用于生成生物分子和核酸的结合信息的标记物及其制备方法，利用上述标记物的生物分 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于生成在由生物分子组成的生物试样中的生物分子和分析单链核酸的结合信息的基准物质及核酸芯片，其制备方法及利用它们的生物分子分析方法，基准物质及核酸芯片能够使用于分析生物分子的生物学意义。并且，本发明涉及用于生成生物分子与配体之间的结合信息的外部标记物和生物芯片的制备方法及利用它们的生物分子分析方法。本发明的外部标记物及生物芯片能够使用于分析生物分子的生物学意义的领域。
【专利说明】
用于生成生物分子和核酸的结合信息的标记物及其制备方 法，利用上述标记物的生物分子分析方法及装置
技术领域
[0001] 本发明涉及预测在由生物分子组成的生物试样中的生物分子的生物学意义的基 准物质及核酸芯片，它们的制备方法及利用它们的生物分子分析方法及装置，并且，涉及用 于生成生物分子与配体之间的结合信息的外部标记物及生物芯片的制备方法及利用它们 的生物分子分析方法。
【背景技术】
[0002] 生产组成生物试样的许多生物分子(蛋白质及碳水化合物）的实验方案的技术随 着物理学、生物化学及生物信息学的发展而广泛开发，但由于对现有方法或设备的使用及 维护费、容易性、准确度、敏感度、检查时间及过程的自动化等问题，对有效的新方法及装置 的必要性非常高。
[0003] 在包括生物分子的生物试样中，综合它们的生物分子的定量状态的信息，即，生产 生物分子的实验方案(profile)的方法，其本身不是最终目标，而是用于实现目标的一种手 段，但是由于能够有用地使用于微生物、细胞及组织等，因此广泛地应用于医学、兽医学、环 境工程学、食品工程学及农业等。
[0004] 用于对利用生物试样中的生物分子的实验方案的生物学意义进行分析的临床决 策支持系统(Clinical Decision Support System)为用于支持医生在患者诊疗过程中对 诊断和治疗做决定的(Decision Making)过程的系统。临床决策支持系统分为基于机器学 习的案例推理系统（Case Based Machine Learning Inference System)和专家系统 (Expert System)两大类。基于机器学习的案例推理系统在收集判定出疾病的患者们的临 床信息(Clinical Informat ion)及生物学信息，即生物分子实验方案数据之后，能够利用 机器学习，通过现有的临床信息和生物学信息等来推理或辨别疾病的系统。专家系统为医 学专家使用事先设定的规则(Rule)来诊断疾病的系统。
[0005] 核酸为核苷酸以共价键合方式相连接的线性多聚体，核苷酸作为小的有机化合 物，是磷酸、糖及嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤）或嘧啶(胞嘧啶、胸苷及尿嘧啶）。核酸以单链或双 链的形式存在，单链核酸在特定的物理条件下通过核苷酸之间的氢键及相互作用来结合， 并生成独特的立体结构，而这种立体结构由单链的碱基序列决定。
[0006] -般来说，脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)之类的核酸虽然为用于发现具有 细胞结构及酶等活性的蛋白质的信息的储存体，但是自从1982年有报告指出核糖核酸生成 特定的结构，从而具有酶的活性之后，有很多关于核酸的结构上的特性和对其特定功能的 报告。
[0007] 核酸由四个碱反复组成，来维持高的多样性，并生成很多立体结构，而这种立体结 构通过与特定物质相互作用，来生成复合物并实现稳定化。
[0008 ]核酸能够作为一种单链核酸（1 i gan d)来作用于包含蛋白质的分子，按多种碱基顺 序排列的单链核酸从组合的库中通过规定的筛选过程和碱基序列决定来筛选以高的结合 力和特殊性与特定物质相结合的核酸。
[0009] 筛选与特定物质相结合的核酸的方法被称为指数富集的配基系统进化技术 (SELEX,Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)，筛选的核酉爱被 称为所谓的适配体（aptamer)(Tuerk C.and Gold L.;Science，249，pp505_510，1990)〇
[0010] 通过这种指数富集的配基系统进化技术来筛选能够在自然状态下与核酸相结合 的蛋白质或能够以非常高的亲和力与包含未与核酸相结合的蛋白质的多种生物分子相结 合的核酸(适配体）。
[0011] 但是，通过现有的指数富集的配基系统进化技术的核酸筛选方法作为在筛选与特 定物质(例如，蛋白质)特别地相结合的核酸之前，大量生产相关蛋白质(特定物质），并在实 施纯化之后，使单链核酸库与所生产的蛋白质发生反应，并通过反复实施选择和扩增来选 定结合力强的核酸(适配体)的方法，必须确保用于筛选核酸的优先特定物质。因此，通过现 有的指数富集的配基系统进化技术的核酸筛选方法完全没有认识到从包含于生物试样的 许多未知的生物分子组体中筛选并利用作为具有意义的组体的核酸的技术思想。生物分 子-单链核酸的选择能够以多种方法进行，具有通过固定生物分子来收获并清洗复合物的 方法及毛细管电泳方法等。
[0012] 包含组成生物试样的组织、细胞块、细胞及微生物等未知分子的生物分子的实验 方案通过利用物理、化学性质来，以多种方法制成，一般通过利用生物分子的分子量或pi值 等进行电泳，从而在生物试样中确认生物分子的定量状态的生物分子的实验方案。
[0013] 并且，执行通过分析实验方案来决定生物分子并对此进行分离之后，通过基质辅 助激光解吸电离飞行时间（MALDI_T0F，Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight)等来确认这些组成成分的方法等。最近，根据表面增强激光解离飞行时间 质谱技术（SELDI-TOFMS，Surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)进行针对蛋白质实验方案的很多研究(Adam et al.，Cancer Research,62,3609-3614.2002；Li et al.,Clinical Chemistry,48,1296-1304.2002；and Petricoin et al.，The Lancet，359,572_577.2002)〇
[0014] 并且，最近通过对蛋白质组的高通量筛选技术(High Throughput Screening)来 开发并使用蛋白质芯片(Protein chip)或适配体芯片(Aptamer chip)(Smith et al.，Mol Cell Protomics,11-18.2003；and McCauley et al.,Anal Biochem,319(2),244-250.2003)。使用于这种高通量筛选技术的载体具有载玻片、生物传感器的检测表面、微珠 及纳米粒子等。
[0015] 由于蛋白质芯片了解抗体的排列状态，因此可以对特定物质的区分及定量进行探 索及分析。蛋白质芯片的制备方法具有利用微陈列（Microarrayer)来对抗体进行点样 (spotting)来固定的方法。蛋白质芯片检测技术应由蛋白质芯片作为一个芯片，能够检测 在各种抗体以高密度堆积于用于通过一种芯片尽可能提供很多信息的窄的面积的状态下 所发生的非常弱的信号。并且，随着对蛋白质的生物体信息增加，其堆积度也以更高的趋势 发展，因此需要能够以定量性的方式对此进行迅速且准确的检测的新方法。
[0016] 到目前为止，检测方法主要使用激光感生荧光法（laser induced fluorescence)，并正在开发电化学检测方法等。通过如上所述的多种过程，虽然正在开发 在利用蛋白质芯片的生物试样中分析特定蛋白质的实验方案的方法，但由于使用高价的设 备及试剂，因而存在需执行复杂的过程等问题，并且具有仅限于对制备抗体的分子进行制 备的界限。
[0017] 适配体芯片在将适配体(核酸)使用于蛋白质芯片来代替使用抗体，在这一方面不 同，而在除此之外的其他要素方面非常类似。
[0018] 如上所述，虽然正在开发在利用蛋白质芯片及适配体芯片的生物试样中生产生物 分子的定量状态，即，实验方案的方法，但存在使用高价的设备及试剂，且需执行复杂的过 程等问题。尤其，到目前为止的蛋白质芯片或适配体芯片仅限于对能够制备抗体或适配体 的已知的蛋白质进行有限的制备。
[0019] 已知，生物试样由数百万个蛋白质组成，但当前公认的的蛋白质的数仅为数万个， 因此，非常需要在生物试样中生产未知的蛋白质等未知的生物分子的定量状态，即，实验方 案的技术。
[0020] 本发明人虽然提出了生产对蛋白质组的实验方案的颠倒-指数富集的配基系统进 化技术(reverse-SELEX)(参照韩国特许登录10-0670799号）、基于适配体核酸芯片(参照韩 国特许登录第10-0464225)及利用基于适配体核酸芯片的生物学意义分析技术(参照韩国 特许登录第10-0923048号)等，但由于在进行生产蛋白质组实验方案的高通量筛选技术时， 无法提出适当的基准物质及质量控制（qua 1 ity contro 1)方案，因而存在无法可能无法对 实验方案生产及分析进行适当的质量控制的问题，而本发明为了解决此现象而提出。
[0021] 总体分析生物试样的生物分子的研究能够通过分析在医学方面与疾病相关的生 物分子的实验方案，来用于查明能够诊断疾病的生物分子、能够分析治疗性的生物分子、对 疾病的发病及进行起到重要作用的生物分子、与疾病的感受性相关的生物分子及新药开发 的靶分子。
【发明内容】
[0022] 技术问题
[0023] 本发明的目的在于，提供既能进行内部质量控制，又能用于与由两种或两种以上 生物分子组成的生物试样中的生物分子生成分析单链核酸的结合信息的基准物质、核酸芯 片、它们的提供方法及利用它们的生物分子分析方法及装置，并且从利用它们来有效地生 成的结合信息中分析包括相关生物分子的疾病信息的各种生物学意义。
[0024] 并且，本发明的另一目的在于，提供能够生成包含于生物试样的生物分子与配体 之间的结合信息的外部标记物及生物芯片，从而从利用它们来有效地生成的结合信息中分 析包括相关生物分子的疾病信息的各种生物学意义。
[0025] 技术方案
[0026] 所要实现这些目的的本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，在通过核酸分 析方法对与生物试样中的生物分子相结合的分析单链核酸进行分析的同时，通过核算分析 方法对与质量控制用的外部基准物质相结合的单链核酸进行分析，从而实现内部质量控 制；其中，上述生物试样包含从由随机碱基序列组成的随机单链核酸所构成的核酸库中选 定的两种或两种以上的生物分子。
[0027]并且，本发明提供核酸芯片，其特征在于，使用本发明的结合单链核酸及质量控制 单链核酸的碱基序列来合成的捕获探针固定于载体，并生成用于选定分析单链核酸的结合 单链核酸及质量控制单链核酸的结合信息。
[0028] 并且，本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，通过使用上述本发明的分析单 链核酸来使用用于分析上述生物试样中的生物分子的上述质量控制基准物质，并通过核酸 分析方法来分析上述质量控制单链核酸，并进行内部质量控制。
[0029] 并且，本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，利用以混合分析靶探针和比较 靶探针的方式制备的靶探针来分析上述核酸芯片，上述分析靶探针以使生物试样中的生物 分子与分析单链核酸发生反应的方式制备，上述比较靶探针以使对照组生物试样中的生物 分子与上述分析单链核酸发生反应的方式制备。
[0030] 并且，本发明提供核酸芯片，其特征在于，组成为使用分析单链核酸及上述质量控 制单链核酸的碱基序列来制备的捕获探针固定于载体的结构，并使用于生成用于分析上述 生物试样中的生物分子的生物学意义的上述生物分子和上述分析单链核酸的结合信息。
[0031] 并且，本发明提供基准物质，其特征在于，由不包含于生物试样的外源分子组成， 使用在用于通过上述分析单链核酸来分析上述生物试样中的生物分子的生物学意义的分 析过程的质量控制及包含于生物试样的生物分子的定量分析。
[0032] 并且，本发明提供生物分子分析试剂盒，其特征在于，使用用于分析上述生物试样 中的生物分子的生物学意义的上述分析单链核酸及上述基准物质。
[0033] 并且，本发明提供生物分子分析装置，其特征在于，通过利用分析单链核酸及上述 基准物质的生物分子分析方法来分析上述生物分子，并包括试样处理装置和扩增装置的分 析生物分子的系统，上述试样处理装置用于准备上述生物试样中的生物分子，上述扩增装 置由制备上述生物分子-单链核酸复合物，并扩增上述生物分子-单链核酸复合物的模块及 对上述扩增的产物进行分析的模块组成。
[0034] 有益效果
[0035] 根据上述所述的本发明的基准物质、核酸芯片及由利用它们的两种或两种以上生 物分子组成的生物试样中的生物分子分析方法，能够利用高通量筛选技术的非常简单且低 廉并有效的方法及装置来生产包含微生物、细胞及蛋白质的生物试样所包含的生物分子的 实验方案，因此，能够期待作为分析生物分子的生物学意义的工具来应用于医学、兽医学、 环境工程学、食品工程学及农业等广泛的领域。
[0036] 并且，根据本发明的外部标记物、生物芯片及利用它们的生物分子分析方法，能够 利用高通量筛选技术的非常简单且低廉并有效的方法来生产包含微生物、细胞及蛋白质的 生物试样所包含的生物分子的实验方案，因此，能够期待作为分析生物分子的生物学意义 的工具来应用于医学、兽医学、环境工程学、食品工程学及农业等广泛的领域。
[0037] 并且，根据本发明的外部标记物、生物芯片及利用它们的生物分子分析方法，能够 在分析生物分子的生物学意义的过程中，不仅掌握未知的生物分子的生物学作用，决定并 查明其结构，而且能够筛选特殊性地与生物分子相结合的特定单链核酸，并提供能够作为 利用所筛选的靶单链核酸来掌握更加精巧的生物分子的作用的工具的环境。
[0038] 并且，根据利用本发明的外部标记物及生物芯片的生物分子分析方法，通过分析 在医学方面与疾病相关的生物分子的实验方案，能够以非常低廉且简便的方法有效地查明 能够诊断疾病的生物分子、能够分析治疗性的生物分子、对疾病的发病及进行起到重要作 用的生物分子、与疾病的感受性相关的生物分子及新药开发的祀分子等。
【附图说明】
[0039] 图1为示出基于从由上述两种或两种以上生物分子组成的生物试样中的生物分子 及基准物质决定生物分子结合单链核酸及质量控制单链核酸的单链核酸的碱基序列，将上 述制备的核酸芯片使用于分析单链核酸决定，利用通过分析单链核酸及质量控制单链核酸 来制备的核酸芯片，分析生物试样中的生物分子的生物学意义的一系列过程的图。
[0040] 图2为示出利用上述生物分子结合单链核酸和质量控制单链核酸来制备核酸芯 片，并决定上述分析单链核酸的一系列过程的图。
[0041] 图3为示出利用上述分析单链核酸及上述质量控制单链核酸来制备在生物试样中 分析生物分子的生物学意义的核酸芯片，从而生成在生物试样中的生物分子和上述分析单 链核酸的结合实验方案的一系列过程的图。
[0042]图4为示出在通过使用由分析单链核酸及质量控制单链核酸来制备的核酸芯片， 来分析包含于生物试样中的生物分子的生物学意义的过程中，利用基准物质I进行质量控 制的一系列过程的图。
[0043]图5为示出在通过使用由分析单链核酸及质量控制单链核酸来制备的核酸芯片， 来分析包含于生物试样中的生物分子的生物学意义的过程中，利用基准物质II进行质量控 制的一系列过程的图。
[0044] 图6为示出与相应于基准物质的质量控制单链核酸相应的点的图。
[0045] 图7为示出通过利用由本发明的核酸芯片生成的人类血清蛋白质实验方案的数据 库及人工神经网络算法的程序，来诊断疾病的过程的图。
[0046] 图8为示出通过利用本发明的基准物质及核酸芯片来生成的人类血清蛋白质实验 方案的数据库及人工神经网络算法的程序，来诊断心血管疾病的结果的图。
[0047] 图9为示出通过利用本发明的基准物质及核酸芯片来生成的人类血清蛋白质实验 方案的数据库及人工神经网络算法的程序，来诊断肝癌的结果的图。
[0048] 图10为示出通过利用本发明的基准物质及核酸芯片来生成的人类血清蛋白质实 验方案的数据库及人工神经网络算法的程序，来诊断肝癌的转移性的结果的图。
[0049] 图11为示出通过利用本发明的基准物质及核酸芯片来生成的人类血清蛋白质实 验方案的数据库中，决定特殊性地存在于心肌梗塞患者的血清的蛋白质的氨基酸序列的过 程的顺序的图。
[0050] 图12为在利用本发明的基准物质及核酸芯片来生成的人类血清蛋白质实验方案 的数据库中，决定特殊性地存在于心肌梗塞患者的血清的蛋白质的氨基酸序列的图。
[0051] 图13为示出单链核酸与小细胞肺癌细胞株相结合的结果的图，上述单链核酸通过 生产及分析来确保利用本发明的核算芯片来生成的小细胞肺癌细胞株的表面生物分子。
[0052] 图14为示出生物分子结合单链核酸的特殊性的图，上述生物分子结合单链核酸通 过生产及分析利用本发明的核酸芯片的大肠菌KCTC12006及沙门氏菌（Salmonella typhimurium ATCC13311)的表面生物分子实验方案来确保。
[0053] 图15为示出通过利用以特殊性的方式与利用本发明的核酸芯片来选定的大肠菌 相结合的生物分子结合单链核酸和纳米金粒子，来在呗大肠菌污染的食物中测定污染程度 的结果的图。
[0054] 图16为示出通过利用本发明的外部标记物及生物芯片，来生成生物学意义的过程 的简图。
[0055] 图17为示出决定与本发明的生物芯片的制备方法相关的生物分子结合单链核酸 的过程的简图。
【具体实施方式】
[0056] 本发明提供用于生成配体和生物分子的结合信息的外部标记物及生物芯片的制 备方法及利用它们的生物分子分析方法，本发明的外部标记物及生物芯片能够用于分析包 含于生物试样的生物分子的生物学意义。
[0057] 使用于本发明的术语的定义如下。即外部标记物作为不包含于所要分析的生物试 样中的物质的外源分子，能够使用于生物芯片的质量控制及定量分析。
[0058]捕获探针为具有与生物分子及外部标记物相结合的配体信息，并固定于生物芯片 的分子。
[0059]靶探针作为与捕获探针相结合的分子，能够组成为分析靶探针和比较靶探针的混 合形态或由分析靶探针组成。分析靶探针可以为与在分析生物试样的生物分子相结合的配 体来源的分析靶探针，比较靶探针可以为与在比较生物试样的生物分子相结合的配体来源 或人为的来源或在与生物分子及外部标记物相结合的配体中人为地制备的比较靶探针。优 选地，靶探针由分析靶探针和比较靶探针组成。
[0060] 标记物靶探针与标记物分子相应的捕获探针相结合，并作为来源于与外部标记物 相结合的配体的分子，根据使用目的，能够分为分析标记物靶探针和比较标记物靶探针。
[0061] 结合信息意味着由点组成的实验方案或各个点的荧光程度，上述点与组成生物芯 片的捕获探针相应。
[0062] 本发明的外部标记物及生物芯片的制备方法包括:第一步骤，决定不包含于所要 分析的生物试样的生物分子，并利用所决定的外源生物分子来制备外部标记物;第二步骤， 决定与生物分子及外部标记物相结合的配体;第三步骤，决定用于分析生物学意义的配体； 以及第四步骤，通过对使用所决定的上述配体信息来组成的捕获探针进行合成，将上述捕 获探针固定于基板。
[0063] 本发明的外部标记物的制备方法如下。在通过生物芯片来检查生物试样的情况 下，对转录组或蛋白质组等的检查为代表性的例。在分析转录组的情况下，作为内部标记物 的甘油酸 _3_磷酸脱氢酶(GAPDH，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)或肌动蛋 白信使核糖核酸(Actin mRNA)等使用于质量控制，但没有以突出的定量分析为目的的内部 标记物。并且，在分析蛋白质组的情况下，没有有用的内部标记物。因此，在分析蛋白质组的 情况下，对质量控制及定量分析有很多困难。因此，本发明要提出当通过使用外部标记物来 分析生物试样时，能够有用地使用的质量控制及定量分析方法。
[0064] 在通过不包含于所要分析的生物试样的物质（或分子)来分析人类来源生物试样 的情况下，外部标记物能够使用例如植物特殊生物分子作为不包含于人类来源生物试样的 生物分子。目前已结束了作为人类基因组项目及作为植物之一的拟南芥（Arabidopsis thaliana)基因组项目，并报告植物特异蛋白质。在本发明中分析人类来源生物试样的情况 下，能够使用植物特异蛋白质作为外部标记物。
[0065] 并且，本发明的与生物分子相结合的配体如下。
[0066] 与生物分子及外部标记物相结合的配体具有抗体、肽、单链核酸及适配体等。
[0067] 当使用适配体(与生物分子以三级结构相结合的单链核酸)作为与包含于生物试 样的生物分子相结合的配体的情况下，决定生物分子结合单链核酸的方法使包含生物分子 的生物试样与具有随机碱基序列的随机单链核酸发生反应，来决定与上述生物分子相结合 的生物分子结合单链核酸的反转指数式富集的配体系统进化技术(REVERSE-SELEX)(参照 韩国特许登录第10-0923048号），与外部标记物相结合的配体能够通过指数式富集的配体 系统进化(SELEX)来决定。在本发明中，适配体呗称为分析单链核酸或生物分子结合单链核 酸等。
[0068] 并且，用于分析本发明的生物学意义的生物芯片的制备方法能够包括以下步骤来 制备，即，通过使用被决定的生物分子结合单链核酸、外部标记物结合单链核酸的碱基序列 及选自它们中的互补的碱基序列中的至少一种碱基序列来合成的捕获探针固定于基板。
[0069] 本发明的利用生物芯片决定具有生物学意义的配体的方法包括:准备生物芯片的 步骤;使生物分子结合单链核酸与生物试样中的生物分子发生反应，来组成生物分子-单链 核酸复合物并分离上述生物分子-单链核酸复合物的步骤;从所分离的上述生物分子-单链 核酸复合物中分离、扩增及标记单链核酸，来制备分析靶探针的步骤;使标记的分析靶探针 和比较靶探针的混合靶探针与生物芯片的捕获探针发生反应，通过上述标记来获得结合信 息的步骤；以及通过比较所获得的实验方案和已确保的结合信息数据来分析上述生物分子 的生物学意义的步骤。
[0070] 将利用本发明的外部标记物及生物芯片来生成生物学意义的过程的示意图示出 于图16中。
[0071]若说明利用本发明的外部标记物、生物芯片及利用它们的生物分子分析方法的基 本原理，则将包含与生物分子及外部标记物相结合的单链核酸的碱基序列信息的捕获探针 固定于生物芯片，使得作为实验对象的生物分子和与此相结合的单链核酸发生反应，来组 成生物分子-单链核酸复合物之后，使得从上述复合物中制备的分析靶探针和与比较靶探 针相混合的靶探针发生反应，来获得生物芯片的捕获探针的结合实验方案，并分析其特性， 从而最终分析与生物分子相结合的单链核酸的结合实验方案特性。因此，若作为生物芯片 的捕获探针捕获互补地结合具有生物分子结合单链核酸的信息的靶探针，则当分析生物分 子时，通过扩增从生物分子-单链核酸复合物分离的单链核酸的过程来制备的分析靶探针 也以内涵有与复合物的单链核酸的实验方案信息相同或类似的信息的状态生成，因此作为 本发明的生物芯片的捕获探针分析靶探针也能够达到预期目的。
[0072] 并且，获得能够了解上述生物分子的信息的结合信息的步骤能够通过将组成上述 外部标记物的外源分子分别以不同的量添加于生物试样中，来准备分析靶探针，或者，将具 有与组成上述外部标记物的外部分子相结合的配体信息的分析标记物靶探针分别以不同 的量与上述分析靶探针相混合并准备上述靶探针，来生成结合信息。比较靶探针能够在池 中制备并使用，上述池由与生物分子相结合的配体和与外部标记物相结合的配体组成。
[0073] 若利用本发明的生物芯片来分析生物分子，则积累相关结合信息数据，由此，对生 物分子的生物学意义的分析做贡献的特异的单链核酸自然显现，从而能够发掘对分析生物 分子具有意义的单链核酸。
[0074] 能够适用本发明的生物芯片的上述生物试样包含细菌、真菌类、病毒、细胞株及组 织等，作为能够通过本发明的生物芯片来分析其生物学意义的生物分子为选自由蛋白质、 碳水化合物、脂质、多糖体、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、酶及核酸(nuc 1 eotide)组成的 组中的一种以上的生物分子。
[0075] 本发明的生物芯片制备方法的第一步骤为使包含生物分子的生物试样与具有随 机碱基序列的单链核酸（以下称为'随机单链核酸'）发生反应，从而决定与未知的生物分子 相结合的靶单链核酸的步骤。
[0076] 优选地，选定与包含于上述生物试样的生物分子相结合的单链核酸的步骤包括： 使生物试样的生物分子与单链核酸随机发生反应，来制备生物分子-单链核酸复合物，在清 洗上述复合物之后，通过基于生物分子与单链核酸间的结合力的大小，来选择规定结合力 以上的生物分子-单链核酸复合物，从所选择的上述复合物中分离并扩增单链核酸的步骤； 以及将扩增的单链核酸插入于克隆用载体来确保单克隆，并决定其碱基序列，从而决定生 物分子结合单链核酸的步骤。
[0077] 上述生物分子_单链核酸复合物的选择及扩增能够反复执行多次，但包含未知的 生物分子的生物试样由许多生物分子组成，且它们的定量差异非常多样，因此优选地，与反 复执行与生物分子相结合的单链核酸的选择和扩增的环形方法相比，应利用执行一次选择 和扩增并强化清洗过程的线性方法制备上述生物分子结合单链核酸。
[0078] 具有上述随机碱基序列的随机单链核酸能够在利用具有如下的随机碱基序列的 单链脱氧核糖核酸寡核苷酸来制备双链的脱氧核糖核酸之后，通过体外转录（in vitro transcription)来制备核糖核酸随机单链核酸。
[0079] 5，-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N40 CATAACCCAGAGGTCGA TGGATCCCCCC-3 '
[0080] 其中，带下划线的碱基排列为核酸库为固定部分，N40意味着A、G、T及C等碱基以相 同的浓度存在于各个位置。
[0081] 利用于聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction)的FW引物（5'_ GGGGGAATTCTAATACGA CTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3 '）能够与上述碱基排列的带 划下划线的碱基的5'末端进行碱基结合，并包括用于噬菌体T7的核糖核酸聚合酶的启动子 碱基序列。
[0082] 聚合酶链式反应的RE引物（5 ' -GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3 '）能够与上述 碱基排列的带划下划线的碱基的3'末端进行碱基结合。
[0083]优选地，在本发明的生物芯片制备方法中，生物分子结合单链核酸为包含2'-F_置 换嘧啶的核糖核酸单链核酸，通过体外转录来合成，并通过纯化来准备。
[0084]所合成的随机单链核酸能够以例如以1015碱基序列/L的浓度处理于生物试样，并 能与生物分子发生30分钟的反应。
[0085] 上述祀单链核酸能够将通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR，Reverse Transcription-PCR)来获得的产物插入于克隆用载体，来确保大肠菌克隆并决定其碱基序 列。
[0086]此时，理想的反应温度低于指数富集配基系统进化执行温度，优选地，在20°C至37 °C的温度下执行反应。
[0087]通常，防止过量处理蛋白质及单链核酸来与生物分子相结合的单链核酸的非特异 性的结合，优选地，可使用酵母转运核糖核酸(yeast tRNA)、鲑鱼精脱氧核糖核酸（salmon sperm DNA)或人类胎盘脱氧核糖核酸(human placental DNA)。
[0088] 在用于选定本发明的具有生物学意义的生物分子结合单链核酸的生物芯片的制 备方法中，第二步骤使用在第一步骤中决定的单链核酸及上述外部标记物结合单链核酸的 碱基序列和选自它们的互补的碱基序列中的至少一种碱基序列，来合成捕获探针，通过将 所合成的捕获探针固定于基板上，来制备本发明的生物芯片。
[0089] 由于捕获探针为对杂交程度起非常大的影响的核心要素，因此其碱基序列结构的 决定非常重要。固定于本发明的生物芯片的各个捕获探针由特殊的碱基组成，捕捉单链核 酸和革E单链核酸的结合物应维持适当的解链温度(Tm)值。由此，结合物的杂交程度能够借 助标记有荧光的靶探针来维持未被污染的自身的信号值。
[0090] 因此，捕获探针的碱基序列能够基于在上述第一步骤中从核酸库的随机单链核酸 筛选的生物分子结合单链核酸及外部标记物结合单链核酸的碱基序列来决定。具体地，捕 获探针使用与核酸库的随机部分相关的40个核苷酸或其一部分，在使用一部分的情况下， 能够追加人为的碱基序列。优选地，捕获探针为具有l〇bp至20bp的碱基序列的寡核苷酸的 单链核酸。
[0091] 在利用生物芯片来分析生物试样的情况下，使用双重靶探针或单一靶探针作为靶 探针。通常，在分析转录组的情况下，将疾病部分来源生物试样作为分析生物试样，将正常 部分作为比较生物试样，在前者制备分析靶探针，在后者制备比较靶探针，并在混合它们之 后使用为靶探针。但在没有适当的比较生物试样的情况下，使用从分析生物试样来源的单 一靶探针作为靶探针。
[0092]并且，本发明的比较靶探针可以为通过与捕获探针互补的碱基序列核酸与生物分 子相结合的配体和从与外部标记物相结合的配体池合成的单链核酸。优选地，比较靶探针 可以为具有80bp至140bp的碱基序列的寡核苷酸的单链核酸。
[0093] 标记物靶探针来源于与组成外部标记物的外源分子相结合的配体，根据用途，可 区分为分析标记物靶探针和比较标记物靶探针。在将外部标记物混合于生物试样来准备分 析标记物靶探针的情况下，在制备分析靶探针的过程中一同制备，或者在不将外部标记物 与生物试样相混合而使用的情况下，可通过制备能够与外部标记物的捕获探针相结合的分 析标记物靶探针，来混合于上述分析靶探针并使用。比较分析物靶探针可以在与生物分子 相结合的配体及与外部标记物相结合的配体池制备并使用。
[0094] 优选地，本发明的靶探针可通过混合包含标记物靶探针的分析靶探针及包含标记 物靶探针的比较靶探针来使用。
[0095] 并且，在本发明的生物芯片制备方法中，可使用由玻璃、硅等无机物或丙烯酸类或 聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET，poly ethyl ene terephta late)、聚碳酸酯（poly carbonate)、 聚苯乙稀(polystyrene)、聚丙稀(polypropylene)等高分子物质制备的基板，优选地，基板 为由玻璃制备的载玻片。此时，可使用被胺或醛基等涂敷的的基板。例如，使用作为涂敷有 氨基丙基硅烷(GAPS，Gamma Amino Propyl Si lane)的载玻片的UltraGAPSTM包被玻片 (Coated Slide)(康宁公司（Corning))来使上述捕获探针以规定规则排列并固定，由此制 备生物芯片。
[0096]本发明的生物芯片的制备可使用微陈列系统(Microarrayer system)，将各个捕 获探针溶解于缓冲液来调整浓度，此时，陈列内的湿度保持在70 %至80 %来执行点样。点样 的载玻片放置于加湿腔室(humidified chamber)之后，在紫外线链结箱(UV crosslinker) 执行烘烤(baking)过程。
[0097]如上所述，本发明的生物芯片通过在相关技术领域中众所周知的方法，在将捕获 探针固定于载玻片之后，使载玻片直接离心分离并干燥之后，以阻隔光的状态保管，直到使 用之前为止。
[0098] 可通过以往公知的多种方法（M ? schena ; DNA mi croarray ; a prac t i ca 1 approach，Oxford，1999)来制备捕获探针规则排列的生物芯片。
[0099] 若本发明的生物芯片能够通过相同或类似的程度的精密度来分析未知的生物分 子的生物学意义，则减少固定于生物芯片的捕获探针的数量在生物芯片的制备费用及分析 的效率性方面更为优选。
[0100] 由于这种理由，还可以包括分析各个捕获探针对生物分子的生物学意义分析的贡 献度，在能够分析生物分子的生物学意义的范围内，基于分析的贡献度来筛选捕获探针，从 而减少固定于本发明的生物芯片的捕获探针的数量的步骤。
[0101] 进而，本发明提供用于生成生物分子和分析单链核酸的结合信息的基准物质、核 酸芯片，它们的制备方法及利用它们的生物分子分析方法和装置，上述生物分子管理内部 程度并在由两种或两种以上的生物分子组成的生物试样中，本发明的基准物质及核酸芯片 为了分析包含于生物试样的生物分子的生物学意义而使用。
[0102] 上述核酸芯片用于同时分析一种或一种以上的物质，是指固定有由核酸制备的探 针的载体。优选地，载体可以为固体玻璃或尼龙基板。核酸芯片以制备于固体玻璃或尼龙基 板上的二维探针基质的形态制备。优选地，能够在单一核酸芯片执行尽可能多的特征的分 析，这是因为需要在单一基板中增加相当多的探针的密度及探针的数量。通常，具有小于 500nm的探针固定位置的（即，密度大于每一平方厘米400探针)微陈列为高密度微陈列，其 余的为"低密度"微陈列。通常，核酸芯片使用于将具有数百个至数十万个的非常多的碱基 序列的核酸排列于小的空间，并通过被固定的已知的核酸与未知的核酸试样之间的杂交 (hybridization)来得知对未知的试样内的核酸信息。核酸微陈列具有能够通过代替现有 的印记杂交（Southern blot)、诺瑟杂交(Norther blot)、突然变异检索等，能够在最快的 时间内同时检索最少数百个以上的碱基序列部分的优点。
[0103]通常，基准物质作为用于实施定性定量分析、各种试验、检查时的比较的内部质量 控制物质，本发明通过使用分析单链核酸来分析所要分析的由两种或两种以上的生物分子 组成的生物试样中的生物分子，而这种定性及定量分析意味着用于进行内部质量控制的物 质。理想地，上述基准物质为始终以规定量存在于所要分析的试样中的物质，但在不是的情 况下，能够使用作为不包含于试样的物质的外源物质，优选地，当所要分析的试样为生物试 样的情况下，能够由不包含于上述生物试样的外源生物分子组成。质量控制意味着不使如 管理用试样之类的外部基准，而对能够通过每次的测定来获得的一组检查结果进行分析， 来管理测定值的精密度的内部质量控制。
[0104]在本发明中，将以单链核酸的碱基序列来预测稳定的二维结构的单链核酸为结合 单链核酸，实施单链核酸的碱基序列通过使由两种或两种以上的生物分子组成的生物试样 中的生物分子与作为由随机碱基序列组成的随机单链核酸的核酸库发生反应来确保并决 定，并将选定为为了通过基于上述结合单链核酸来制备的核酸芯片来分析生物学意义而确 保的实验方案的单链核酸命名为分析单链核酸。并且，将通过与上述基准物质相结合的单 链核酸，以上述质量控制为目的来决定的单链核酸称为质量控制单链核酸。这种单链核酸 都是适配体的一种。
[0105]本发明中，术语适配体(aptamer)意味着从低分子化合物至蛋白质为止，具有能够 以高的亲和性和特殊性与多种受体相结合的特性的小的（20~60核苷酸)单链核酸(DNA或 RNA)碎片。适配体的开发通过被称为指数富集配基系统进化(SELEX)的方法在试管中实现。 指数富集配基系统进化作为'Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment ' 的缩写，于 1990年第一次被开发（Tuerk，C? and Gold，L?，1990，Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase.Science 249(4968)?505-510；Ellington?A.D.and Szostak?J.ff.? 1990?In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 346(6287)，818-822)，通过利用此方法获得在特定分子具有高的结合力的核酸适配体。适 配体在对受体具有纳米-皮米水准的高的结合力和选择性的方面，被视为具有与抗体类似 的特性的核酸分子。适配体通过指数富集配基系统进化在试管筛选。指数富集配基系统进 化的中心原理与以下的进化的概念相似，即，在多数以随机方式存在的个体中，只有具有特 定形质的个体生存，这样生存的个体在其组体内所占的比重逐渐变高，从而最终与支配组 体。但是在指数富集配基系统进化中的个体为单链核酸，选择压力成为对特定受体的结合 力。因此，首先制备具有多数的随机(random)序列的核酸库，需要能够挑出对被认为存在于 实施核酸库内的的特定受体具有高的结合力的个体的分划过程，并以通过扩增挑出的适配 体来增加在核酸池内的比率，接着需进行下一回合的选择的方式需要进行扩增步骤。对于 适配体的指数富集配基系统进化的具体方法及试剂/材料等已被公知(Marshal 1，K. A. and Ellington,A.D.,2000,In vitro selection of RNA aptamers.Methods Enzymol 318， 193-214；Fitzwater,T.and Polisky，B.，1996，A SELEX primer.Methods Enzymol267, 275-301)。并且，本发明人提出了通过使生物分子与核酸库发生反应，来选定以特殊方式与 各个生物分子相结合的单链核酸的方法，实施生物与分子存在于由两种或两种以上的生物 分子组成的生物试样中，实施随机单链核酸由随机碱基序列组成（韩国特许登录第10-0923048号）。
[0106] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，在通过核酸分析方法对与生物试样 中的生物分子相结合的分析单链核酸进行分析的同时，通过核算分析方法对与质量控制用 的外部基准物质相结合的单链核酸进行分析，从而实现内部质量控制;其中，上述生物试样 包含从由随机碱基序列组成的随机单链核酸所构成的核酸库中选定的两种或两种以上的 生物分子。
[0107] 并且，本发明人提出了通过核酸分析方法来分析通过使上述生物试样中的生物分 子与适配体发生反应来生成的生物分子-适配体复合物中的适配体，从而分析作为受体的 生物分子的方法(韩国特许登录第10-0670799号）。分析上述生物试样中的生物分子和适配 体复合物中的适配体的核酸分析方法可以为聚合酶链式反应（PCR，polymeras chain reaction)、连接酶链式反应(LCR，ligase chain reaction)、链替代扩增反应(SDA，strand displacement amp lification)、车专录介导扩增（TMA，transcription-mediated amplification)、支链脱氧核糖核酸(bDNA，branched DNA)、侵入方法及及滚环扩增(RCA， rolling circle amplification)等。优选地，能够追加分析以上述生物分子-单链核酸复 合物中的单链核酸为模板实施聚合酶链式反应来生成的扩增产物。
[0108] 并且，本发明提供生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，上述质量控制基 准物质为不包含于上述生物试样中的生物分子。
[0109] 观察图1，可知是通过使上述生物试样中的生物分子及基准物质与由随机碱基序 列组成的随机单链核酸发生反应，来决定上述结合单链核酸及上述质量控制单链核酸之 后，基于上述结合单链核酸的碱基序列，将上述制备的核酸芯片使用于分析单链核酸的决 定，并且，执行通过由上述分析单链核酸及质量控制单链核酸的碱基序列制备的上述核酸 芯片来分析生物试样中的生物分子的生物学意义的步骤的这种一系列过程。
[0110] 通过上述核酸芯片来检查的生物试样的代表性的例为转录组或蛋白质组等。在分 析转录组的情况下，作为基准物质而在所有的组织中几乎以规定的量表达的甘油醛-3-磷 酸脱氢酶(GAPDH，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)或肌动蛋白信使核糖 核酸(0-actin mRNA)等用于进行内部质量控制，但由于没有以明确的定量分析为目的来使 用的基准物质，因而依赖于外部质量控制。
[0111] 并且，在由两种或两种以上的蛋白质组成的生物试样中选定与蛋白质相结合的配 体的方法具有由本发明人提出的颠倒-指数富集配基系统进化（韩国特许登录第10-0923048号）。还有基于细胞的指数富集配基系统进化（Cell-selex) (Homann，M. and Goringer，H.U.，1999，Nucleic Acids Res 27(9)，2006-2014)。本发明的目的在于，提供质 量控制目的基准物质，上述质量控制目的基准物质用于通过上述颠倒-指数富集配基系统 进化，来有效地选定与具有两种或两种以上的生物分子的生物试样中的生物分子相结合的 配体。
[0112] 并且，当前的实情为，在分析蛋白质组的情况下，没有能够用于定量及定性分析的 有用的基准物质，因而在分析蛋白质组的质量控制及定量分析方面存在很多困难。因此，本 发明提出用于通过使用基准物质来分析上述试样的有用的内部质量控制及定量分析方法。
[0113] 优选地，在本发明的基准物质以与先前记述的外部标记物类似的方式分析人类来 源生物试样的情况下，能够使用植物特异生物分子作为不包含于人类来源生物试样中的生 物分子。目前，人类基因组项目及作为植物的一种的拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因 组项目已结束，因此，报告出植物特异蛋白质。在本发明中，能够使用植物特异蛋白质作为 用于分析人类来源生物试样的基准物质。
[0114] 与包含于上述生物试样中的生物分子及基准物质相结合的物质具有抗体、肽及单 链核酸等，优选地，可以为单链核酸。
[0115] 本发明提供选定生物分子分析单链核酸的方法，包括:决定不包含于生物试样中 的生物分子，从决定的外源生物分子制备质量控制单链核酸的步骤，从包含于上述生物试 样中的生物分子制备上述结合单链核酸的步骤，以及使用上述质量控制单链核酸及上述结 合单链核酸的碱基序列，来制备固定有合成的捕获探针的载体的步骤;使用用于选定分析 生物分子的生物学意义的分析单链核酸、上述生物试样、上述基准物质、上述结合单链核 酸、上述质量控制单链核酸及上述核酸芯片，从而生成生物分子和结合单链核酸的结合实 验方案。
[0116]观察图2，可知为选定在上述生物试样中的生物分子的结合单链核酸和质量控制 单链核酸，来制备核酸芯片，并决定分析上述生物试样中的生物分子的生物学意义的上述 分析单链核酸的一系列过程。
[0117]本发明的决定在与上述基准物质相结合的单链核酸中决定的质量控制单链核酸 的方法能够由标准指数式富集的配体系统进化(Tuerk C.and Gold L.，1990，Science， 249;505-510)等组成，上述标准指数式富集的配体系统进化使基准物质与具有随机碱基序 列的随机单链核酸发生反应，使基准物质与单链核酸相分离，并反复执行这种一系列的选 择和扩增，来选定与基准物质相结合的单链核酸。
[0118] 并且，本发明的选定与由两种或两种以上的生物分子组成的生物试样中的生物分 子相结合的单链核酸的方法，能够使用反转指数式富集的配体系统进化技术(韩国特许登 录第10-0923048号），上述反转指数式富集的配体系统进化技术使包含生物分子的生物试 样与具有随机碱基序列的随机单链核酸发生反应，来决定与上述生物分子相结合的生物分 子结合单链核酸。
[0119] 本发明所提供的制备上述结合单链核酸的方法与先前选定与包含于生物试样中 的生物分子相结合的单链核酸的方法相同，能够包括以下步骤来选定生物分子分析单链核 酸:首先在通过使上述生物分子与具有上述随机碱基序列的单链核酸发生反应来获得的反 应溶液中选择生物分子-单链核酸复合物的步骤;从上述复合物分离并扩增单链核酸，来制 备单链核酸脱氧核糖核酸的步骤；以及上述单链核酸脱氧核糖核酸插入于克隆用载体，来 确保单克隆并决定上述单链核酸的碱基序列，从而制备上述结合单链核酸的步骤。
[0120] 本发明的选择上述生物分子-单链核酸复合物的方法提供生物分子分析单链核酸 选定方法，其特征在于，清洗在上述反应溶液中的上述生成的生物分子-单链核酸复合物， 基于上述生物分子与上述单链核酸间的结合力的大小，选择规定结合力以上的上述生物分 子-单链核酸复合物。
[0121] 本发明的选择上述生物分子-单链核酸复合物的方法提供生物分子分析单链核酸 选定方法，其特征在于，通过对上述反应溶液进行毛细管电泳处理，来选择上述生物分子-单链核酸复合物。
[0122] 本发明的选择上述生物分子-单链核酸复合物的方法提供生物分子分析单链核酸 选定方法，其特征在于，用上述反应溶液来对由硝酸纤维素及尼龙组成的结构体进行处理， 来选择生物分子-单链核酸复合物。
[0123] 本发明提供生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，反复执行多次上述生 物分子-单链核酸复合物的选择及扩增。
[0124] 在本发明中，上述生物分子-单链核酸复合物的选择可以通过以下方法进行:清洗 上述生成的生物分子-单链核酸复合物，基于上述生物分子与上述单链核酸间的结合力的 大小来选择规定结合力以上的上述生物分子-单链核酸复合物的方法;通过毛细管电泳上 述反应溶液，来选择上述生物分子-单链核酸复合物的方法或者用上述反应溶液来对由硝 酸纤维素及尼龙组成的结构体进行处理，来选择生物分子-单链核酸复合物的方法。
[0125] 从上述生物分子-单链核酸分离的单链核酸能够将通过反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR，Reverse Transcription-PCR)来获得的产物插入于克隆用载体，从而确保大肠菌 克隆，并决定其碱基序列。
[0126] 本发明提供生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，固定有上述捕获探针 的载体包括载玻片、生物传感器的检测表面、微珠、纳米粒子等。
[0127] 本发明提供生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，上述捕获探针由选自 上述结合单链核酸及质量控制单链核酸的碱基序列和它们的互补的碱基序列中至少一种 碱基序列组成并合成。
[0128] 本发明提供生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，生成在由上述两种或 两种以上的生物分子组成的生物分子中的生物分子和结合单链核酸的结合实验方案的方 法包括:从上述基准物质、上述生物试样、上述质量控制单链核酸及上述结合单链核酸制备 具有标记物质的分析靶探针的步骤;混合及扩增上述捕获探针相应的上述结合单链核酸及 上述质量控制单链核酸，来制备具有标记物质的比较靶探针的步骤;混合上述分析靶探针 和上述比较靶探针，来制备上述靶探针的步骤；以及使上述靶探针和上述载体上的上述捕 获探针发生杂交反应，来生成结合实验方案的步骤。
[0129] 本发明提供生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，制备上述分析靶探针 的方法包括:准备向上述生物试样添加分别以不同的量包含上述基准物质的基准物质I的 分析试样的步骤;分离使上述分析试样和由上述结合单链核酸及上述质量控制单链核酸组 成的单链核酸发生反应来所生成的生物分子-单链核酸复合物及基准物质-单链核酸复合 物的步骤;以及从上述复合物分离、扩增及标记单链核酸，来制备分析靶探针的步骤。
[0130] 本发明提供生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，制备上述分析靶探针 的方法包括:从使上述生物试样和上述结合单链核酸发生反应来所生成的生物分子-单链 核酸复合物中分离单链核酸的步骤；以及混合所分离的单链核酸和分别以不同的量组成质 量控制单链核酸的基准物质II，来以扩增及标记方式制备上述分析靶探针的步骤。
[0131] 本发明提供生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，还包括用于分析上述 生物分子的生物学意义的分析单链核酸的筛选基于上述捕获探针的贡献度，在能够分析上 述生物分子的生物学意义的范围内，筛选上述捕获探针，从而减少固定于上述载体的上述 捕获探针的个数的步骤。
[0132] 本发明提供核酸芯片，其特征在于，使用上述结合单链核酸及质量控制单链核酸 的碱基序列来合成的捕获探针固定于载体，从而生成上述分析单链核酸和上述结合单链核 酸及上述质量控制单链核酸之间的结合信息。
[0133] 在本发明的选定利用上述核酸芯片的分析单链核酸的方法中，捕获探针由选自通 过固定于载体的分子来与生物分子及基准物质相结合的单链核酸或具有它们的信息的物 质中的至少一种物质组成。
[0134] 上述生物试样中的生物分子和单链核酸的结合信息是指借助在生物分子结合单 链核酸制备的靶探针和捕获探针的互补的结合来发生的信号，优选地，由与组成载体的捕 获探针相应的点组成的实验方案，是与分别组成点的捕获探针相结合的靶探针的结合单链 核酸的标记物质所发生的信号，优选地，意味着荧光程度。上述结合信息为靶探针的分析靶 探针及比较分析探针的信号的组合，最终，在生物试样中呈现生物分子结合单链核酸的分 布状态，由此能够推论与单链核酸相结合的生物分子的分布状态。
[0135] 并且，本发明的用于在生物试样中选定分析生物分子的生物学意义的分析单链核 酸的制备核酸芯片的方法，能够使用选自决定的分析单链核酸及质量控制单链核酸的碱基 序列和上述它们的互补的碱基序列中的至少一种碱基序列，或者使用与生物分子结合单链 核酸的碱基序列以完全互补的方式结合的碱基序列所组成的捕获探针来合成的捕获探针 固定于载体。
[0136] 并且，在本发明中，能够固定有捕获探针的载体能够选自载玻片、生物传感器的检 测表面、微珠、纳米粒子等，优选地，载体为载玻片。
[0137] 根据上述载体的种类，能够选择分析与捕获探针相结合的扩增产物的信号的方 法。
[0138] 像这样，本发明的核酸芯片通过在相关技术领域众所周知的方法，在将捕获探针 固定于载玻片之后，将载玻片直接离心分离并干燥，之后以阻隔光状态保管置，直到使用之 前为止。
[0139] 捕获探针能够通过以往公知的多种方法（M . schena ; DNA mi croarray ; a prac t i ca 1 approach，Oxf ord，1999)来以规则方式制备核酸芯片。
[0140] 在通过核酸芯片来分析生物试样的情况下，通常，靶探针分析转录组的情况将疾 病部分来源生物试样作为分析生物试样，将正常部分作为比较生物试样，在前者制备分析 靶探针，在后者制备比较靶探针，并在混合它们之后使用为靶探针。但在没有适当的比较生 物试样的情况下，适用从分析生物试样来源的单一靶探针作为靶探针。
[0141] 优选地，靶探针可以为具有80bp至140bp的碱基序列的寡核苷酸的单链核酸。
[0142] 并且，在本发明中，分析靶探针能够通过以下两种方法来制备。分别以不同的量组 成基准物质的基准物质I混合于生物试样中，从而准备分析靶探针的方法;在从上述生物分 子-单链核酸分离的单链核酸混合由质量控制单链核酸分别以不同的量组成的基准物质 II，来准备分析靶探针的方法。
[0143] 比较靶探针可以为通过与捕获探针互补的碱基序列的核酸来从单链核酸池中合 成的单链核酸，上述单链核酸由生物分子结合单链核酸和质量控制单链核酸组成。
[0144] 基于如上所述的理由，分析对生物分子的生物学意义分析的各个捕获探针的贡献 度，在能够分析生物分子的生物学意义的范围内，以分析的贡献度为基础，筛选捕获探针， 由此能够发掘对分析生物分子具有意义的单链核酸。
[0145] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，通过使用上述分析单链核酸，来使用 用于分析在上述生物试样中的生物分子的上述质量控制基准物质，通过核酸分析方法分析 上述质量控制单链核酸来进行内部质量控制。
[0146] 并且，本发明提供生物分子分析方法，通过使用上述分析单链核酸来将上述生物 试样中的生物分子分析作为核酸分析方法。
[0147] 观察图3,可知是利用上述分析单链核酸及上述质量控制单链核酸，在上述生物试 样中制备用于分析生物分子的生物学意义的核酸芯片，从而生成在生物试样中的生物分子 和上述分析单链核酸的结合实验方案的一系列的过程。
[0148] 本发明人的在通过使上述生物试样中的生物分子与适配体发生反应来生成的生 物分子-适配体复合物中，以核酸分析方法分析适配体，从而分析作为受体的生物分子的方 法记载在韩国特许登录第10-0670799-0000。对上述生物试样中的生物分子和在适配体复 合物中的适配体进行分析的核酸分析方法可以为聚合酶链式反应(PCR，polymeras chain reaction)、连接酶链式反应(LCR，ligase chain reaction)、链替代扩增反应(SDA，strand displacement amp lification)、车专录介导扩增（TMA，transcription-mediated amplification)、支链脱氧核糖核酸(bDNA，branched DNA)、侵入物方法及滚环扩增(RCA， rolling circle amplification)等。优选地，能够追加分析以上述生物分子-单链核酸复 合物中的单链核酸为模板实施聚合酶链式反应来生成的扩增产物。
[0149] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，上述质量控制基准物质为不包含于 上述生物试样中的生物分子。
[0150] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，包括:将使用上述分析单链核酸及上 述质量控制单链核酸的碱基序列来合成的上述捕获探针固定于载体的步骤;从上述基准物 质、上述生物试样、上述质量控制单链核酸及上述结合单链核酸制备具有标记物质的分析 靶探针的步骤;使上述靶探针和上述载体上的上述捕获探针发生杂交反应，来获得结合实 验方案的步骤；以及比较所获得的上述实验方案和已确保的结合信息数据，来分析上述生 物分子的生物学意义的步骤。
[0151 ]并且，本发明提供生物分子分析方法，准备上述靶探针的方法包括:从上述基准物 质、上述生物试样、上述质量控制单链核酸及上述结合单链核酸制备具有标记物质的分析 靶探针的步骤;混合及扩增与上述捕获探针相应的上述分析单链核酸及上述质量控制单链 核酸来制备具有标记物质的比较靶探针的步骤；以及制备由上述分析靶探针及上述比较靶 探针组成的靶探针的步骤。
[0152] 观察图4及图5,可知是在利用上述分析单链核酸及上述质量控制单链核酸来制备 核酸芯片，来分析包含于上述生物试样的生物分子的生物学意义的过程中，以质量控制为 目的，利用基准物质及质量控制单链核酸来分析的一系列的过程。
[0153] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，固定有上述捕获探针的载体包含载 玻片、生物传感器的检测表面、微珠、纳米粒子等。
[0154] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，上述捕获探针由与上述分析单链核 酸及上述质量控制单链核酸的碱基序列以完全互补的方式结合的碱基序列组成。
[0155] 优选地，上述捕获探针能够由与上述分析单链核酸互补结合的碱基序列组成，上 述分析单链核酸选自组成上述生物试样的上述结合单链核酸中，用于分析在生物试样中的 生物分子的生物意义而使用的适配体。因此，上述捕获探针能够与在将在上述复合物中的 上述分析单链核酸作为模板进行聚合酶链式反应来获得的扩增产物中的上述特定分析单 链核酸的碱基序列相互补结合，因此，最终能够分析在上述复合物中的分析单链核酸，利用 其结果来定量分析作为受体的蛋白质。
[0156] 根据上述载体的种类，能够选择分析与捕获探针相结合的扩增产物的信号的方 法。
[0157] 在本发明的进行内部质量控制并分析利用上述核酸芯片的生物分子的生物学意 义的方法中，捕获探针由选自作为固定于载体的分子而与生物分子及基准物质相结合的分 析单链核酸或具有它们的信息的物质中的至少一种物质组成。
[0158] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，使用用于标记及扩增从上述生物分 子-单链核酸复合物和上述基准物质-单链核酸复合物中分离的分析单链核酸的具有标记 物质的引物。
[0159] 并且，在本发明中，能够使用具有用于标记及扩增从生物分子-单链核酸复合物和 基准物质-单链核酸复合物分离的单链核酸的标记物质的引物和具有指示特定单链核酸的 标记的引物。
[0160] "标记"是指在反应中用来确认多核苷酸和/或追踪多核苷酸的来源的独特的核苷 酸序列。标记序列可以处于引物的5末端或3末端。捕获探针的碱基序列可以在大小及组成 成分上发生广泛的变化。以下的参考资料提出用于选定适合于特定具体例的一系列捕获探 针碱基序列的指南（美国专利第5,635,400号;Brenner et al，2000，PNAS. ,97:1665-1670; Shoemaker et al，1996，Nature Genetics，14:450-456;欧洲专利公开0799897A1;美国专 利第5，981，179号）。并且，在与此相似的上述特定具体例中，捕获探针喊基序列能够保留4 个至36个核苷酸，或者6个至30个核苷酸，或者8个至20个核苷酸范围的长度。
[0161] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，由与指示上述分析单链核酸及上述 质量控制单链核酸的标记的碱基序列以完全互补的方式结合的碱基序列组成上述捕获探 针。
[0162] 上述捕获探针能够使用与标记互补的碱基序列来制备，这种捕获探针能够与标记 碱基序列以完全互补的方式结合，来分析聚合酶链式反应产物，上述标记碱基序列存在于 以上述复合物中的分析单链核酸作为模板进行聚合酶链式反应来生成，可通过分析上述捕 获探针和聚合酶链式反应的产物生成的点的信号，来分析在上述复合物中的分析单链核 酸。
[0163] 上述比较靶探针可以为通过与上述捕获探针相互补的碱基序列的核酸从单链核 酸池中合成的单链核酸，上述单链核酸由生物分子结合单链核酸和质量控制单链核酸组 成。
[0164] 在通过核酸芯片分析转录组的情况下，靶探针将源自于疾病部分的生物试样作为 实验组的分析生物试样，将源自于正常部分的生物试样作为对照组的比较生物试样，在前 者制备分析靶探针，在后者制备比较靶探针，并在混合它们之后使用为靶探针。但在没有适 当的比较生物试样的情况下，能够使用从分析生物试样来源的单一靶探针作为靶探针。
[0165] 并且，在本发明中，分析靶探针能够通过以下两种方法制备:将由基准物质分别以 不同的量组成的基准物质I混合于生物试样中，从而准备分析靶探针的方法;在从上述生物 分子-单链核酸分离的单链核酸混合由质量控制单链核酸分别以不同的量组成的基准物质 II，来准备分析靶探针的方法。
[0166] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，制备上述分析靶探针的方法包括：向 上述生物试样添加分别以不同的量包含上述基准物质的基准物质I，来准备分析试样的步 骤;分离使上述分析试样和由上述结合单链核酸及上述质量控制单链核酸组成的单链核酸 发生反应来所形成的生物分子-单链核酸复合物及基准物质-单链核酸复合物的步骤；以及 分离、扩增及标记上述复合物中的分析单链核酸，来准备分析靶探针的步骤。
[0167] 本发明提供生物分子分析方法，其特征在于，准备上述分析靶探针的方法包括:分 离使上述生物试样和上述分析单链核酸发生反应来生成的生物分子-单链核酸复合物中分 离单链核酸的步骤；以及将分别以不同的量含有质量控制单链核酸的基准物质II混合、扩 增及标记于从分离的上述生物分子-单链核酸复合物中分离的分析单链核酸，来制备所标 记的上述分析靶探针的步骤。
[0168] 本发明提供生物分子分析方法及分析装置，其特征在于，利用将作为实验组的使 上述生物试样中的生物分子和上述分析单链核酸发生反应来制备的分析靶探针和作为对 照组的使上述生物试样中的生物分子和上述分析单链核酸发生反应来制备的比较靶探针 相混合而制备的靶探针来分析上述核酸芯片。
[0169] 将来源于与实验组生物试样中的生物分子相结合的分析单链核酸的靶探针称为 分析靶探针，并将来源于与对照组生物试样中的生物分子相结合的分析单链核酸或人为地 在与生物分子及基准物质相结合的分析单链核酸池中制备的靶探针称为比较靶探针。优选 地，靶探针为分析靶探针和比较靶探针。
[0170] 上述靶探针作为与捕获探针相结合的分子，能够混合分析靶探针和比较靶探针或 仅由分析靶探针组成。
[0171] 本发明提供生物分子的分析方法及分析装置，其特征在于，上述标记物质使用选 自由生物素(Biotin)、Cy2、绿色荧光蛋白、Y0-PR0-UY0Y0-1、钙黄绿素、异硫氰酸荧光素、 FlourX、ALEXA 488、罗丹明 110、ABI 5-FAM、俄勒冈绿500、俄勒冈绿488、RiboGreen、罗丹明 绿、罗丹明123、镁绿、钙绿、!'0-?如-1、1'01'0-1^811(^、氟硼二吡咯530/550、011、氟硼二吡 咯TMR、氟硼二吡咯558/568、氟硼二吡咯564/570、Alexa 546、四甲基异硫氰酸罗丹明、镁 橙、藻红蛋白R&B、罗丹明标记的鬼笔环肽、钙橙、派洛宁Y、罗丹明B、ABI TAMRA、玫瑰红、 Cy3.5、ABI R0X、钙红、Alexa 594、德克萨斯红、尼罗红、Y0-PR0-3、Y0Y0-3、红藻蓝素、C-藻 蓝素、T0PR0-3、T0T0-3、DiD DilC(5)、氧杂羰花青、Cy5.5、Cy5及Cy3组成的组中的荧光染 料。
[0172]以使将分析单链核酸作为模板，利用具有上述标记物质的引物，并进行聚合酶链 式反应来确保的扩增产物与上述捕获探针发生反应，上述捕获探针与具有标记物质的扩增 产物的单链核酸进行互补结合来生成双链核酸，上述分析单链核酸存在于由上述分析单链 核酸和上述生物试样中的生物分子发生反应生成的复合物中。因此，若由上述捕获探针组 成的点发生基于标记物质的信号，则能够通过该信号分析分析单链核酸，并能定量分析作 为上述分析单链核酸生成的复合物内的受体的蛋白质。因此，标记物质可以在多个范围内 根据分析目的来选择，优选地，能够使用Cy 3或Cy 5。
[0173] 本发明提供核酸芯片，通过使用上述分析单链核酸及上述质量控制单链核酸的碱 基序列来制备的上述捕获探针固定于载体，用于分析包含于上述生物试样中的生物分子的 生物学意义，用于生成上述生物分子和上述分析单链核酸的结合信息。
[0174] 并且，本发明的用于在生物试样中分析生物分子的生物学意义的核酸芯片可以成 为由捕获探针固定于载体的结构，上述捕获探针使用选自所决定的分析单链核酸及质量控 制单链核酸的碱基序列和上述它们的互补的碱基序列中的至少一种碱基序列，或者使用由 与指示生物分子结合单链核酸及质量控制单链核酸的标记的碱基序列相完全互补结合的 碱基序列组成的捕获探针来合成。
[0175] 捕获探针可通过以往公知的多种方法(M. schena;DNA microarray ;a practical approach，Oxf ord，1999)来以规则方式制备生物芯片。
[0176] 并且，本发明的在生物试样中分析生物分子的生物学意义的核酸芯片由捕获探针 固定于载体，上述捕获探针使用上述分析单链核酸及质量控制单链核酸的信息来合成。
[0177] 若本发明的核酸芯片能够通过相同或类似的程度的精密度来分析未知的生物分 子的生物学意义，则减少固定于核酸芯片的捕获探针的数量在生物芯片的制备费用及分析 的效率性方面更为优选。
[0178] 上述结合信息是指借助制备于与生物分子相结合的分析单链核酸中的靶探针和 捕获探针的互补的结合来发生的信号，优选为由与组成载体的捕获探针相应的点组成的实 验方案，具体地，在通过与分别组成点的捕获探针相结合的靶探针的结合单链核酸的标记 物质所发生的信号，优选地，意味着荧光程度。上述结合信息为靶探针的分析靶探针及比较 分析探针的信号的组合，最终，在生物试样中表示生物分子结合单链核酸的分布状态，由此 能够推论与单链核酸相结合的生物分子的分布状态。
[0179] 根据如上所述的理由，还可以包括分析各个捕获探针对生物分子的生物学意义分 析的贡献度，在能够分析生物分子的生物学意义的范围内，基于分析的贡献度来筛选捕获 探针，从而减少固定于本发明的生物芯片的捕获探针的数量的步骤。
[0180] 若利用本发明的生物芯片来分析生物分子，则积累相关结合信息数据，从而对生 物分子的生物学意义的分析做贡献的特殊的单链核酸自然显现，由此能够发掘对分析生物 分子具有意义的生物标记物。
[0181 ]本发明提供基准物质，其特征在于，上述基准物质由不包含于生物试样的外源分 子组成，使用于对用于通过上述分析单链核酸来分析上述生物试样中的生物分子的生物学 意义的分析过程的质量控制及包含于生物试样的生物分子进行定量分析。
[0182] 本发明提供生物分子分析试剂盒，其特征在于，使用用于分析上述生物试样中的 生物分子的生物学意义的上述分析单链核酸及上述基准物质。
[0183] 本发明提供生物分子分析装置，其特征在于，通过利用上述分析单链核酸及上述 基准物质的生物分子分析方法来分析上述生物分子，包括准备在上述生物试样中的生物分 子的试样处理装置以及由制备上述生物分子-单链核酸复合物并扩增上述生物分子-单链 核酸复合物模块及分析上述扩增的产物的模块组成的扩增装置的生物分子的系统。
[0184] 为了更有效地试试本发明的生物分子分析方法，在包括试样处理装置和扩增装置 的利用分析结合单链核酸及基准物质的生物分子分析装置中，本发明的系统能够由混合腔 室、溶解腔室及反应腔室组成的试样处理装置及扩增装置构成，并能以合并的方式运行，上 述试样处理装置在包含生物分子的试样中分离生物分子，上述扩增装置由制备上述生物分 子-分析单链核酸及基准物质-单链核酸复合物，并扩增上述生物分子-分析单链核酸及基 准物质-单链核酸复合物的模块及分析上述扩增的产物的模块构成。
[0185] 被认为含有关注对象的生物分子的样品的分析伴随着一系列样品准备步骤，并在 由混合腔室和溶解腔室构成的试样处理装置中组成。它们的步骤可包括过滤、细胞溶解、生 物分子、生物分子-单链核酸复合物制备及与试剂的混合。为了获得对生物分子分析结果的 确信，对样品准备过程的污染进行控制。提供调剂用于核酸扩增反应的样品，并验证样品调 剂的有效性的方法。
[0186] 样品被认为含有选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组的靶实体，上述靶实体 包含至少一种靶生物分子。上述方法包括向具有样品和与样品调剂对照组相混合的混合腔 室的装置导入样品的步骤。样品调剂对照组选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组，上 述样品调剂对照组包含质量控制物质。上述装置包括溶解腔室和反应腔室。在混合腔室中， 样品与样品调剂对照组混合。
[0187] 上述方法包括:通过在溶解腔室中溶解处理存在于样品调剂对照组及样品内的情 况下的靶实体，来纯化生物分子的步骤;生成生物分子-单链核酸复合物的步骤;在反应腔 室内，将溶解腔室内的生物分子-单链核酸复合物露出于核酸扩增条件下的步骤；以及检测 是否存在至少一种质量控制物质的步骤。质量控制物质的积极的检测呈现对样品调剂过程 的满足，另一方面，若无法检测质量控制物质，则呈现出样品得到不适当的调剂。
[0188] 本发明提供扩增装置，上述扩增装置对用于核酸扩增反应的样品进行调节，并验 证其样品调剂的有效性。样品被认为含有选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组的靶实 体，上述靶实体包含至少一种靶生物分子。上述装置包括具有收容与样品相混合的样品调 剂对照组的第一腔室的本体。样品调剂对照组选自细胞、孢子、微生物及病毒组成的组，上 述样品调剂对照组包含质量控制物质。
[0189] 上述本体包括溶解腔室，上述溶解腔室对存在于样品内的情况下的靶实体及样品 调剂对照组进行溶解处理，使得生物分子从此游离，并分离生物分子-单链核酸复合物。并 且包括使游离的生物分子和分析单链核酸发生反应，来生成生物分子-单链核酸复合物的 溶解腔室。并且，上述本体包括维持用于扩增及检测的核酸的反应腔室。
[0190] 上述装置还包括至少一种流量控制器，上述流量控制器用于引导生物分子从具有 与样品调剂对照组相混合的样品的第一腔室向溶解腔室内流动，并引导在溶解腔室游离的 生物分子向反应腔室内流动。
[0191] 在几个实施例中，当样品通过溶解腔室流动时，溶解腔室收容用于捕获存在于样 品内的情况下的靶实体及样品调剂对照组的酶、至少一种过滤器及固相物质，上述装置还 包括用于收容通过溶解腔室流的所使用的样品流体的至少一种废弃腔室，并且，上述至少 一种流量控制器能够引导通过溶解腔室流的所使用的样品流体向废弃腔室流动。
[0192] 在几个实施例中，上述装置还包括与用于向溶解腔室提供超声波的溶解腔室的壁 相结合的超声换能器。在几个实施例中，上述装置在用于使样品调剂对照组及靶实体破裂 的溶解腔室内还包括的微珠。
[0193]根据本发明的另一实施方式，本发明提供用于决定溶解过程的有效性的方法。上 述方法包括与被认为含有选自由细胞、孢子、微生物及病毒组成的组的靶实体的样品和样 品调剂对照组相混合的步骤。靶实体包含至少一种质量控制物质。样品调剂对照组选自由 细胞、孢子、微生物及病毒组成的组，上述样品调剂对照组包含质量控制物质。存在于样品 调剂对照组和样品内的情况下的靶实体的混合物将得到溶解处理。并且，上述方法还包括 检测是否存在质量控制物质的步骤，以便在溶解处理中，生物分子从样品调剂对照组游离。 质量控制物质的积极的检测呈现对样品调剂过程的满足，另一方面，若无法检测质量控制 物质，则呈现样品被被适当的调剂。
[0194] 在几个实施例中，上述方法包括与样品调剂对照组相混合的样品通过收容固相物 质的腔室来流动的步骤，上述样品调制对照组用于在溶解处理之前，借助固相物质来捕获 存在于样品调剂对照组及样品内的情况下的靶实体。
[0195] 在几个实施例中，样品能够在混合样品和样品调剂对照组之前进行预先过滤。在 几个实施例中，溶解处理包括将样品调剂对照组及靶实体露出于超声波能量。在几个实施 例中，溶解处理还包括搅拌用于对样品调剂对照组及靶实体进行破裂的微珠的步骤。在几 个实施例中，样品调剂对照组为孢子。在几个实施例中，混合步骤包括对含有样品调剂对照 组的干燥微珠进行分解。
[0196] 在几个实施例中，溶解处理包括与化学溶解剂相接触的步骤。在几个实施例中，标 记物核酸序列使标记物核酸序列(例如，借助印制电路板(PCB，Printed Circuit Board)) 扩增，并通过检测所扩增的标记物核酸序列来检测。在几个实施例中，标记物核酸序列决定 能够与标记物核酸序列相结合的探针的信号是否超出限值来进行检测。
[0197] 扩增装置的反应容器的反应腔室内的反应混合物露出于核酸扩增条件。利用反应 的核糖核酸或脱氧核糖核酸模板的扩增已公知于[美国专利第4683195号；美国专利第 4683202号；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis et.al.，， 1990)]。脱氧核糖核酸的核酸扩增使脱氧核糖核酸发生热变形，并在与将要扩增的脱氧核 糖核酸分节相接的序列退火2个低核苷酸引物，且伴随着通过利用脱氧核糖核酸聚合酶使 所退火的引物发生延长来组成的循环反复。引物与靶序列的相对应的线（strand)进行交 配，并被定向为基于聚合酶的脱氧核糖核酸合成经过引物之间的区域来执行，进而将脱氧 核糖核酸分节的量有效地提高了 2倍。并且，扩张产物具有补充性且能够与引物相结合，因 此，实质上各个连续的循环将在前一个循环中所合成的脱氧核糖核酸的量提高2倍。这以每 个循环2 n(这里n为循环输）的比率带来特定靶分节的指数积累。如扩增反应及连接酶链式 反应(LCR，ligase chain reaction)之类的方法能够直接用于使核酸序列扩增。等温扩增 反应也已被公开，且能够根据本发明的方法来使用。
[0198] 优选地，核酸扩增反应能够使用使反应容器内的反应混合物以扩增反应中所需的 温度进行加热和/或冷却的热处理装置来执行。上述热处理装置还包括一个以上的检测机 构，上述检测机构在样品调剂对照组的标记核酸序列及样品中检测用于测试的一个以上的 靶核酸序列。可使用内置有用于扩增及检测反应容器内的核酸序列的光学检测仪的优选的 热处理装置(美国专利第6369893号；美国专利第6391541号）。并且，具有用于控制反应混合 物的温度，并在上述反应混合物中检测核酸序列的适合本发明的许多其他公知的方法。
[0199] 并且，优选地，用于在样品调剂对照组的质量控制物质及样品中进行测试的一个 以上的质量控制物质的检测使用探针来执行。优选地，反应容器具备一个以上的透明或透 光性壁面，通过光学来检测的探针的信号能够通过上述壁面。优选地，捕获探针能够使用于 检测及量化核酸序列。使用核酸捕获探针的分析法具有多种。这些捕获探针中一部分在与 其他分子或一部分(moiety)进行相互作用的过程中，因变化而生成在荧光源的荧光发光中 具有变化的信号。
[0200] 作为用于扩增产物的检测的其他优选的方法，荧光探针由通过荧光报道染料 (fluorescent reporter dye)模块来实现标记化的低核苷酸组成。捕获探针的分裂引起报 道染料的荧光强度的增加。
[0201] 为了在样品内确认靶生物分子的检测或者靶生物分子的缺乏，需要控制样品调剂 的污染。这就是样品调剂对照组需要接受与样品内的靶实体(例如，含有生物分子的靶细 胞、孢子、病毒或微生物）同样的处理的理由。若样品检测出制造对照组的质量控制物质，则 视为满足的样品调剂。若不能够检测质量控制物质的存在，则视为不适当的样品调剂，并将 对靶核酸序列的测试结果视为"未定"。优选地，在质量控制物质的存在与否通过以下方式 来检测:从能够与靶探针相结合的捕获探针的信号检测限值，例如，以针对分析法视为有效 的方式决定是否超出需要满足或超过的预先设定的荧光发光的限值。
[0202]流体控制装置能够根据需要的协议来由电脑来控制。若使用单阀，则可能只因一 个失败要素而生成高制备收益率。流体控制及处理结构部件的组合能够获得紧凑的装置 (例如，小型整块式），且能容易地实现成形及组装的自动化。如上所述，这些系统能够有利 地包括稀释及混合能力、中间清洗能力及强有力的加压能力。系统内的流体路径通常被关 闭，以便最小化系统内的流体的污染或容易收容及控制这些流体。反应容器能够便利地分 离及更换，且能够在几个实施例中废弃。
[0203] 本发明提供生物分子的分析方法及装置，其特征在于，用于分析利用上述生物分 子和分析单链核酸的结合信息数据的生物学意义的结构包括:接收所输入的患者组的上述 生物分子和分析单链核酸的结合信息和对照组的上述生物分子和分析单链核酸的结合信 息数据，并构建数据库的模块;利用所输入的上述结合信息数据，来在分析系统中执行预处 理的模块;借助预处理的上述结果来生成患者模型的模块;加载所生成的上述模型并适用 于住院患者来执行盲测(Blind test)诊断的模块；以及通过交叉验证评价系统的性能的模 块。
[0204] 在本发明中，利用上述生物分子和分析单链核酸的结合信息数据的生物学意义预 测系统仅为示例性的诊断，本发明并不局限于此。
[0205] 通过本发明生成的许多生物分子和分析单链核酸的结合信息数据作为具有高层 次特征的庞大数量的信息，可生成与细胞、组织或者疾病有关的多种信息。在利用所输入的 上述数据在分析系统中执行预处理的模块找出对患者状态产生影响的特征，而用于提高分 类性能的多变量分析方法是为了准确的治疗和诊断而找出重要变数来缩小层次，或者通过 特性的变形来找出主要特质的特征选择(Feature Selection)程序。
[0206]具体地，特征抽取根据是否将类信息使用于学习来具有无监督学习 (Unsupervised Learning)方式或监督学习 （Supervised Learning)方式。主要使用于无监 督学习方式中的主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)或独立成分分析(ICA， Independent Component Analysis)能够考虑变数的特征来抽取特征。监督方式为利用类 信息和变数之间的常规意义或变数之间的相互关系来选择变数的方式。这个方式能够在具 有的特质集合中向前(Forward)或者向后(Backward)依次添加或删除特质，并通过适用于 分类器的功能来计算出主要特质。
[0207]根据所预处理的上述结果来执行学习，从而生成患者模型的模块为将所选择的特 质通过适合的分类器(Classifier)按各等级进行分类的程序。
[0208] 本发明使用了人工神经网络(Artificial Neural Network)，但因为根据输入和 输出来决定动作的特性，应用于模式识别、函数逼近、分类技术等多种领域。人工神经网络 的结构由层(1 ay er )、节点(node s )、神经网络之间的连接加权值构成。本发明所使用的神经 网络层之间的连接方式为前馈(Feed-forward)方式。根据输入模式，利用对各节点的神经 网络的连接加权值和激活函数来计算出输出值。当通过所生成的结合信息来处理一件事 时，若推演的值和实际结果值不同，则将所计算出的值与实际结果值进行比较，并反复执行 较少误差的过程来找出。
[0209] 本发明提供生物分子分析方法及装置，其特征在于，生成上述患者模型的方法选 自由线性模型（linear models)、支持向量机（support vector machines)、神经网络 (neural networks)、分类回归树（classification and regression trees)、集成学习法 (ensemble learning methods)、判别分析（discriminant analysis)、最邻近法（nearest neighbor method)、贝叶斯网络（Bayesian networks)、独立成分分析（independent components analysis)组成的组中。
[0210] 对于未能证明准确而综合性的原理(Mechanism)的大多数疾病而言，可以说基于 事例的诊断的重要性非常大。但是，基于特定机器学习技术来考虑的现有事例基础机器学 习推理系统由于准确度低，因此持续地需要开发得到改善的系统。并且，现有的系统只开发 成利用所有已学习的临床检查项目的疾病鉴别器，且没有提供能够使用各疾病的临床检查 项目的重要度或优先顺序。
[0211]本发明涉及基于用来支援医生的准确的疾病诊断的事例来利用机器学习推理的 疾病诊断及检查项目选定系统，涉及通过疾病鉴别器来分析新患者的检查信息，并判断疾 病，选定用于对基于预防诊断的各疾病进行最终判别的最小的重要检查项目，并提供的系 统，上述疾病鉴别器为通过患者的事例数据库(Database)来训练的人工神经网络(Neural Network)进行的机器学习机。通过机器学习推理的疾病诊断技术单独适用机器学习技术来 构成。生成上述患者的模型的方法具有线性模型（linear models)、支持向量机（support vector machines)、神经网络（neural networks)、分类回归树（classification and regression trees)、集成学习法（ensemble learning methods)、判别分析（discriminant analysis)、最邻近法(nearest neighbor method)、贝叶斯网络（Bayesian networks)、独 立成分分析（independent components analysis)等。
[0212] 在本系统的结构及在业务中的应用可分成两种结构，g卩，仅用于诊断的独立 (stand a 1 one)形态的诊断系统和现有的医院信息系统，即，能够由与医嘱传输系统(0CS， Order Communication Syste)、医学影像归档与通信系统（PACS，Picture Archiving and Communication Systems)、实验室信息系统（LIS，Laboratory Information Management System)等相连接的联合系统构成。为了与联合系统的联动，需要依据健康信息交换第七层 协议（HL7，Health Level Seven)及医疗数字影像传输协议（DIC0M，Digital Imaging and Communications in Medicine)的规章来构建系统。作为初期模型，本系统与病人监护系统 (PMS，Patient Monitoring System)联动，来提高了诊断的准确度。并且，不仅是病人监护 系统，而且还开发了与医嘱传输系统、电子病历(EMR，Electronic Medical Record)、医学 影像归档与通信系统等多种医疗信息系统相联动的系统，从而能够开发成包含有多种疾病 因子的更准确的诊断系统。
[0213] 本发明提供利用分析单链核酸及基准物质的生物分子分析方法，其特征在于，上 述生物试样选自由细菌、真菌类、病毒、细胞株及组织组成的组中，上述生物分子选自由蛋 白质、碳水化合物、脂质、多糖体、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体及酶组成的组中的至少一 种。
[0214] 以下，参照附图和实施例对本发明的基准物质及生物芯片的制备方法、由利用它 们的两个或者两个以上的生物分子组成的生物试样中的生物分子的分析方法进行详细说 明。以下的具体例仅用于以例示性的方式说明本发明，并不用于限定本发明的范围。
[0215] 实施例1.制备随机碱基序列单链核酸
[0216] 利用具有如下的随机的碱基序列的单链的脱氧核糖核酸寡核苷酸，通过聚合酶链 式反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)来制备双链的脱氧核糖核酸之后，通过体外转 录来制备了单链的核糖核酸库(随机单链核酸）。
[0217] 5，-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N40 CATAACCCAGAGGTCGA TGGATCCCCCC-3'（其 中，带下划线的碱基排列为核酸库的固定的部分，N40表示A、G、T及C等碱基以随机方式存在 的序列部分。）
[0218]利用于聚合酶链式反应的FW引物能够与上述碱基排列的带下划线的碱基的5'末 端进行碱基结合，并包含有用于噬菌体T7的核糖核酸聚合酶的启动子碱基序列。
[0219]利用于聚合酶链式反应的RE引物能够与上述碱基排列的带下划线的碱基的3'末 端相碱基结合。并且，FW引物和RE引物可分别可含有用于实现之后的克隆化的EcoRI和 BamHI等限制酶切断碱基序列。
[0220] 与生物试样发生反应的随机单链核酸为包含2'-F_置换嘧啶的核糖核酸库，以如 上所述的方式设置并制备脱氧核糖核酸核酸库转录组及聚合酶链式反应引物，从而以聚合 酶链式反应及体外转录方法准备。
[0221] 聚合酶链式反应将lOOOpmoles单链核酸、2500pmoles聚合酶链式反应的引物对 (5P7)在50mM KCl、10mM Tris-Cl(pH 8.3)、3mM MgC12、0.5mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP及 dTTP)、0.1U Taq DNA Polymerase(Perkin-Elmer，Foste;r City Calif.)中执行聚合酶链 式反应之后，通过QIAquick-spin PCR纯化柱（凯杰（QIAGEN Inc.，Chatsworth Calif.)公 司）来实施了纯化。
[0222] 包含2'-F_置换嘧啶的随机单链核酸通过体外转录来合成，并通过纯化来准备。将 200pmoles双链脱氧核糖核酸、40mM Tris-Cl(pH 8.0)、12mM MgC12、5mM DTT、lmM spermidine、0.002%Triton X-100、4%PEG 8000、5U T7RNA Polymerase、lmM ATP、GTP、 3mM 2'F-CTP及2'F-UTP在37°C温度下进行6~12小时的反应之后，通过Bio-Spin 6柱色谱 (佰乐生命医学产品公司（Bio-Rad Laboratories，Hercules Calif ?))纯化之后，检索了利 用UV分光仪纯化的核酸的量及其纯度。
[0223] 实施例2.制备与人类血清蛋白质相结合的生物分子结合单链核酸
[0224] 2-1.生物分子-单链核酸复合物的确保
[0225] 2-1-U青洗方法
[0226] 在本发明中，由两种或两种以上的生物分子组成的生物试样为人类血清蛋白质。 将在实施例1中合成的随机单链核酸的1〇15碱基序列/L的浓度溶液以200pmol/L的浓度在选 择缓冲液(50mM的TrisCl(pH7 ? 4)、5mM的KC1、100mM的NaCl、ImM的MgCl2、0 ? 1 % 的NaN3)中，以 80°C的温度加热10分钟之后，放置于冰中10分钟。添加所使用的单链核酸的5倍的酵母转运 核糖核酸（tRNA，Transfer Ribonucleic Acid) (yeast tRNA，Life Technologies公司）及 0.2%牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin，Merck公司），来准备了反应溶液。
[0227] 将包含有基准物质的10iil的血清生物试样添加于90yl的上述反应溶液中，并加入 硝酸纤维素膜盘(nitrocellulose membrane disc)摇晃30分钟，从而实施了反应。从上述 准备的核糖核酸单链核酸处理于附着有血清生物试样的盘中，并反应了30分钟。
[0228] 在反应之后，通过如下所述的洗涤缓冲液反复进行清洗过程，从而通过一次的选 择过程来去除了未结合的核糖核酸单链核酸，确保了与人类血清生物试样的人类血清蛋白 质相结合的单链核酸的制备所需的人类血清蛋白质(生物分子)_单链核酸复合物。
[0229] 为了确保上述生物分子-单链核酸复合物，洗涤缓冲液使用0至lx的Selex缓冲液 或0至500mM的EDTA溶液。通过执行反转录聚合酶链式反应，扩增制备了用于指示将所确保 的复合物与血清蛋白质相结合的核糖核酸(生物分子结合单链核酸）的脱氧核糖核酸池。此 外，为了制备与外部基准物质结合额单链核酸，能够在确保人类血清蛋白质-单链核酸复合 物的同时确保外部标准物质-单链核酸结合复合物。
[0230] 并且，以通过将所确保的反转录聚合酶链式反应产物的脱氧核糖核酸克隆于核外 遗传基因来确保单克隆的过程，完成了生物分子结合-单链核酸的制备。与这些生物分子相 结合的单链核酸的碱基序列的决定通过分离核外遗传基因来执行。
[0231] 用于生成生物分子的实验方案的本发明的生物芯片所使用的捕获探针的碱基序 列，使用与人类血清蛋白质（生物分子)相结合的上述单链核酸的碱基序列信息进行设计。 因此为了选定单链核酸以及制备捕获探针，在使用对二维结构实施建模的MF0LD程序来确 认二维结构及结构体自由能之后，选定具有稳定度最高的二维结构的单链核酸，并以此为 基础设计捕获探针。
[0232] 外部标准物质选定五个植物特异蛋白质，通过大肠菌表达系统使相应的蛋白质表 达之后，分离蛋白质，并通过指数式富集的配体系统进化方法确保了与外部标记物相结合 的单链核酸。通过它们的碱基序列来设计了与外部标准物质相应的捕获探针。
[0233] 2-1-2.毛细管电泳
[0234] 将以上合成的随机单链核酸的1015碱基序列/L的浓度溶液以200pmol/L的浓度放 入反应溶液[lOOmM 1^8-11(：1化118.2)、2001111的似(：1及10111]\1的]\%(：12]，并在80°(：的温度下加 热10分钟之后，放置于冰中10分钟。添加所使用的单链核酸的5倍的酵母转运核糖核酸 (tRNA，Transfer Ribonucleic Acid)(yeast tRNA，美国生命技术公司（Life Technologies))及0 ? 2%牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin，默克公司（Merck))， 来准备了反应溶液。
[0235] 将10iil的血清生物试样添加于90iil的上述反应溶液，并反应了 30分钟。将上述反 应混合溶液作为缓冲溶液(50mMTris-HCl，pH8.2)实施了毛细管电泳。本发明的利用毛细管 电泳的所有分析通过使用安装有fused-silica capillary(美国贝克曼库尔特公司 (Beckman Coulter);长 37cmX 内径 75m)的 P/ACE 5000CE-LIF system(美国贝克曼库尔特 公司）来实施。通过LIF system内的检测器(detector)来捕集以附着于系统的488nm的3mW 氩离子激光器(Ar-ion)的方式激发（excitation)焚光物质，并通过520nm的过滤器排放 (emission)的信号。
[0236] 利用0.2-um孔径（pore size)过滤器来过滤使用于分析及毛细管处理的所有溶 液，毛细管在分别滴落1N的NaOH和蒸馏水5分钟，并进行清洗之后使用，各个电泳之间利用 1N的NaOH、蒸馏水及缓冲溶液来分别清洗毛细管2分钟。
[0237] 在此，通过10kV的电压实施电泳并分析了其结果。以利用毛细管电泳来分析生物 分子-单链核酸的复合物生成的图表，来确认了生物分子-单链核酸复合物以特异性的方式 生成并分离。
[0238] 通过对分离的复合物执行反转录聚合酶链式反应，扩增制备了指示与血清蛋白质 相结合的核糖核酸(生物分子结合单链核酸）的脱氧核糖核酸池。此时，能够通过反复实施 多次上述的选择和扩增过程，来制备生物分子结合单链核酸。
[0239] 2-1-3.硝酸纤维素和尼龙的结构体
[0240]将以上合成的随机单链核酸的1015碱基序列/L的浓度溶液以200pmol/L的浓度放 入反应溶液[lOOmM 1^8-11(：1化118.2)、2001111的似(：1及10111]\1的]\%(：12]中，并在80°(：的温度下 加热10分钟之后，放置于冰中10分钟。添加所使用的单链核酸的5倍的酵母转运核糖核酸 (tRNA，Transfer Ribonucleic Acid)(yeast tRNA，美国生命技术公司（Life Technologies))及0 ? 2%牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin，默克公司（Merck))， 来准备了反应溶液。
[0241] 将lOyl的血清生物试样添加于90yl的上述反应溶液之后，在上述准备的核糖核酸 单链核酸反应30分钟，来生成生物分子-单链核酸复合物。
[0242] 在与人类血清生物试样(生物分子)相结合的生物分子结合单链核酸的选定中，若 将上述反应混合溶液向由硝酸纤维素(nitrocellulose)和尼龙(nylon)组成的结构体处理 并施加压力，则生物分子-单链核酸复合物位于硝酸纤维素过滤器上，而未结合的单链核酸 位于尼龙上。回收上述硝酸纤维素过滤器，并利用多种洗涤缓冲液反复实施清洗过程，从而 通过一次性选择过程来去除了硝酸纤维素过滤器中的未结合的单链核酸，确保了人类血清 蛋白质(生物分子)_单链核酸复合物。
[0243] 为了确保生物分子-单链核酸复合物，洗涤缓冲液使用0至lx的Selex缓冲液或0至 500mM的EDTA溶液。通过执行反转录聚合酶链式反应，扩增制备了用于指示将所确保的复合 物与血清蛋白质相结合的核糖核酸(生物分子结合单链核酸）的脱氧核糖核酸池。此时，也 能够通过反复实施多次上述选择和扩增过程来制备生物分子结合单链核酸。
[0244] 2-2.生物分子结合单链核酸的制备
[0245] 通过对通过上述步骤确保的复合物执行反转录聚合酶链式反应，扩增制备了指示 与血清蛋白质相结合的核糖核酸(生物分子结合单链核酸）的脱氧核糖核酸池。此时，也能 够通过反复实施多次上述选择和扩增过程来制备生物分子结合单链核酸。
[0246] 以通过将所确保的反转录聚合酶链式反应产物的脱氧核糖核酸克隆于核外遗传 基因来确保单克隆的过程，完成了生物分子结合-单链核酸的制备。与这些生物分子相结合 的单链核酸的碱基序列的决定通过分离核外遗传基因来执行。
[0247] 用于生成生物分子的实验方案的本发明的核酸芯片所使用的捕获探针的碱基序 列，使用与人类血清蛋白质（生物分子)相结合的上述单链核酸的碱基序列信息进行设计。 因此为了选定单链核酸以及制备捕获探针，在使用对二维结构实施建模的MF0LD程序来确 认二维结构及结构体自由能之后，选定具有稳定度最高的二维结构的单链核酸，并以此为 基础设计捕获探针。
[0248] 以通过将所确保的反转录聚合酶链式反应产物的脱氧核糖核酸克隆于核外遗传 基因来确保单克隆的过程，完成了生物分子结合-单链核酸的制备。与这些生物分子相结合 的单链核酸的碱基序列的决定通过分离核外遗传基因来执行。
[0249] 用于生成生物分子的实验方案的本发明的核酸芯片所使用的捕获探针的碱基序 列，使用与人类血清蛋白质（生物分子)相结合的上述单链核酸的碱基序列信息进行设计。 因此为了选定单链核酸以及制备捕获探针，在使用对二维结构实施建模的MF0LD程序来确 认二维结构及结构体自由能之后，选定具有稳定度最高的二维结构的单链核酸，并以此为 基础设计捕获探针。
[0250] 实施例3.质量控制单链核酸的制备
[0251 ]基准物质由从 http: //genomics .msu ? edu/plant_specific/中确保的A、B、C、D及E 等五个种类植物特异蛋白质组成(参照表1)。
[0252]表 1
[0253]植物特异蛋白质
[0255] 选定的五个植物特异蛋白质在利用大肠杆菌表达系统使相应的蛋白质表达后，分 离所表达的蛋白质，并通过标准指数式富集的配体系统进化（Ellington，A.D. and J.ff.Szostak.1990.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 346:818-822;Gold，L.，P.Allen，J.Binkley，D.Brown，D.Schneider， S?R?Eddy，C?Tuerk，L?Green，S?Macdougal，and D.Tasset.1993.RNA：the shape of things to come ? pp.497-510.In：R.F.Gestelend and J.F.Atkins(eds.).The RNA World，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)来确保与基准物质相结合 的单链核酸。将上述单链核酸命名为质量控制单链核酸，通过它们的碱基序列来设计与质 量控制单链核酸相应的捕获探针。
[0256] 实施例4.生物芯片(核酸芯片)的制备
[0257] 作为固定于载玻片表面的捕获探针，通过对与具有在实施例1中选定的碱基序列 的3000生物分子结合单链核酸相互补的碱基序列及具有与质量控制单链核酸相互补的碱 基序列的单链核酸(寡核苷酸)进行有机合成（百奥尼公司（Bioneer Corporation))来准备 了捕获探针。
[0258] 利用作为涂敷有y -氨基丙基硅烷(GAPS，Gamma Amino Propyl Silane)的玻璃载 玻片的UltraGAPSTM Coated Slide(康宁公司）来制备以规定规则粘着有捕获探针的核酸 芯片。核酸芯片的制备使用了作为pin方式的微陈列系统(Microarrayer system，GenPak公 司），点距（spot spacing)使中心距（center-to-center)成为370um。将各个捕捉单链核酸 溶解于标准溶液来调节了浓度。此时，微阵列内的湿度维持在70 %，并执行了点样 (spotting)。将所点样的载玻片在加湿室（humidif ied chamber)中放置24~48小时之后， 在紫外线链结箱(UV crosslinker)中执行烘烤(baking)过程。通过广泛公知的方法，将捕 捉单链核酸固定于玻璃载玻片之后，直接对载玻片进行离心分离来进行干燥，之后在阻隔 光的情况下进行保管。
[0259] 实施例5.靶探针的制备
[0260] 以同等的量混合在实施例1中制备并使用于生物芯片(核酸芯片）的制备的单链核 酸所插入的核外遗传基因和在实施例3中制备的质量控制单链核酸所插入的核外遗传基 因，来准备了核外遗传基因池。并且，与人类血清蛋白质等相结合的单链核酸池通过设计制 备上述核外遗传基因池及聚合酶链式反应引物，以聚合酶链式反应及体外转录方法按照如 下步骤准备。
[0261] 在准备的核外遗传基因池中将lpg核外遗传基因作为转录组，在聚合酶链式反应 溶液、1 OOpM 5 ' -引物、1 OOpM 3 ' -引物及dNTP混合物（5mM的dATP、5mM的CTP、5mM的 dGTP、5mM 的dTTP)中通过标准聚合酶链式反应方法，以在94 °C温度下30秒、在52 °C温度下30秒及在72 °C温度下20秒的条件反复执行30次循环，从而合成双链核酸，并利用QIAquick-spin PCR纯 化柱(凯杰公司）来实施了纯化。
[0262] 将包含2'-F_置换嘧啶的核糖核酸分子的单链核酸以体外转录的方式合成，并通 过纯化来准备。
[0263] 将200pmoles双链脱氧核糖核酸、40mM Tris-Cl(pH8.0)、12mM MgC12、5mM DTT、 ImM spermidine、0.002%Triton X-100、4%PEG 8000、5U T7RNA Polymerase、lmM ATP、 GTP、3mM 2 'F-CTP及2 'F-UTP在37°C温度下进行6~12小时的反应之后，通过Bi〇-Spin6柱色 谱(佰乐生命医学产品公司）来实施了纯化。
[0264] 将分别以不同量包含基准物质的基准物质I添加于磷酸盐缓冲溶液中。由作为基 准物质的A、B、C、D及E等五个种类植物特异蛋白质组成(参照表1)。由0.01pg/ml的外源生物 分子A、1.0pg/ml的外源生物分子B、100.0pg/ml的外源生物分子C、10.0ng/ml的外源生物分 子D及1.0ug/ml的外源生物分子E等组成了标准物质I。
[0265] 使用于分析的人类血清为健康的人及具有稳定型心绞痛的心血管疾病患者的血 清，将l〇yl的血清生物试样添加于90iil的上述包含标准物质I的溶液，并添加硝酸纤维素膜 (nitrocellulose membrane)盘摇晃并反应30分钟来准备生物试样。投入先前制备的100~ 400ng的单链核酸来反应30分钟，从而生成生物分子-单链核酸复合物。
[0266] 将准备的单链核酸处理于附着有包含标准物质I的血清生物试样的盘，来反应了 30分钟。选择缓冲液或50mM的EDTA清洗三次，并以分离的方式收货了附着有蛋白质-单链核 酸的盘。
[0267] 将附着有上述所收获的蛋白质(生物分子)-单链核酸的盘或作为分析靶探针而附 着有外部标记物及蛋白质（生物分子)_单链核酸的盘加入到反转录聚合酶链式反应溶液， 来实现反转录之后，通过标记有Cy-5的引物(5 '-Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3 '）执行扩增反 应，从而准备了作为标记有Cy-5的单链核酸的分析靶探针。利用从通过对血清蛋白质的核 外遗传基因以及外部基准物质的核外遗传基因进行等量混合所得的上述核外遗传基因池 制备的单链核酸，以与上述相同的方法来实施反转录，并通过标记有Cy-3的引物(5'-Cy3-CGGAAGCGTGCTGG GCC-3 '）来实施扩增反应，从而准备了标记有Cy-3的作为单链核酸的比较 靶探针。以同等量混合上述两个溶液，来制备包含分析靶探针及比较靶探针的靶探针。
[0268] 实施例6.生物芯片(核酸芯片)和靶探针溶液的杂交反应
[0269] 将在上述实施例4中准备的靶探针溶液处理于本发明的生物芯片(核酸芯片）的捕 获探针，并在60°C温度下杂交4~12小时，在42°C温度下用O.lx柠檬酸钠缓冲溶液（SSC， Saline sodium citrate)进行清洗。此时，杂交溶液包含1M的氯化钠、0.3M的朽1檬酸钠 (sodium citrate)、0.5%十二烷基硫酸钠（SDS，sodium dodecyl sulfate)或 100/ml的娃 鱼精脱氧核糖核酸、〇. 2 %牛血清白蛋白或单链核酸。
[0270]向结束预杂交的载玻片处理在实施例3准备的靶探针溶液，并在42°C温度下执行 杂交(Hybridization)12小时之后，用清洗溶液清洗核酸芯片。此时，清洗溶液的组成依次 为例如，1XSSC+0 ? 2 % SDS、1XSSC+0 ? 2 % SDS、0 ? 5XSSC+0 ? 2 % SDS及0 ? 01XSSC+0 ? 2% SDS 的步 骤，各个步骤均在42 °C温度下执行了 30分钟。
[0271] 实施例7.生物芯片(核酸芯片)的点探索及分析
[0272] 在上述实施例4的清洗结束之后，将载玻片通过离心分离干燥，之后利用具有用于 激发（excitation)所使用的焚光染料的适当的波长的激光（Cy5,635nm)的激光扫描器 (laser scanner，GenePix4000,奥松公司）来进行了探索。焚光图像以多图像标签图像文件 格式（multi image tagged image file，TIFF)存储之后，通过适当的图像分析（image analysis)软件(GenePix Pro 3.0,奥松(Axon)公司）来分析。
[0273]每个点（spot)信号强度（signal intensity，单位:quanta)使用减去周围背景的 基本信号的信号，此时，背景信号意味着由特定点的周围中的四个点的周边信号组成的局 部背景（local background)。点具有的像素(pixel)的90%以上示出超过背景信号+2标准 偏差（S.D. ;standard deviation)的信号强度时，包括在数据分析，若不满足上述条件，贝lj 分类为不包括数据的点(bad spot)，一般不包括在分析。
[0274] 根据标记效率（Labeling efficient)的偏差（variation)利用内标准（internal standard，IS)的信号来平准化(举例来说，归一化强度(Normalized Intensity)=探针强 度(Probe Intensity)/内部标准强度（IS intensity))，在单标记(monolabeling)的情况 下，通过Cy5信道的信号强度(signal intensity)来记录其结果，在点样(spotting)为两倍 以上的情况下，使用平均值。在革G单链核酸的信号强度(signal intensity，S)中，对点具有 的像素（pixel)求出各个信号强度之后使用它们的中值(median)(像素的中值(median value of pixel-by-pixel))。信号强度(S)利用内标准（IS)来平准化根据标记效率的偏 差。
[0275] S'（标准值(normalized value)) =S(Cy5_参考值(reference)) X (Cy5_内标准）
[0276] 能够通过以上方法查明像素密度的分析结果和实际生物试样量之间的关系，来确 认其相关关系。能够提供将核酸芯片荧光数据图像化，并通过所有点的图案在生物试样中 确认生物分子实验方案的方法，点的图案能够通过层次聚类(Hierarchical Clustering) 及人工神经网络(Artificial Neural Network)等方法分析并使用。点的焚光程度根据捕 获探针和靶探针生成的双链的性质以多样的方式呈现。根据组成点的分析靶探针及比较靶 探针的量决定点的荧光程度。
[0277] 首先，上述实施例的图像如图6所示，基准物质由外源生物分子A、B、C、D及E等五个 种类植物特异蛋白质组成。将0 . 〇lpg/ml的外源生物分子A、1.0pg/ml的外源生物分子B、 100.(^8/1111的外源生物分子(]、10.01^/1111的外源生物分子0及1.0呢/1111的外源生物分子￡加 入于血清试样中进行分析。与基准物质相应的点的荧光程度通过质量控制比较靶探针和质 量控制分析靶探针的量来决定。由于知道质量控制比较靶探针的量，因此与基准物质相应 的点的荧光程度根据在分析生物试样中的基准物质形成的质量控制分析靶探针的量来决 定。即，与基准物质相应的点的荧光程度与包含于分析生物试样的基准物质的量有关。因 此，能够将它们的相关关系制成标准曲线，利用所要的点的荧光程度来对所要的点进行定 量分析。
[0278] 在本实验中，由于比较靶探针由规定的量组成，因而点的荧光程度表示分析靶探 针的量，分析靶探针的量表示人类血清蛋白质-单链核酸复合物的量。并且，上述复合物的 量表示在生物试样中的生物分子的量。因此，能够从点的荧光程度与点相应的生物分子的 生物试样中，确认特定生物分子的量。最终能够分析所生成的点的荧光程度，确认核酸芯片 的所有点的图案，从而在人类血清中确认血清蛋白质的实验方案。
[0279] 即，所生成的点呈现出蓝色-黄色-红色的色谱为标记有与捕获探针相结合的Cy-3 的竞争性抑制剂和标记有Cy-5的靶探针的比率以多样方式呈现的现象，特定点的色谱的程 度表示存在于组成人类血清的特定的血清生物试样的特定的生物分子(蛋白质）的量，示出 核酸芯片上的所有的点的色谱的图像在特定的生物试样中与生物分子实验方案相对应。
[0280] 即，在本发明的生物分子分析方法中，用于在特定点中与捕获探针相结合来生成 双链的靶探针由标记有Cy-3的比较靶探针和标记有Cy-5的分析靶探针组成，前者以规定的 量存在，但后者在人类血清中以与相应的生物分子成正比的方式存在。由此，若后者以相对 少量存在，则特定的点为蓝色，若以相似的方式存在，则特定的点为黄色，若以过量的方式 存在，则特定的点为红色。
[0281] 在核酸芯片上，通过点的分析，荧光程度根据双链内分析靶探针数而不同，这与生 物分子的数量具有相关关系。因此，用于反映组成本发明的核酸芯片的所有点的色谱的图 像为包含未知的生物分子的生物试样的生物分子实验方案。
[0282] 以上的试验结果如图6所示，而如图所示，在附着有捕获探针的载玻片中，作为基 于与血清蛋白质相结合的单链核酸的捕获探针所附着的部分的点生成多种荧光程度、蓝 色-黄色-红色的色谱。
[0283] 实施例8.利用微珠的溶液阵列的制备及实验方案的生成
[0284] 微珠能够选自由聚苯乙稀（polystyrene)、聚甲基丙稀酸甲酯（polymethyl methacrylate)、胶乳（latex)、娃石（silica)、聚乙稀（polyvinyltoluene)、苯乙稀乙烯基 甲苯聚合物（8七5^6116￥；[11711：01116116)及苯乙稀丁二稀聚合物（8七5^6116-131^3(11611)组成的组 中的一种来使用。并且，对上述微微珠的大小没有限制，能够使用微珠的表面没有被改性的 微珠和微珠的表面被改性为羧基的微珠。
[0285] 上述固定化步骤利用羧基对微珠的表面进行改制，并利用NHS/EDC反应来固定 ELP〇
[0286] 作为固定于微珠的表面的捕获探针，通过对与具有在实施例1中选定的碱基序列 的3000生物分子结合单链核酸相互补的碱基序列及具有与质量控制单链核酸相互补的碱 基序列的单链核酸(寡核苷酸)进行有机结合来准备(百奥尼公司）。
[0287] 8-1.微珠阵列的制备
[0288] 通过利用上述捕获探针来分别准备的微珠 (xMAP carboxylated microspheres; Luminex Corp.Austin，TX)来将捕获探针固定于微珠的工作来制备微珠阵列。
[0289] 使用先前在实施例4中制备的捕获探针，分别以100uM溶解捕获探针来准备。将所 要反应的微珠与各个编号相匹配地混合好之后，分出40ul来准备(根据各个探针准备分别 不同编号的微珠，混合好并为了与探针的反应而在混合好微珠的状态下，将40ul通过吸移 管取出并分给新管来准备）。混合〇. 1M的MES(pH4.5) 20ul，取出2ul的准备好的探针，并与微 珠混合。之后加入新制备的 lul 的 10ml/ml EDC( l-Ethyl-3-(3_dimethylaminopropyl) carbodiimide HC1、PIERCE)溶液并实施了反应。在暗的地方摇晃约30分钟来实施了反应。 重新添加 lul的新制备的10ml/ml的EDC溶液，并继续反应了约20分钟。此后，在各个管内放 入500ul的0.02%TWeen-20溶液并进行了混合。对各个管的微珠进行离心分离来去除上层 液，并再次混合500ul的0.1 %十二烷基硫酸钠溶液。如8，通过对各个管的微珠进行离心分 离，来去除层液。此后在150ul的TE(pH8.0)缓冲液中溶解并混合之后，保管于4暗室。
[0290] 8-2 ?实验方案的生成
[0291 ]如上述实施例5，准备分析靶探针，例外地，通过由生物素（Biotin)标记的引物 (5 ' -Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3 '）来执行扩增反应，从而准备由生物素标记的作为单链核 酸的分析靶探针。
[0292] 在实施例8-1中制备的杂交微珠与在上述准备的分析靶探针溶解于上述杂交溶液 之后，相互发生杂交反应。在95°C温度下反应5分钟之后，在40 °C温度下反应30分钟。在此， 利用96孔过滤板(96well Filter plate)来移动结束反应的反应物之后，利用上述清洗缓 冲液来清洗三次。在清洗之后，使用稀释了500倍的链霉亲和素藻红蛋白（西格玛奥德里奇 公司，S3402)的溶液100ul，在暗室搅拌了 15分钟。
[0293] 利用以这种方式准备的杂交微珠样品，在LuminexlOO机器中按不同的孔(well)， 分别读取微珠(Bead) c^LuminexlOO利用两个激光（lazer)，其中一个计算微珠编号，另一个 计算发生反应的藻红蛋白的量，从而以数据显示。读取相应的微珠，并与各个捕获探针相结 合的革G探针的量成为微珠的焚光数据(MFI，Mean fluorescent intensity)。
[0294] 实施例9.心血管患者的血清蛋白质分析的反应
[0295] 从图6的结果可以确认，利用基于与人类血清蛋白质相结合的靶单链核酸的核酸 芯片，能够从人类血清确认血清蛋白质的实验方案，并且，健康的人A及稳定型心绞痛心血 管疾病患者B的血清内生物分子的实验方案不同。
[0296] 图7为通过流程图来示出对利用本发明的核酸芯片来从患者的血液生物试样中生 成的实验方案进行按不同的疾病组组成的数据库化的过程的顺序的图。图8为将所生产的 实验方案作为由不同的疾病组组成的数据库及利用人工神经网络的程序，对特定人的血清 生产生物分子实验方案，来诊断疾病的流程图。
[0297] 如图8所示，能够通过生物信息学技术来分析由从很多生物试样中生产的实验方 案构建的数据库，来确保有用的信息。
[0298] 用于构建心血管疾病诊断用数据库的血清生物试样的临床材料如以下表2所示， 未健康的人37名、稳定型心绞痛36名、不稳定型心绞痛27名及心肌梗塞患者27名等总共127 名。利用健康的人、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛及心肌梗塞等心血管患者的血清实验方 案数据库来检查被称为Lee2-1 (99)的人的血清生物试样的结果如图9,且能够通过72.5% 的十倍交叉验证(lOfold cross validation)来预测为健康的人。
[0299] 表 2
[0300]心血管疾病患者的临床信息
[0301]
[0302] 用于构建肝癌诊断用数据库的血清生物试样的临床材料如表3所示，健康的人19 名、非转移性肝癌患者72名及转移性肝癌患者11名，故肝癌患者为83名，且生物试样的总数 为102例。
[0303]从肝癌患者和健康的人的血清蛋白质实验方案的数据库中组成肝癌患者和健康 的人的患者模型之后，在上述肝癌患者的数据库中组成转移性患者和非转移性患者的患者 模型。
[0304] 首先，盲(Blind)患者能够利用肝癌患者和健康的人的患者模型，通过利用人工神 经网络的程序来区分肝癌患者，并能连续地利用转移性患者和非转移性患者的患者模型来 将阳性肝癌患者作为追加的利用人工神经网络的程序，来确认肝癌进行步骤的转移性状 态，而这不仅能够检查转移性状态等疾病的进行状态，而且还能够检查预后及药物反应性 等。
[0305]利用健康的人和肝癌的血清实验方案数据库来检查叫做KM的人的血清生物试样 的结果如图10所示，能够通过93.0%的十倍交叉验证（10fold cross validation)来预测 为肝癌患者。
[0306] 追加地，利用用于检查是否转移的健康的人、非转移性肝癌及转移性肝癌的血清 蛋白质实验方案数据库来检查叫做KIM的人的血清生物试样的结果如图8所示，能够通过 76.0%的十倍交叉验证(lOfold cross validation)来预测为非转移性肝癌患者。
[0307] 表 3
[0308] 肝癌的临床信息
[0310]通过比较健康的人和心肌梗塞患者的血清实验方案来决定以特异方式存在于心 肌梗塞患者的点，将生物素(biotin)附着于与上述点相对应的单链核酸，并与链霉亲和素 (strep tavidin)进行反应之后，对与血清生物试样进行反应，并分离复合物，之后分离通过 电泳生成的带，从而鉴定生物分子的过程的顺序的流程图为图11。通过分离与所选定的单 链核酸相结合的蛋白质来利用串联飞行时间质谱仪(MALDI-T0F-T0F)设备决定蛋白质的氨 基酸序列的图为图12。
[0311]通过利用附着有单链核酸的本发明的核酸芯片，在特定的生物试样中，探索及分 析了生物分子的实验方案，上述单链核酸基于与通过上述方法来构成生物试样的生物分子 相结合。。
[0312] 并且，通过生产在医学方面有用的生物试样的生物分子，来制备数据库之后，生产 特定的人的血清实验方案，并通过利用人工神经网络算法制备的程序，来检查是否具有心 血管疾病及其种类，是否具有肝癌发病及转移性程度。
[0313] 提高对由不同疾病组组成的数据库进行比较分析，来决定有用的点，并调剂与此 相应的单链核酸来分离相应的蛋白质并进行了鉴定。
[0314] 实施例10.细胞株的表面生物分子的实验方案的生成及应用
[0315] 10-1.生物芯片(核酸芯片）的制备
[0316] 在本发明中，由两种或两种以上的生物分子组成的生物试样为细胞株的例示。
[0317] 通过上述实施例2至实施例4的方法，制备了用于生产作为生物试样的非小细胞肺 癌细胞株的表面生物分子的实验方案的本发明的生物芯片。使准备的随机单链核酸与肺癌 细胞株发生反应之后，使用洗涤缓冲液来清洗细胞株(生物分子)_单链核酸复合物，根据非 结合单链核酸及结合程度，使单链核酸解离之后，反复处理以5000xg离心分离的过程，之后 通过离心分离方法分离细胞株-单链核酸复合物，制备与非小细胞肺癌细胞株的表面生物 分子相结合的单链核酸。
[0318] 从上述制备的单链核酸选定克隆，来决定并分析碱基序列，选定1000单链核酸。合 成由通过实施例2的方法选定的1000单链核酸的互补的碱基序列组成的捕获探针，并使捕 获探针附着于固体载体上，从而制备了本发明的核酸芯片。
[0319] 10-2.细胞株的表面生物分子实验方案生成
[0320] 利用以上述实施例4的方法制备的核酸芯片，来生产了小细胞肺癌细胞株(SCLC) 的表面分子的实验方案。使小细胞肺癌细胞株与单链核酸池发生反应之后，清洗及分离细 胞株(生物试样)的生物分子-单链核酸复合物。通过实施例3的方法扩增及标记与上述复合 物相结合的单链核酸。通过实施例4的方法使捕获探针与标记的靶探针发生反应。通过实施 例5的方法执行标记于上述靶探针的物质的测定，并确认了非小细胞肺癌细胞株的表面生 物分子的实验方案。
[0321] 通过选定推定为与小细胞肺癌细胞株(SCLC，Small Cell Lung Cancer)强力结合 的单链核酸，来合成附着有异硫氰酸焚光素(FITC，Fluorescein isothiocyanate isomer I)的单链核酸，从而在与小细胞肺癌细胞株、非小细胞肺癌细胞株(NSCLC，Non Small Cell Lung Cancer)、血癌细胞株(MRC-5及THP-1)发生反应之后进行荧光拍摄的图像如图13所 不。
[0322] 像这样，能够分析利用本发明的核酸芯片来生产的小细胞肺癌细胞株实验方案， 来确认所选定的单链核酸与小细胞肺癌细胞株相结合。
[0323] 实施例11.大肠菌的表面生物分子的实验方案的生成及应用
[0324] 11-1.生物芯片（核酸芯片）的制备
[0325] 通过作为生物试样的大肠菌KCTC12006和上述实施例2至实施例4的方法，来制备 了本发明的核酸芯片。使准备的单链核酸与大肠菌发生反应之后，使用洗涤缓冲液来清洗 大肠菌(生物分子)_单链核酸复合物，根据非结合单链核酸及结合程度，使单链核酸解离之 后，反复处理以5000xg离心分离的过程，之后通过离心分离方法分离大肠菌-单链核酸复合 物，制备了与大肠菌的表面生物分子相结合的单链核酸。
[0326] 从上述制备的单链核酸选定克隆，来决定并分析碱基序列，从而选定了 1000单链 核酸。通过所选定的1000单链核酸的互补的碱基序列来合成捕获探针，并使捕获探针附着 于固体载体上，从而制备了本发明的核酸芯片。
[0327] 11-2.大肠菌的表面生物分子实验方案的生成
[0328] 在本发明中，由两种或两种以上的生物分子组成的生物试样为细菌的例示。
[0329] 利用通过上述实施例6的方法来制备的核酸芯片，生产出大肠菌KCTC12006的表面 分子的实验方案。
[0330] 使大肠菌与单链核酸池发生反应之后，清洗及分离大肠菌-靶单链核酸复合物。通 过实施例3的方法扩增及标记与上述复合物相结合的单链核酸。通过实施例4的方法使捕获 探针与标记的靶探针发生反应。通过实施例5的方法执行上述标记于靶单链核酸的物质的 测定，并确认大肠菌的表面生物分子的实验方案。
[0331] 以与生产大肠菌KCTC12006的表面生物分子实验方案相同的方法来生产鼠伤寒沙 门氏杆菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)的表面生物分子实验方案，从而在构建数 据库之后，基于层次聚类方法，选定特异性地与大肠菌相结合的单链核酸。通过表面等离子 共振装备（SPR，Surface Plasmon Resonance) (BIAcore公司）测定上述单链核酸的特殊性 的结果为如图14所示，并确认了所选定的单链核酸与沙门氏菌相比，更加特异性地与大肠 菌相结合。
[0332] 作为利用与大肠菌相结合的单链核酸及纳米金粒子来测定大肠菌的方法(例，参 照韩国特许申请编号10-2006-0072480)利用从上述选定的单链核酸来测定溶液中是否具 有大肠菌及食物中的大肠菌的污染程度的结果如图15所示。确认了使单链核酸与清洗食物 的指数富集配基系统进化缓冲液发生反应，并在加入纳米金粒子之后添加 NaCl溶液，而没 有大肠菌的溶液为透明的接近无色的蓝色，被大肠菌污染的溶液变为红色，其程度与被污 染的大肠菌数成正比。
[0333]到目前为止，以优选的实施例为中心对本发明进行了观察。本发明所属技术领域 的普通技术人员能够理解在不脱离本发明的本质特性的范围内能够以变形的形态体现。因 此，本发明中公开的实施例应在说明的观点进行考虑，而非限定的观点。要解释的是，本发 明的范围呈现于并非上述说明的发明要求保护范围，而与发明要求包含范围等同的范围内 的所有不同点包括在本发明中。
【主权项】
1. 一种利用基准物质的生物芯片的制备方法，其特征在于，包括： 选择以质量控制为目的的物质，并将上述物质决定为基准物质的步骤； 决定能够与由两种或两种以上的生物分子组成的生物试样中包含的生物分子和/或上 述基准物质相结合的配体的步骤； 使用被决定的配体的信息来合成捕获探针，并将合成的捕获探针固定于基板的步骤； 以及 使用用于选定对生物分子的生物学意义进行分析的配体的基准物质以及从分析对象 的生物试样中包含的生物分子准备的靶探针，来从上述生物试样中收集生物分子与配体之 间的结合信息的步骤。2. 根据权利要求1所述的利用基准物质的生物芯片的制备方法，其特征在于，上述物质 不包含在所要分析的生物试样中。3. 根据权利要求1所述的利用基准物质的生物芯片的制备方法，其特征在于，能够与上 述生物试样中包含的生物分子及基准物质相结合的配体选自由抗体、肽、单链核酸及适配 体组成的组中。4. 根据权利要求1所述的利用基准物质的生物芯片的制备方法，其特征在于，决定能够 与生物试样中包含的生物分子相结合的生物分子结合配体的步骤包括： 使随机单链核酸与生物分子发生反应，来制备生物分子-单链核酸复合物的步骤； 清洗上述生物分子-单链核酸复合物，并测定上述生物分子与上述单链核酸间的结合 力的大小来选择具有规定结合力以上的生物分子-单链核酸复合物的步骤； 从所选择的上述生物分子-单链核酸复合物中分离并扩增单链核酸的步骤；以及 决定所扩增的单链核酸的碱基序列，来决定上述生物分子结合单链核酸的步骤。5. 根据权利要求1所述的利用基准物质的生物芯片的制备方法，其特征在于，选定分析 生物分子的生物学意义的配体的步骤包括： 使生物试样和生物分子结合单链核酸发生反应，来形成生物分子-单链核酸复合物，并 分离上述复合物的步骤； 在所分离的生物分子-单链核酸复合物中扩增及标记上述单链核酸，来制备分析靶探 针的步骤；以及 将所标记的分析靶探针作为靶探针，来从生物芯片中获得捕获探针的结合实验方案的 步骤。6. 根据权利要求1所述的利用基准物质的生物芯片的制备方法，其特征在于，合成上述 捕获探针的步骤中，合成选自由与生物分子结合单链核酸、上述基准物质相结合的单链核 酸的碱基序列及它们的互补的碱基序列组成的组中的碱基序列。7. 根据权利要求1所述的利用基准物质的生物芯片的制备方法，其特征在于，包括： 上述靶探针从分别以不同的量添加组成基准物质的外源分子的生物试样中准备分析 靶探针，或者准备分别以不同的量添加与相应于组成上述基准物质的外源分子的捕获探针 相结合的分析标记靶探针的分析靶探针的步骤;以及 向上述分析靶探针添加与上述捕获探针相结合的比较靶探针，来准备上述靶探针的步 骤。8. -种生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，包括： 准备生物芯片的步骤，上述生物芯片是使用与生物试样中所含有的生物分子相结合的 配体及与组成基准物质的分子相结合的配体的信息来合成的捕获探针固定于基板而成的； 获得以生物试样为对象，利用从与生物分子相结合的配体、与组成基准物质的外源分 子相结合的配体制备的靶探针及生物芯片来分析的结合实验方案的步骤;以及 比较所获得的结合信息和已确保的结合信息数据，来分析未知的生物分子的生物学意 义的步骤。9. 根据权利要求8所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，上述生物试样 选自由细菌、真菌类、病毒、细胞株及组织组成的组中，上述生物分子为选自由蛋白质、碳水 化合物、脂质、多糖体、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体及酶组成的组中的一种以上。10. -种生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，使用质量控制基准物质，并通 过核酸分析方法分析质量控制单链核酸，来进行内部质量控制，上述质量控制基准物质用 于在包含由随机碱基序列组成的单链核酸的核酸库中选定与由两种或两种以上的生物分 子组成的生物试样中的生物分子相结合的结合单链核酸及分析单链核酸。11. 根据权利要求10所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，上述质量控 制基准物质为不包含于所要分析的生物试样中的生物分子。12. 根据权利要求11所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于， 包括： 从上述基准物质制备质量控制单链核酸的步骤， 从上述生物试样中的生物分子制备结合单链核酸的步骤，以及 使用上述质量控制单链核酸及上述结合单链核酸的碱基序列，来制备固定有合成的捕 获探针的载体的步骤； 用于选定分析生物分子的生物学意义的上述分析单链核酸的生物试样、基准物质、结 合单链核酸、质量控制单链核酸及核酸芯片使用于生成上述生物分子和上述结合单链核酸 的结合实验方案。13. 根据权利要求12所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，制备上述结 合单链核酸的方法包括： 使由生物试样中的生物分子及上述基准物质组成的试样与具有上述随机碱基序列的 单链核酸发生反应，来选择生物分子-单链核酸复合物的步骤； 从上述生物分子-单链核酸复合物分离及扩增单链核酸，来制备单链核酸脱氧核糖核 酸的步骤;以及 通过决定上述单链核酸脱氧核糖核酸的碱基序列，来制备上述结合单链核酸的步骤。14. 根据权利要求13所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，在选择上述 生物分子-单链核酸复合物的方法中，清洗反应溶液中的生物分子-单链核酸复合物，并测 定上述生物分子与上述单链核酸间的结合力，来选择规定结合力以上的生物分子-单链核 酸复合物。15. 根据权利要求14所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，在选择上述 生物分子-单链核酸复合物的方法中，对上述反应溶液进行毛细管电泳处理，来选择生物分 子-单链核酸复合物，或者用上述反应溶液来对由硝酸纤维素及尼龙组成的结构体进行处 理，来选择生物分子-单链核酸复合物。16. 根据权利要求12所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，固定有上述 捕获探针的载体选自由载玻片、生物传感器的检测表面、微珠及纳米粒子组成的组中。17. 根据权利要求12所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，上述捕获探 针由选自结合单链核酸的碱基序列、质量控制单链核酸的碱基序列及它们的互补的碱基序 列中的至少一种碱基序列合成。18. 根据权利要求12所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，生成上述生 物试样中的生物分子和结合单链核酸的结合实验方案的方法包括： 从上述基准物质、生物试样、质量控制单链核酸及结合单链核酸制备具有标记物质的 分析靶探针的步骤； 混合及扩增与捕获探针相应的上述结合单链核酸及上述质量控制单链核酸，来制备具 有标记物质的比较靶探针的步骤； 混合上述分析靶探针和上述比较靶探针，来制备靶探针的步骤；以及 使上述靶探针和载体上的捕获探针发生杂交反应，来获得结合实验方案的步骤。19. 根据权利要求18所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，制备上述分 析革El探针的步骤包括： 准备向生物试样添加分别以不同的量包含基准物质的基准物质I的分析试样的步骤； 分离使上述分析试样和由结合单链核酸及上述质量控制单链核酸组成的单链核酸发 生反应来所生成的生物分子-单链核酸复合物及基准物质-单链核酸复合物的步骤;以及 从上述生物分子-单链核酸复合物及基准物质-单链核酸复合物中分离、扩增及标记单 链核酸，来制备分析靶探针的步骤。20. 根据权利要求18所述的生物分子分析单链核酸选定方法，其特征在于，制备上述分 析靶探针的方法包括： 从使生物试样和结合单链核酸发生反应来所生成的生物分子-单链核酸复合物中分离 单链核酸的步骤;以及 混合所分离的单链核酸和分别以不同的量组成质量控制单链核酸的基准物质II，来以 扩增及标记方式制备上述分析靶探针的步骤。21. -种利用基准物质的生物芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以由两种 或两种以上的生物分子组成的生物试样为对象，使用基准物质来将两种或两种以上的生物 分子分析为上述分析单链核酸。22. -种生物分子分析方法，其特征在于，包括如下步骤:使用用于通过使用分析单链 核酸来分析生物试样中的生物分子的质量控制基准物质，并通过核酸分析方法来分析上述 质量控制单链核酸，从而进行内部质量控制。23. 根据权利要求22所述的生物分子分析方法，其特征在于，通过使用上述分析单链核 酸来分析上述生物试样中的生物分子的步骤通过核酸分析方法来执行。24. 根据权利要求22所述的生物分子分析方法，其特征在于，上述质量控制基准物质为 不包含在所要分析的生物试样中的生物分子。25. 根据权利要求22所述的生物分子分析方法，其特征在于，包括： 将使用分析单链核酸及上述质量控制单链核酸的碱基序列来合成的捕获探针固定于 载体的步骤； 从基准物质、生物试样、质量控制单链核酸及分析单链核酸制备具有标记物质的靶探 针的步骤； 使上述靶探针和载体上的捕获探针发生杂交反应，来获得结合信息的步骤；以及 比较所获得的上述结合信息和已确保的结合信息数据，来分析上述生物分子的生物学 意义的步骤。26. 根据权利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，制备上述靶探针的步骤包 括： 从上述基准物质、生物试样、质量控制单链核酸及分析单链核酸制备具有标记物质的 分析靶探针的步骤； 混合及扩增与上述捕获探针相应的上述分析单链核酸及上述质量控制单链核酸，来制 备具有标记物质的比较靶探针的步骤;以及 制备由上述分析靶探针及上述比较靶探针组成的靶探针的步骤。27. 根据权利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，固定有上述捕获探针的载 体包括载玻片、生物传感器的检测表面、微珠、纳米粒子等。28. 根据权利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，上述捕获探针由与分析单 链核酸及上述质量控制单链核酸的碱基序列完全互补结合的碱基序列组成。29. 根据权利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，使用如下引物，上述引物 具有标记物质、并由具有包含上述复合物中所含有的上述分析单链核酸及上述质量控制单 链核酸的特定碱基序列的区域和分别指示它们的碱基序列区域的标记组成，用于标记及扩 增从上述生物分子-单链核酸复合物和上述基准物质-单链核酸复合物中分离的分析单链 核酸。30. 根据权利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，制备上述分析靶探针的方 法包括： 向生物试样添加分别以不同的量组成上述基准物质的基准物质I，来准备分析试样的 步骤； 分离使准备的分析试样和由上述分析单链核酸及上述质量控制单链核酸组成的单链 核酸发生反应来所形成的生物分子-单链核酸复合物及基准物质-单链核酸复合物的步骤； 以及 分离、扩增及标记分离的上述生物分子-单链核酸复合物及基准物质-单链核酸复合物 中的上述分析单链核酸，来准备分析靶探针的步骤。31. 根据权利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，准备上述分析靶探针的方 法包括： 分离使上述生物试样和上述分析单链核酸发生反应来生成的生物分子-单链核酸复合 物的步骤;以及 将分别以不同的量含有质量控制单链核酸的基准物质II混合、扩增及标记于从分离的 上述生物分子-单链核酸复合物中分离的分析单链核酸，来制备所标记的上述分析靶探针 的步骤。32. 根据权利要求31所述的生物分子分析方法，其特征在于，在分离上述生物分子-单 链核酸复合物的方法中，对上述反应溶液进行毛细管电泳处理，来选择生物分子-单链核酸 复合物，或者用上述反应溶液来对由硝酸纤维素及尼龙组成的结构体进行处理，来选择生 物分子-单链核酸复合物。33. 根据权利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，上述标记物质使用选自由 生物素、Cy2、绿色荧光蛋白、YO-PRO-I、YOYO-I、钙黄绿素、异硫氰酸荧光素、FlourX、 ALEXA488、罗丹明110、ABI 5-FAM、俄勒冈绿500、俄勒冈绿488、RiboGreen、罗丹明绿、罗丹 明 123、镁绿、钙绿、T0-PR0-1、T0T0-1、ABI J0E、氟硼二吡咯530/550、Dil、氟硼二吡咯TMR、 氟硼二吡咯558/568、氟硼二吡咯564/570、Alexa546、四甲基异硫氰酸罗丹明、镁橙、藻红蛋 白R&B、罗丹明标记鬼笔环肽、钙橙、派洛宁Y、罗丹明B、ABI TAMRA、玫瑰红、Cy3.5、ABI ROX、 钙红、Alexa594、德克萨斯红、尼罗红、Y0-PR0-3、Y0Y0-3、红藻蓝素、C-藻蓝素、T0PR0-3、 T0T0-3、DiD DilC(5)、氧杂羰花青、Cy5.5、Cy5及Cy3组成的组中的荧光染料。34. 根据权利要求22所述的生物分子分析方法，其特征在于，还包括： 接收通过生物分子分析方法来生产的患者组的上述生物分子和分析单链核酸的结合 信息及对照组的生物分子和分析单链核酸的结合信息数据，并构建数据库的步骤，上述生 物分子分析方法包含使用用于通过使用分析单链核酸来分析生物试样中的生物分子的质 量控制基准物质，并通过核酸分析方法来分析上述质量控制单链核酸，从而进行内部质量 控制的步骤； 利用所输入的结合信息数据，来在分析系统中执行预处理的步骤； 借助预处理的结果来生成患者模型的步骤； 加载所生成的模型并适用在入院的患者来执行盲测诊断的步骤；以及 通过交叉验证评价系统的性能的步骤。35. 根据权利要求34所述的生物分子分析方法，其特征在于，生成上述患者模型的方法 选自由线性模型、支持向量机、神经网络、分类回归树、集成学习法、判别分析、最邻近法、贝 叶斯网络及独立成分分析构成的组中。36. -种生物分子分析装置，其特征在于，包括准备生物试样中的生物分子的试样处理 装置以及由制备生物分子-单链核酸复合物并分析上述复合物的单链核酸的模块构成的核 酸分析装置。37. 根据权利要求36所述的生物分子分析装置，其特征在于，上述生物分子分析装置还 包括： 接收所输入的患者组的上述生物分子和分析单链核酸的结合信息及对照组的生物分 子和分析单链核酸的结合信息数据，并构建数据库的模块； 利用所输入的结合信息数据，来在分析系统中执行预处理的模块； 借助预处理的结果来生成患者模型的模块； 加载所生成的模型并适用入院患者来执行盲测诊断的模块；以及 通过交叉验证评价系统的性能的模块。38. 根据权利要求37所述的生物分子分析装置，其特征在于，生成上述患者模型的方法 选自由线性模型、支持向量机、神经网络、分类回归树、集成学习法、判别分析、最邻近法、贝 叶斯网络及独立成分分析构成的组中。39. 根据权利要求36所述的生物分子分析装置，其特征在于，上述生物试样选自由细 菌、真菌类、病毒、细胞株及组织组成的组中，上述生物分子为选自由蛋白质、碳水化合物、 脂质、多糖体、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体及酶组成的组中的一种以上。40. 根据权利要求37所述的生物分子分析装置，其特征在于，还包括利用所生成的患者 模型来第一次确认患者的疾病的步骤、连续确认患者的疾病进展的步骤以及确认预后及药 物反应性的步骤。41. 根据权利要求40所述的生物分子分析装置，其特征在于，上述患者模型为肝癌患者 模型，上述疾病为肝癌，确认上述疾病进展的步骤用于确认转移状态。42. -种生物分子分析方法，其特征在于，包括： 以由两种或两种以上的生物分子组成的生物试样为对象，使生物分子分析单链核酸和 两种或两种以上的生物分子发生反应，来形成生物分子-单链核酸复合物的步骤； 对上述反应溶液进行毛细管电泳处理，来选择生物分子-单链核酸复合物，或者用上述 反应溶液来对由硝酸纤维素及尼龙组成的结构体进行处理，来选择生物分子-单链核酸复 合物的步骤；以及 通过核酸分析技术分析所选择的上述生物分子-单链核酸复合物的上述分析单链核酸 的步骤。43. -种生物分子分析方法，其特征在于，还包括： 接收所输入的通过生物分子分析方法生产的患者组的上述生物分子和分析单链核酸 的结合信息及对照组的生物分子和分析单链核酸的结合信息数据，并构建数据库的步骤， 上述生物分子分析方法包含使用用于通过使用分析单链核酸来分析生物试样中的生物分 子的质量控制基准物质，并通过核酸分析方法分析上述质量控制单链核酸，从而进行内部 质量控制的步骤； 利用所输入的结合信息数据，来在分析系统中执行预处理的步骤； 借助预处理的结果来生成患者模型的步骤； 加载所生成的模型并适用在入院的患者来执行盲测诊断的步骤；以及 通过交叉验证评价系统的性能的步骤。44. 根据权利要求43所述的生物分子分析方法，其特征在于，还包括： 利用所生成的患者模型来第一次确认患者的疾病的步骤；以及 连续确认患者的疾病进展、预后及药物反应性的步骤。45. 根据权利要求44所述的生物分子分析方法，其特征在于，上述患者模型为肝癌患者 模型，上述疾病为肝癌，确认上述疾病进展的步骤用于确认转移状态。
【文档编号】C12Q1/68GK105960644SQ201480070233
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年5月8日
【发明人】金圣千
【申请人】金圣千