涤固相，加入酶标记的二抗。洗涤后，加入底物，比色分析酶活力，并与抗原 浓度相联系。可通过将融合蛋白给予哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊或马)来产生多克隆抗体。 收集获自受免疫的动物的血清，采用例如用硫酸铵沉淀，然后进行层析(优选亲和层 析)的方法，从血浆中纯化抗体。用于产生和处理多克隆抗血清的技术在本领域中是 已知的。也可生产针对Env与CD4结合后所暴露表位的单克隆抗体。可将获自用例如本 文所述的Evn-CD4复合物免疫的哺乳动物(例如小鼠)的正常B细胞与例如HAT敏感 型小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。可通过RIA或ELISA鉴别生产对CD4小蛋 白与Eiw结合时暴露出的表位具有特异性的抗体的杂交瘤，并通过在半固体琼脂中 克隆或通过有限稀释来对其进行分离。通过另一轮的筛选分离产生所需特异性抗体 的克隆。针对表位的抗体(单克隆和多克隆)在检测样品(例如获自HIV感染的人体的血清 样品)中抗原的存在中尤为有用。用于HIV抗原的免疫分析法可采用一种抗体或多种 抗体。对于HIV抗原的免疫分析可采用例如针对HIV表位的单克隆抗体、针对一 个Eiw或Eiw-含CD4最小组件的融合多肽的表位的单克隆抗体组合、针对不同多肽 的表位的单克隆抗体、针对相同HIV抗原的多克隆抗体、针对不同HIV抗原的多克 隆抗体、或单克隆和多克隆抗体的组合。免疫分析实验方法可基于例如竞争、直接 反应或采用例如标记抗体的夹心型分析。该标记可为例如荧光、化学发光或放射 性。还可通过免疫亲和层析柱，利用多克隆或单克隆抗体分离Env或与融合蛋白复合 的Eiw。可通过例如吸附或通过共价连接键将抗体固定到固相载体上，从而使得抗体 保留它们的免疫选择活性。可任选地包含间隔基团以使抗体的抗原结合位点易于接 近。然后可将固定化抗体用于结合生物样品(例如血液或血浆)的靶标。通过例如改变 pH从柱基质回收结合的蛋白质或复合物。诊断、疫苗和治疗用途可将本发明的CD4-Tat分子以及含这些杂合分子的复合物(例如具有Env的复合 物)或其编码多核苷酸用于多种诊断和治疗目的。例如，可将蛋白质和多核苷酸或针 对它们而产生的抗体用于各种分析，以测定生物样品中活性抗体和/或Env蛋白的存 在，以帮助诊断HIV感染或疾病状态或作为对免疫应答的测定。如上所述，可采用标准的电泳和免疫诊断技术来检测与Env(例如gpl20)多肽反应 的抗体的存在，或反之与针对其产生的抗体反应的抗原的存在，所述技术包括免疫 分析法，例如竞争、直接反应或夹心型分析法。这些分析法包括但不限于免疫印 迹法；凝集测试；酶标记和介导的免疫分析，例如ELISA;生物素/抗生物素蛋白型 分析；放免分析；免疫电泳；免疫沉淀等。该反应通常包括显示标记，例如荧光、 化学发光、放射性或酶标记或染料分子，或检测抗原和抗体之间或与它们反应的抗 体间复合物的形成的其它方法。可将例如以下的固相载体用于分析中膜或微量滴定孔形式的硝基纤维素；片状 或微量滴定孔形式的聚氯乙烯；珠或微量滴定板形式的聚苯乙烯橡胶；聚偏二氟乙 烯树脂(polyvinylidine fluoride);重氮化纸；尼龙膜；活性珠等。通常，首先使固相载体与生物样品(或gpl20蛋白)反应，洗涤，然后施用抗体(或 怀疑含有抗体的样品)。在洗涤去除任何未结合的配体后，在适于结合的条件下加入 第二结合剂部分，从而使得该第二结合剂能选择性地与结合的配体结合。然后可采 用本领域熟知的技术检测第二结合剂的存在。通常，第二结合剂包含针对该抗体配 体的抗体。多种抗人免疫球蛋白(Ig)分子在本领域中是已知的(例如市售的山羊抗人Ig 或兔抗人Ig)。用于本文的Ig分子优选为IgG或IgA型，然而，在某些情况下IgM 也适用。可采用本领域技术人员已知的方法，使Ig分子能够很容易地与可检测酶标 记结合，例如辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、e-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和脲酶。 然后采用适宜的酶底物来产生可检测信号。或者，可采用"两种抗体夹心"分析法来检测本发明的蛋白质。在该技术中，首 先将固相载体与一种或多种抗Erw(例如gpl20)的抗体反应，洗涤，并暴露于测试样 品。再次加入抗体，采用直接的颜色反应或采用标记的二抗(例如辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶或脲酶标记的抗免疫球蛋白)使反应可见化。也可在溶液中进行分析，从而使病毒蛋白与其抗体在沉淀条件下形成复合物。然 后从测试样品中通过例如离心的方法分离沉淀的复合物。可采用多种标准方法中的 任何一种(例如上文所述的免疫诊断方法)来分析反应混合物以得到是否存在抗体-抗 原复合物。可在试剂盒中提供本文所述的如前所述产生的复合物或该复合物的抗体，在试剂
盒中附有说明书和其它必需的试剂，以如上所述地进行免疫分析。根据所用的具体 免疫分析法，该试剂盒还可包含适宜的标记和其它包装好的试剂和材料(即洗涤缓冲 液等)。可采用这些试剂盒来进行诸如上文所述的标准免疫分析。还可将复合物和编码该多肽的多核苷酸单独或组合用于疫苗组合物中，用于例如 预防性(即为了预防感染)或治疗性(为了治疗感染后的HIV)疫苗。所述疫苗可包含一种或多种修饰Env蛋白(或编码该蛋白质的核苷酸序列)的混合物，例如衍生自一个以 上病毒隔离群的Eiw(例如gpl20)蛋白。还可将该疫苗与其它抗原和免疫调节剂(例如，免疫球蛋白、细胞因子、淋巴因子和趋化因子，包括但不限于IL-2、修饰的IL-2(cysl25-ser125)、 GM-CSF、 IL-12、-干扰素、IP-IO、 MIP1和RANTES)—起给药。 可将该疫苗作为多肽或作为裸核酸疫苗(例如DNA)，采用病毒载体(例如逆转录病毒 载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)或非病毒载体(例如脂质体、用核酸或蛋白质包 被的颗粒)来给予。该疫苗还可包含蛋白和核酸的混合物，然后使用相同或不同的载 体对其进行递送。可多于一次地给予所述疫苗(例如"初免"(prime)给药，然后进行 一次或多次的"增强"(boost))以获得所需的效果。可给予相同的组合物作为初免和 给予一次或多次作为增强。此外，在初免和增强给药中可采用不同的组合物。疫苗将通常含有一种或多种"药学上可接受的赋形剂或载体"，如水、盐水、甘 油、乙醇等。此外，这种载体中也可存在辅助性物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物 质等。任选存在运载体，运载体是本身不会导致对接受组合物的个体产生有害抗体的一 种分子。适宜的运载体通常是大且代谢慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、 聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集物(例如油滴或脂质体)，以及无活性 的病毒颗粒。此类运载体对于本领域的普通技术人员而言是熟知的。此外，可将Eiw 多肽与细菌类毒素偶联，例如获自白喉、破伤风、霍乱等的类毒素。还可使用佐剂来增强疫苗的效果。佐剂本发明的疫苗可与其它免疫调节剂一起施用。具体地说，组合物将通常包含佐剂。用于本发明的佐剂包括但不限于 一种或多种下述的佐剂 A.含无机物的组合物适于用作佐剂的含无机物的组合物包括无机盐，例如铵盐和钙盐。本发明包括无
机盐，例如氢氧化物(例如氢氧化合物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等等，(例如参见(f度滞设z:六.j (Tacc/"e Z)ew'g".J的第8禾n 9章(1995) Powell & Newman编，ISBN: 030644867X. Plenum.)或不同无机化合物的混合物(例如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选具有过量的磷酸盐)，该化合物可以任何适宜的形式存 在(例如胶态、结晶、无定形等等)，优选吸附到该盐上。还可将含无机物的组合物配 制成具体的金属盐(W000/23105)。可包含铝盐从而使得A产的剂量为每剂0.2-1.0 mg。B.油乳剂适于用作佐剂的油乳剂组合物包括但不限于鲨烯-水乳剂，例如MF59 (5%鲨烯、 0.5% Tween 80和0.5% Span 85，通过使用微流化仪制备成亚微粒)。参见 WO90/14837。也可参见Podda，"含有新型佐剂的辅助流感疫苗利用MF59-辅助疫 苗白勺经验"(The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants: experience with the MF59-adjuvanted vaccine), Facc/"e (2001) 19: 2673-2680; Frey等，"用MF59-辅助的 流感疫苗和无辅助的流感疫苗在非老年成人中的安全性、耐受性和免疫原性比较" (Comparison of the safety, tolerability， and immunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvanted influenza vaccine in non-elderly adults), P^cc/"e (2003) 21:4234-4237。在FLUADTM流感病毒三价亚单位疫苗中，将MF59用作佐剂。用于组合物中的尤为优选的佐剂是亚微粒水包油乳剂。在本文中优选的亚微粒水 包油乳剂是任选地含有可变量的MTP-PE的鲨烯/水乳剂，例如含有4-5% w/v鲨烯、 0.25-1.0% w/v Tween 80 (聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)和/或0.25-1.0% Span 85tm (去水山梨糖醇三油酸酯)以及任选的N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰 胺酰基-L-丙氨酸-2-(r-2'-二棕榈酰基-s"-甘油-3-羟基磷酸磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)的亚 微粒水包油乳剂，例如，已知称为"MF59"的亚微粒水包油乳剂(国际申请 WO90/14837;美国专利6,299,884和6,451,325，以及Ott等，(f资度没7^, 皮效遂展》(％cc/"e De57'g".. 7Tze Sw6wmY a咖vc^ ^praacW (Powell ， M.F.禾口 Newman， M丄编)中的"MF59—设计以及在人用疫苗中的安全性和有效辅助性评估" (MF59 -- Design and Evaluation of a Safe and Pot ent adjuvant for Human Vaccines) Plenum Press,New York, 1995，第277-296页)。MF59含有4-5% w/v鲨烯(例如4.3%)、 0.25-0.5% w/v Tween 80，和0.5% w/v Span 85顶以及任选含有不同量的MTP-PE，采 用微流化仪(例如llOY型微粒化仪(Microfluidics， Newton， MA))配制成亚微粒颗粒。 例如，MTP-PE的量可为约0-500吗/齐U，更优选为0-250 (ig/剂，最优选0-100 pg/剂。 如本文中所用，术语"MF59-0"是指上述亚微粒水包油乳剂中没有MTP-PE，而术 语MF59-MTP则表示含有MTP-PE的制剂。例如，"MF59-100"为每剂中含有100 (ig MTP-PE，依此类推。MF69是本文中所用的另一种亚微粒水包油乳剂，它含有4.3% w/v鳘烯、0.25% w/v Tween 8()tm和0.75% w/v Span 85很以及任选的MTP-PE。另一 种亚微粒水包油乳剂是MF75，也称为SAF，其含有10%鲨烯、0.4% Tween 80 、 5。/o普流罗尼(pluronic)封端的聚合物L121以及thr-MDP,它也是通过微流化成为亚微 粒乳剂。MF75-MTP表示包含MTP的MF75制剂，例如每剂中含100-400貼MTP-PE。用于组合物中的亚微粒水包油乳剂、其制备方法以及免疫刺激剂(例如胞壁酰肽) 在国际申请WO90/14837和美国专利6,299,884以及6,451,325中有详细描述。也可将弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐齐附FA)用作本发明中的佐剂。C.皂苷制剂也可将皂苷制剂用作佐剂。皂苷是甾醇糖苷类(glycoside)和三萜系糖苷类的异种 类型，其存在于众多植物种类的树皮、叶、茎、根以及甚至花中。已对从皂树皮(^w/〃"/a 犯戶"a^ Molina )中分离的皂苷作为佐剂的用途进行了广泛的研究。皂苷还可从商业 途径获自丽花菝葜(Sm//ax (墨西哥菝葜，sars叩rilla)、满天星(Qy;wo/^/〃a/ am'cw/ato) (brides veil)禾口月巴阜草(Sa/xwfln'a q^ c/a"afo)(皇根，soap root)。阜苷佐齐U帝寸 剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。已通过高效薄层色谱(HP-TLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC))纯化了皂苷组合 物。匕对用这些技术获得的特定纯化部分进行了鉴别，包括QS7、QS17、QS18、QS21、 QH-A、 QH-B禾PQH-C。优选地，所述皂苷是QS21。生产QS21的方法在美国专利 5,057,540中有所揭示。皂苷制剂还可包括甾醇，例如胆固醇(参见W096/33739)。可将皂苷和胆固醇的组合用于形成被称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。 ISCOM通常还包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或卵磷脂。可将任何已知的皂苷用于 ISCOM中。优选地，ISCOM包括一种或多种Quil A、 QHA和QHC。 ISCOM在 EP0109942、 W096/11711和W096/33739中有进一步的描述。任选地，ISCOMS可 不含一种或多种其它去污剂。参见WO00/07621。关于基于皂苷的佐剂的发展的综述可参见Barr等，"ISCOM和其它基于皂苷的佐 齐U "(ISCOMs and other saponin based adjuvant), JcAwzcedZ>wg De//ve^y i ev/e鄉(1998) 32:247-271。还可参见Sjolander等，"口服皂苷和ISCOM疫苗的吸收和辅助活性" (Uptake and adjuvant activity of oral delivered saponin and ISCOM vaccines),」cfw"cet/ i>wg De//veo^ev/ewy (1998) 32:321-338。D. 病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可将病毒体和病毒样颗粒(VLP)用作佐剂。这些结构物中通常含有任选与磷脂 组合或一起配制的一种或多种获自病毒的蛋白质。它们通常是非病原性、不可复制 且通常不含任何天然病毒基因组。可重组产生病毒蛋白或从全病毒中分离病毒蛋白。 适用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括衍生自下组的蛋白质流感病毒(例如 HA或NA)、乙型肝炎病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德 毕斯病毒、呼肠孤病毒、口蹄病病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、 HIV、 RNA噬菌体、Qfi噬菌体(例如衣壳蛋白)、GA噬菌体、fr噬菌体、AP205噬 菌体和Ty (例如逆转录转座子Ty蛋白pl)。关于VLP的进一步讨论见WO03/024480、 WO03/024481和Niikura等，"作为口服疫苗载体递呈外源表位的嵌合重组戊型肝炎 病毒样颗粒"(Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes), K>o/ogy (2002) 293:273-280; Lenz等，"诱导树 突状细胞急性激活的乳头瘤病毒样颗粒"(Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells), Jo固a/。/7顯層/ogy (2001) 5246-5355; Pinto等，"用 重组HPV-16L1病毒样颗粒免疫的健康志愿者中，对人乳头瘤病毒(HPV)-16L1的细 胞免疫应答"(Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus (HPV)-16 LI Healthy Volunteers Immunized with Recombinant HPV-16 LI Virus-Like Particles), Jbwr朋/ o/7"/ec"ow ZXyeww (2003) 188:327-338;以及Gerber等，"人乳头瘤病毒样 颗粒与大肠杆菌热不稳定肠毒素突变体R192G或CpG共同给予时是有效的口服免疫 原"(Human Papillomavrisu Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG)， Jow"a/ o/ P ra/ogy (2001) 75(10):4752-4760。关于病毒体的进一步讨论可见例如， Gluck等，"未来疫苗开发中的新技术平台"(New Technology Platforms in the Development of vaccines for the Future), Facc/"e (2002) 20:B10-B16。在鼻内三f介 INFLEXAL 产品{Mischler & Metcalfe (2002) K"cc/"e 20增干U 5:B17-23}和 INFLUVAC PLUSTM产品中，将免疫增强的重新配制的流感病毒体(IRIV)用作亚单位 抗原递送系统。E. 细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如 (1 )厲^麥潔多薪(i尸》游求毒丝欲仝激这些衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-0-脱酰基MPL(3dMPL)。 3dMPL是 3脱-0-乙酰化单磷酰基脂质A与4、 5或6酰化链的混合物。3脱-O-乙酰化单磷酰 基脂质A的优选"小微粒"形式在EP 0 689 454中有所揭示。这些3dMPL的"小颗 粒"小到足以无菌滤过0.22微米膜(参见EP 0 689 454)。其它无毒性的LPS衍生物包 括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基垸基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物例如RC-529。参 见Johnson等，(1999)MW C7zem 9:2273-2278。(2) 微^ ,姓激脂质A衍生物包括获自大肠杆菌的脂质A衍生物，例如OM-174。 OM-174在例 如Meraldi等，"OM-174， 一种具有人用潜力的新佐剂，与合成的来自疟原虫环子孢 子蛋白的C端片段242-310 —起给予时引发保护性应答"(OM-174, a New Adjuvant with a Potential for Human Use, Induces a Protective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei)， ^cc/"e (2003) 21:2485-2491;禾卩Pajak等，"体内诱导小鼠树突 状细胞迁移和成熟的佐剂OM-174" (The Adjuvant OM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells in vivo), &cc/we (2003) 21:836-842中有所描 述。(3) 被W纖寡凝微适于用作本发明的佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(一种包含未甲基 化胞嘧啶、其后通过磷酯键连接有鸟苷的序列)的核苷酸序列。包含palindromic或 poly(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也已显示具有免疫刺激性。CpG可包含核苷酸修饰/类似物(例如硫代磷酸酯修饰)，可为双链或单链。可任选 地以类似物(例如2'-脱氧-7-去氮杂鸟苷取代鸟苷。参见Kandimalla等，"分枝合成核 苷酸基序识别模式具有细胞因子诱导性的有效免疫调节剂设计和进展"(Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern: design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles), A^c/e/c爿c/^ 7 ^earc/z (2003) 31(9): 2393-2400; WO02/26757和W099/62923中关于可能的类似取代。CpG寡核苷酸的佐剂效果在以下文献中有进一步讨论Krieg， "CpG基序细菌提取物中的活性成分？ " (CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts ), Atowe Me<afc/"e (2003) 9(7): 831-835; McCluskie等，"小鼠中采 用乙型肝炎表面抗原和CpG DNA的非胃肠道和粘膜初免-增强免疫策略"(Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA)， /mm丽o/ogy Mecfca/ M/craWo/ogy (2002) 32:179-185;WO98/40100;美国专利6,207,646;美国专利6,239,116和美国专利6,429,199。CpG序列可针对TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等，"Toll 样受体9:采用新合成的CpG DNA对识别和细胞因子诱导的调节"(Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs)， S/oc/ze顯'ca/Soc/e(y 7>wwa"/ora (2003) 31 (第3部分)654-658。该CpG序列可特异性 诱导Thl免疫应答，例如CpG-AODN，或可更特异性地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。 CpG-A和CpG-B ODN在以下文献中有所讨论Blackwell等，"CpG-A-诱导 的单核细胞可由IFN-Y诱导的蛋白-10的产生是由类桨树突状细胞衍生的IFN-a调 节的"(CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated by Plasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha)，J /wmw"o/. (2003) 170(8): 4061-4068; Krieg， "CpG的A-Z"(From Ato Z on CpG)， 7T^iVZ^ /" /mm,o/ogy (2002) 23(2): 64-65和WO01/95935。优选地，所述CpG是CpG-AODN。优选构建CpG寡核苷酸以使得5'端易于接受受体识别。任选地，可将两种CpG 寡核苷酸序列连接在它们的3'端以形成"免疫物"(immunomer)。参见例如，Kandimalla 等，"影响免疫刺激活性的CpG寡核苷酸二级结构"(Secondary structures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity) ， 5朋C (2003) 306:948-953 ; Kandimalla等，"Toll样受体9:采用新合成的CpG DNA对识别和细胞因子诱导的调 节"(Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic GpG DNAs)，历oc/zem/ca/So".e^ rraraac"o朋(2003) 3l(第3部分):664-658; Bhagat等，"作为强效免疫调节剂的CpG戊和己脱氧核苷酸"(CpG penta- and hexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents),朋i C (2003) 300:853-861和WO03/035836。(4)爿1)尸-拔薪基众毒#及,去毒欲主激可将细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物用作本发明的佐剂。优选地，所述 蛋白质衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素"LT")、霍乱("CT")或百日咳 ("PT")。去毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途在W095/17211有所描述， 作为胃肠道外佐剂的用途在W098/42375中有所描述。优选地，所述佐剂是去毒LT 突变体，例如LT-K63、 LT-R72和LTR192G。 ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物(尤 其是LT-K63和LT-R72)作为佐剂的用途可见以下参考文献Beignon等，"共同施用 于裸露皮肤后能增强肽抗原引发CD4+ T细胞和分泌Y干扰素能力的大肠杆菌热不 稳定肠毒素LTR72突变体"(The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enhances the Ability of Peptide Antigens to Elicit CD4+ T Cells and Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin), /"yfeWcw朋t/ 7mm扁'(y (2002) 70(6):3012- 3019; Pizza等，"粘膜疫苗作为粘膜佐剂的LT和CT的非毒性 衍生物"(Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants), &cc/"e (2001) 19: 2534-2541; Pizza等，"LTK63 and LTR72，两种已准备用于临床试 验的粘膜佐剂"，(LTK63 and LTR72， two mucosal adjuvants ready for clinical trials)， /W. J. Met/. M/craWo/ (2000) 290(4-5):455-461; Scharton-Kersten等，"采用细菌ADP-核糖基化外毒素、亚单位和无关佐剂的经皮免疫"(Transcutaneous Immunization with Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins, Subunits and Unrelated Adjuvants), ow/ /wmm//y(2000) 68(9):5306-5313; Ryan等，"作为鼻内递送无细胞百日咳疫苗的有效 粘膜佐剂的大肠杆菌热不稳定毒素突变体无毒性AB复合物的鉴别及其对Thl和 Th2细胞的酶活性"(Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Ace歸ar Pertussis Vaccine: Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Thl and Th2 Cells),a t//wwwm'(y (1999) 67(12):6270-6280; Partidos等，"大肠杆菌热不稳定肠毒 素及其定位突变体LTK63对T细胞应答鼻内共免疫的合成肽的增殖和细胞毒性的促 进，，(Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli and its site-directed mutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized synthetic peptides), /mmw"o/.(1999) ^2(3):209-216; Peppoloni等，"作为鼻内递 送疫苗的安全强效佐剂的大肠杆菌热不稳定肠毒素"(Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines), Face/"" (2003) 2(2):285-293;以及Pine等，(2002)"采用流感疫苗和去毒化的大肠 杆菌热不稳定肠毒素(LTK63)的鼻内免疫"(Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli (LTK63))， 乂 Cow加/Z^/ea化(2002) 85(l-3):263-270。氨基酸取代的数目参考优选以 Domenighini等，Mo/. A//croZ>/o/(1995) 15(6):1165-1167中所述的ADP-核糖基化毒素 A和B亚单位比对为基础进行。F. 生物粘附剂和粘膜粘着剂也可将生物粘附剂和粘膜粘着剂用作本发明的佐剂。适宜的生物粘附剂包括酯化 的透明质酸微球(Singh等，(2001口Ow ./ efe 70:267-276)，或粘膜粘着剂例如聚乙 烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、羧甲基纤维素、聚丙烯酸的交联衍生物。壳聚糖及 其衍生物也可在本发明中用作佐剂。见例如WO99/27960。G. 微粒还可将微粒用作本发明的佐剂。优选由生物可降解和无毒性材料形成的微粒(即 直径为约lOOnm到约150pm，更优选直径为约200nm到约30pm，最优选直径为约 500nm到约10pm的颗粒)，所述材料如聚(a-羟酸)、聚羟丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚 已酸内酯等等，其中优选聚(丙交酯-共-乙交酯)，任选地对其处理，使其具有带负电 荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子型去污剂，例如CTAB处理)。H. 脂质体适于用作佐剂的脂质体制剂的例子在美国专利6,090,406、美国专利5,916,588和 EP0 626 169中有描述。/.纖Z微微奪乙微應适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。W099/52549。此类制剂还 包括与辛苯聚醇(octoxynol)组合的聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂 (WO01/21207),以及与至少一种其它非离子型表面活性剂(例如辛苯聚醇)组合的聚氧 乙烯烷基醚或酯表面活性齐U(W001/21152)。优选的聚氧乙烯醚选自下组聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰 基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和 聚氧乙烯-23-月桂醚。J.聚磷腈(PCPP)PCPP制剂在例如Andrianov等，"通过使聚磷腈溶液共凝聚制备水凝胶微球" (Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions),历omafen'a^ (1998) 19(1-3):109匿115和Payne等，"从聚磷腈基质中释放蛋 白质"(Protein Release from Polyphosphazene Matrices),/>wg. Z)e/Zverj i ev/ew (1998) 31(3):185-196中有所描述。 K.胞壁酰肽适于在本发明中用作佐剂的胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thr-MDP)、 N-乙酰基-正胞壁酰-l-丙氨酰基-d-异谷酰胺(nor-MDP)和N-乙酰 胞壁酸基-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺酰基-l-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基 磷酸磷酰氧)-乙胺MTP-PE)。 L.咪唑并喹啉化合物适于用作本发明佐剂的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特及其类似物，其进一步的描述见Stanley,"咪喹莫特和咪唑并喹啉的作用机制和治疗效果"(Imiquimod and the imidazoquinolines: mechanism of action and therapeutic potential), C7/w ￡x/ Z)erw"to/(2002) 27(7):571-577; Jones,"咪喹莫特3M" (Resiquimod 3M)， C群一" /匿Wg/>啷(2003) 4(2): 214-218;和美国专利4,689,338、 5,389,640、 5,268,376、 4,929,624、 5,266,575、 5,352,784、 5,494,916、 5,482,936、 5,346,905、 5,395,937、 5,238,944 和5,525,612。M.縮氨基硫脲化合物适于用作本发明中佐剂的縮氨基硫脲化合物及其配制、生产和筛选方法的例子包 括WO04/60308中所描述的那些。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞以产生细胞 因f (例如TNF- a )中尤为有效。N.色胺酮化合物。适于用作本发明中佐剂的色胺酮化合物及其配制、生产和筛选方法的例子包括 WO04/64759中所描述的那些。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞以产生细胞因 子(例如TNF- a )中尤为有效。本发明还可包括一种或多种上述鉴定佐剂的组合。例如，在本发明中可使用以下 佐剂组合(1) 皂苷和水包油乳剂(W099/11241);(2) 皂苷(例如QS21) +无毒性LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153);(3) 皂苷(例如(^21)+无毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4) 皂苷(例如QS21)十3dMPL+IL陽12(任选地+甾醇)(W098/57659);(5) 3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合(参见欧洲专利申请0835318、 0735898和0761231);(6) SAF:含10%鲨烯、0.4% Tween 80、 5%普流罗尼封端的聚合物L121和
thr-MDP，微流化成亚微粒乳剂或经涡旋产生较大粒径的乳剂。(7) RibiTM佐剂系统(RAS)， (Ribi Immunochem):含有2%鲨烯、0.2。/oTween80和一种或多种选自下组的细菌细胞壁成分单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯 (TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS (Detox );以及(8) —种或多种无机盐(例如铝盐)+ LPS的无毒性衍生物(例如3dPML)。(9) 一种或多种无机盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的 核苷酸序列)。O.人免疫调节剂适于用作本发明中佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(例如IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-12等等)、干扰素(例如干扰素-力、巨噬细胞集落 刺激因子和肿瘤坏死因子。铝盐和MF59是用于注射用流感疫苗的优选佐剂。细菌毒素和生物粘附剂是用于 粘膜递送疫苗(例如鼻内疫苗)的优选佐剂。上文引用的全部专利、专利申请和期刊文章中的内容以其全文纳入本文作为参考。通常，疫苗组合物以液体溶液或悬液形式配制成供注射用的组合物；也可制备成 适于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。如前所述，还可乳化或在脂质 体中包封该制剂以增强佐剂的效果。疫苗将包含治疗有效量的本文所述的杂合分子或复合物、或这些复合物的其它复 合物、或其编码核苷酸序列、抗这些复合物的抗体以及上述任何其它组分，根据需 要而定。"治疗有效量"是指可在接受给药的未感染的、感染的或未暴露的个体中诱 导保护性免疫应答的量。该应答通常会使得对象中发生针对疫苗的分泌型细胞和/或 抗体介导的免疫应答。通常，该应答包括但不限于一种或多种以下效果产生任何 免疫类型的抗体，例如免疫球蛋白A、 D、 E、 G或M; B和T淋巴细胞的增殖；为 免疫细胞提供活化、生长和分化信号；辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细 胞的扩增。例如，抗体在天然状况下可被中和、可产生抗体依赖性细胞、介导细胞 毒性、或者可与具有这种活性的其它抗体或与介导对病毒感染和/或复制的反应的细 胞发生协同反应。优选地，所述有效量足以对疾病症状形成治疗或预防作用。所需的确切量随以下 因素而变化治疗对象；待治疗个体的年龄和总体情况；个体免疫系统合成抗体的
能力；所需的保护程度；所治疗病症的严重程度；所选复合物及其给药模式以及其 它因素。本领域技术人员可很容易地确定适宜的有效量。"治疗有效量"落于可通过 常规试验确定的相对宽泛的范围内。一旦配制完成，可如上所述地通过用常规注射器或基因枪(例如Accelf基因递送 系统(PowderJectTechnologies, Inc., Oxford, England))的注射，利用病毒载体或不利 用病毒载体来施用该核酸疫苗。将DNA递送入表皮是尤为优选的给药方式，因为该 给予方式为皮肤相关的淋巴细胞提供了通路，并在接受者中提供了瞬时存在的DNA。 可注射核酸和/或肽，或通过皮下、表皮、皮内、粘膜内例如鼻内、直肠、阴道、腹 膜内、静脉内、口服或肌内方式给药。给药的其它模式包括口服和肺部给药、栓剂、 无针注射、经表皮和经真皮施用。药量治疗可为单剂方案或多剂方案。还可将肽或 其它物质与核酸联合给药。虽然已结合优选的特定实施方式描述了本发明，应理解上述描述以及下文的实施 例是用于说明，而不是限定本发明的范围。本发明范围中的其它方面、优点和改变 对于本发明所属领域技术人员而言是显而易见的。实施例以下是实施本发明的特定实施方式的实施例。提供这些实施例是仅为说明的目 的，而不是为了以任何方式限定本发明的范围。已尽可能确保所用数值(例如数量、温度等等)的精确性，但理所当然应允许存在 某些试验误差和偏差。实施例1设计含TAT多肽和CD4最小组件的杂合蛋白如下设计含有人CD4 env结合结构域的新的杂合蛋白。分析CD4-gpl20的三维 (3D)结构并鉴定了与erw结合有关的CD4区域。具体地说，对应于CD4氨基酸残基 15-85的区域基本上完全埋入eiw的CD4结合口袋(图4)。该片段被称为CD4最小组 件，且Cysl6和Cys84之间存在二硫键可稳定该片段。随后采用标准分子生物学技术将CD4最小组件(残基15-85)克隆入各种表达盒以 表达Tat-CD4融合蛋白。该表达盒包含编码CD4最小组件的序列和在侧接此序列的 编码Tat多肽的序列。具体地说，如图5所示，该表达盒从5'到3，方向上包括编 码Tat的残基1-20、 CD4的残基15-85(CD4最小组件)、Tat的残基30-86的序列；或 编码Tat的残基1-30、 CD4的残基15-85(CD4最小组件)、Tat的残基40-86的序列； 或编码Tat的残基l-40、CD4的残基15-85(CD4最小组件)、Tat的残基50-86的序列； 或编码Tat的残基1-50、 CD4的残基15-85(CD4最小组件)、Tat的残基60-86的序列。 用上述不同Tat-CD4融合构建物(具有与Tat基因融合的一部分CD4)转染293细 胞。按照Srivastava等(2003) ( / F/ra/. 77(20): 11244-11259)的描述使细胞生长在常规 293培养基中。转染72小时后收集上清液，并用含NP40(0.5。/。)(Sigma， St.Louis， MO)的缓冲液制备裂解液。按照Srivastava等(2003) (J Kra/. 77(20): 11244-11259)的 描述将裂解液和上清液样品(每道15 (il)加入Bis Tris凝胶(Invitrogen， Carlsbad， CA)。 将凝胶材料转移到硝基纤维素膜上，并用抗-CD4单克隆抗体以及抗-Tat小鼠多克隆 抗血清(1:400稀释)和抗-B肌动蛋白(1:500稀释)探测印迹，如Srivastava等(20(B) ( / Wra/. 77(20): 11244-11259)所述(抗小鼠荧光(florescence)偶联的抗体以1:30000稀释， 用Odyssey法检测)。如图9所示，Tat被抗Tat抗体识别，说明在Tat基因的不同位置引入CD4最小 结构域不会影响Tat的表达。有证据表明，含或不含组织纤溶酶原激活剂前导(tPA) 序列的构建物的表达曲线之间存在一些差异。除了构建物#31，不含tPA时Tat-CD4 的表达可以忽略。然而，加入tPA前导序列似乎可增强表达。可进行研究以证实 Tat-CD4融合蛋白保留了结合HIVEnv并诱导构象改变的能力。当表达时，该融合蛋白包含CD4的Env结合位点并减少了不需要的CD4表位， 同时还包含可引起Tat特异性免疫应答的Tat多肽。Env蛋白单体和低聚体的各种实 施方式可结合于Tat-CD4杂合体融合分子，其中包括gpl20、 gpl40和gpl60以及它 们的变体。实施例2制备ENV-融合蛋白复合物在用甲醛处理和不用甲醛处理的条件下，制备稳定的纯化的env-杂合蛋白复合 物。例如，为了在env中诱导构象变化，将等摩尔浓度的env(例如SF2或SF162)以 及含CD4最小组件和一种或多种Tat多肽的杂合分子在37。C下一起孵育1小时。在 细胞水平上，这些相互反应是瞬时的。因此，在孵育结束后， 一半的复合物经甲醛 固定，而另一半则保持为未处理。在Superdex-200柱上分离处理和未经处理的复合 物。在HPLC柱和SDS-PAGE上分析纯化部分。该纯化复合物同时包含env和融合 蛋白。此外，这些复合物可望是均匀的并将包含不超过2-3%的游离融合蛋白。
通过对可由CD4诱导的表位的诱导来监测Erw与杂合分子的复合能力，所述可 由CD4诱导的表位是采用标准技术用MAb 17b和4.8d识别的。具体而言，随后通 过表面质谱共振(SPR)对在SF162 Env背景下产生的纯化嵌合物(chimerae)进行表征 以评估CD4i表位的暴露，并通过共同受体结合测试评估它们的结合亲和力。也可参 见Devico等，(1996) F ra/ogv 218:258-263和Zhang等，(1999)所ocAew&^y 38(29): 9405-9416，这些文献显示对另一CD4小蛋白的SPR测试，通过采用单克隆抗体17b 的检测显示该CD4小蛋白能与sCD4竞争结合相同的env位点，并诱导包膜构象变 化(Sullivan等，(1998) / F ra/ 72(8):6332-6338)。该抗体识别位于gpl20 V3环附近且 主要由Vl/V2保守茎部组成的表位，该表位可能被侧接的Vl/V2和V3环所掩盖 (Kwong等，(1998)Atoww (伦敦)393:648-659;Rizzuto等，(1998) Sc/^ce 280:1949-1953) 但在与CD4复合的env中暴露出来。小蛋白的加入对抗体最大结合和结合速率提高 的影响是很小的，可能反映了它的env结合亲和力较低，但具有特异性和易于检测。 这些操作可应用于gpl20、 gpl40和gpl60单体、寡聚物及其变体(例如制备稳定纯化的杂合蛋白复合物)。此类变体包括例如env中f3折叠的缺失以及V2/V3环的缺失坐寸o实施例3产生中和抗体可通过多种本领域熟知的途径来递送含有本发明组合物的疫苗，这些途径包括， 例如在一种或多种制剂中递送多肽抗原和/或递送表达所述多肽的多核苷酸。例如， DNA初免/蛋白质强化策略允许在兔和非人灵长类中筛选多种具有在作为DNA疫苗 送递时在宿主中原位呈递表位的能力的Env结构。DNA接种可包括给予裸DNA、 与微粒(如PLG颗粒)复合的DNA或作为病毒载体的一部分的DNA，然后进行蛋白 质强化。使用病毒载体的电穿孔或DNA接种法以及本文所述的其它方法可用于有效 地将编码杂合蛋白和/或Erw多肽的多核苷酸递送给非人哺乳动物(例如灵长类)。A. CD4-TAT杂合蛋白-ENV复合物在第0、 4、 12和24周对4-5只/组或更多只/组的兔分别进行免疫。两周一次 (bhveekly)收集血清并通过针对例如SF2 gpl20或SF162 gpl20进行ELISA分析。这 些动物对gpl20发生强的免疫应答。不出所料，除了抗-gpl20反应，这些复合物还 诱导强的抗-CD4反应。因此，合理设计的含CD4小蛋白的融合蛋白能以高亲和力结合于不同包膜形式 (包括带有和不带有V2缺失的低聚和单体形式的SF162)，在这些蛋白质中诱导构象 变化并诱导完全暴露出保守隐藏的、CD4可诱导的表位和/或共同受体结合位点。因 此，该融合蛋白可用于与包膜蛋白复合以将包膜表位暴露给中和抗体，从而可在疫 苗制剂中具有潜在的用途。B. ENV-CD4/TAT蛋白构建物在第O、 4、 12和24周免疫4-5只/组或更多只/组的兔。两周收集血清一次并进 行ELISA分析。然后在恒河猴中对这些兔的研究中鉴别出的复合物进行测定。C. 猴用带有佐剂的Env-CD4/Tat复合物或Env-CD4/Tat蛋白构建物免疫5只/组或更多 只/组的猴子，并同时设立仅采用Env蛋白和仅采用CD4/Tat分子的对照组。用带有 和不带有V2缺失的单体和低聚形式的SF162 Env制备复合物，与兔中的抗体应答进 行比较。免疫方案是在第O、 4和24周时进行免疫；认为需要时，可在以后的时间 点给予额外的增强剂。实施例4低聚包膜蛋白中GP41亚单位的隐藏表位的暴露CD4最小组件和包含这些最小组件的融合蛋白可诱导低聚(o-gpl40)包膜蛋白构 型的转化，暴露出接近gpl20亚单位中的共同受体位点的隐藏表位，并有效提高在 不同gpl20包膜蛋白中的共同受体结合亲和力。采用SPR技术和2F5 mAb或DP178 肽(或同源物)对通过本文CD4最小组件和含有这些CD4小蛋白的融合蛋白诱导的这 种构象转变进行了测试。还检测了加上获自CCR5共同受体N端结构域的肽(已显示 该肽结合于gpl20)的效果。如果证实了gp41表位的暴露，则将该肽化学偶联于CD4融合蛋白，以产生新型 的在暴露gp41表位中具有提高潜能的双官能配体。也采用化学或遗传学方法产生掺 入了该双官能配体的新型嵌合低聚包膜蛋白，并对其进行了测试。然后在动物中测 试具有优良暴露gpl20和gp41隐藏表位特性的候选包膜蛋白对中和抗体的诱导作 用。实施例5产生靶向ENV隐藏保守表位的单克隆抗体按照标准操作，将所选融合蛋白和含有这些融合蛋白的复合物免疫原注射入大鼠 以制备单克隆抗体。在ELISA中筛选抗CD4小蛋白-gpl20复合物、抗与o-gpl40、o-gpl40复合的CD4小蛋白融合蛋白以及抗单独的gpl20禾t] o-gpl40的克隆。在 Biacore中进一步测试与单独的包膜蛋白相比对于复合物具有最高亲和力的克隆。选 择在Biacore中抗CD4M33-gp120和/或CD4M33-o-gpl40复合物的评分为阳性的克 隆，并用于大量生产腹水。
权利要求
1. 一种杂合分子组合物，其含有骨架多肽和CD4小蛋白，当所述杂合分子结合 HIV Env多肽时所述杂合分子诱导所述HIV Env多肽发生构象改变。
2. 如权利要求1所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述骨架多肽选自侵袭素 多肽或tat多肽。
3. 如权利要求1或2所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述骨架多肽是异源多肽。
4. 如权利要求1或2所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述骨架多肽是同源多肽。
5..种杂合分f组合物，其含有HIV Tat多肽或其片段；和CD4小蛋白，其中 所述杂合分子结合于HIVEnv多肽。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述CD4小 蛋白是含有CD4的氨基酸残基15-85的CD4最小组件。
7. 如权利要求2-5中任一项所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述Tat多肽 包括全长Tat多肽或其变体。
8. 如权利要求7所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述Tat多肽是包含Tat 蛋广i!氨基酸残基1-86的全长Tat多肽的片段或其变体，根据SEQ ID NO:2或其变体 编号。
9. 如权利要求1-8中任一项所述的杂合分子组合物，还包含一种或多种其它异源 多肽。
10. 如权利要求9所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述一种或多种其它异 源多肽选自病毒多肽、免疫调节多肽或细菌多肽。
11. 如权利要求IO所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述其它异源多肽是病 毒多肽，所述病毒是HIV。
12. 如权利要求1-11中任一项所述的杂合分子组合物，其特征在于，所述HIVtat 多肽或其片段、CD4小蛋白和其它异源多肽中的一种或多种以编码所述多肽、其片 段或小蛋白的多核苷酸提供。
13. —种免疫原性组合物，其含有如权利要求1-12中任一项所述的杂合分子组合 物和HIV Env多肽。
14.如权利要求13所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述HIVEnv多肽包 括gpl20或低聚gpl40。
15. —种免疫原性组合物，其含有如权利要求1-12中任一项所述的杂合分子组合 物和HIVEnv多肽，其中所述杂合分子组合物通过交联与所述HIVEnv多肽复合。
16. 如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述杂合分子组合物通 过用固定剂交联而与所述HIV Env多肽复合。
17. 如权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述固定剂包括甲醛或戊—r.醛。
18. -种免疫原性组合物，其含有如权利要求1-12中任一项所述的杂合分子组合 物和HIVEnv多肽，其中所述杂合分子组合物和所述HIVEnv多肽自发形成复合物。
19. --种免疫原性组合物，其含有如权利要求1-12中任一项所述的杂合分子组合 物、HIV Env多肽和CD4最小组件-Tat融合蛋白。
20. 如权利要求13-19中任一项所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。
21. —种多核苷酸，其编码HIV tat多肽或其片段、CD4小蛋白和异源多肽中的 亍:少一种。
22. 如权利要求21所述的多核苷酸，还编码HIVEnv多肽。
23. —种细胞，其含有权利要求21或22所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸 操作性连接于与在所述细胞中表达所述多核苷酸相容的控制元件。
24. —种载体，其含有权利要求21或22所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸 操作性连接于与在对象中表达所述多核苷酸相容的控制元件。
25. —种制备结合于HIVEnv功能性表位的抗体的方法，所述方法包括在允许在 所述对象中产生抗体的条件下给予该对象如权利要求13-20中任一项所述的免疫原 性组合物。
26. 如权利要求25所述的方法，还包括分离所述对象中产生的抗体的步骤。
27.
28. —种制备含有与CD4蛋白复合的HIVEnv多肽序列的多肽的方法，所述方法 包括在允许表达所述多核苷酸并产生含有所述HIV Eiw多肽的所述多肽的条件下孵 育如权利要求23所述的细胞。
29. —种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象其量足以在 所述对象中诱导免疫应答的如权利要求13-20中任一项所述的免疫原性组合物。
30. —种DNA免疫方法，所述方法包括在对象中引入如权利要求24所述的载体。
31. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述载体是非病毒载体。
32. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，用微粒运载体将所述载体引入所述对象。
33. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。
34. 如权利要求29-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
35. 如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
36. —种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括在允许在所述对象中表达 所述多核苷酸并产生编码的多肽的条件下用权利要求24所述的载体转染所述对象的 细胞。
37. 如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述载体是非病毒载体。
38. 如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述载体用微粒运载体递送。
39. 如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。
40. 如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
41. 如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
42. 如权利要求36-41中任一项所述的方法，其特征在于，所述转染离体进行且 所述转染的细胞被重新引入所述对象。
43. 如权利要求36-41中任一项所述的方法，其特征在于，所述转染在所述对象 体内进行。
44. 一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括(a) 在初免步骤中给予所述对象第一组合物，其中所述第一组合物包含编码HIV tat多肽或其片段、CD4小蛋白和异源多肽中至少一种的多核苷酸；和(b) 以足以在所述对象中诱导免疫应答的量给予所述对象第二组合物作为增强 剂，其中所述第二组合物包含如权利要求1-20中任一项所述的组合物。
45. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述第一组合物的多核苷酸还编码 HIV Env多肽。
46. 如权利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述第一组合物或第二组合 物还含有佐剂。
47. 如权利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述第一组合物还含有编码 HIV Gag多肽的序列。
48. 如权利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述第二组合物还含有HIV
全文摘要
描述了一种含有与一种或多种HIV Tat多肽组合的CD4最小组件或模拟物的杂合分子，所述CD4最小组件或模拟物与HIV Env多肽结合。还描述了这些杂合分子与Env的复合物以及用所述多核苷酸和多肽进行诊断、治疗和预防的方法。
文档编号C07K19/00GK101146827SQ200680008974
公开日2008年3月19日 申请日期2006年2月3日 优先权日2005年2月3日
发明者I·斯里瓦斯塔瓦, R·拉普奥里, S·巴尼特, V·沙马 申请人:诺华疫苗和诊断公司