基于金纳米粒子-巯基化石墨烯修饰电极的电化学dna生物传感器的构建及应用
【专利摘要】本发明公开了一种基于金纳米粒子?巯基化石墨烯修饰电极的电化学DNA生物传感器的构建及应用。以离子液体修饰碳糊电极(CILE)作为基底电极，将金纳米粒子电沉积在其表面，利用巯基石墨烯(TGR)与纳米金(Au)之间形成Au?S键，将TGR固定到纳米金修饰电极表面，在形成的TGR自组装膜上恒电位吸附探针ssDNA序列，从而构建出一种电化学DNA生物传感器。以亚甲基蓝(MB)作为电化学信号指示剂，来检测DNA分子杂交反应前后电化学信号的差异。通过电化学交流阻抗法(EIS)和示差脉冲伏安法(DPV)等电化学技术手段，对所构建的电化学DNA生物传感器进行电化学性能检测。
【专利说明】
基于金纳米粒子-巯基化石墨烯修饰电极的电化学DNA生物传感器的构建及应用
技术领域
[0001]本发明涉及电化学及生物传感器领域。具体为一种电化学DNA生物传感器的构建方法及其对金黄色葡萄球菌特征序列的检测。通过对电化学交流阻抗(EIS)、循环伏安法(CV)和示差脉冲伏安法(DPV)等电化学技术的响应信号分析来表明此传感器的相关测试性會K。
【背景技术】
[0002]电化学与生物传感器的发展是目前分析化学研究中最活跃的领域之一。电化学生物传感器是以固定化的生物活性材料(包括核酸、酶、微生物、抗体、细胞等)为敏感元件，以电化学换能器即电化学电极为信号转换器，以电势或电流等为特征检测信号的生物传感器。电化学DNA生物传感器是生物传感器的一种，它以DNA分子杂交反应为特异性识别手段，开辟了分子生物学与电化学分析等学科的研究新领域，为生命科学的研究提供了新技术和新方法，对临床医学以及遗传工程的研究具有深远的意义。
[0003]纳米材料因表现出小尺寸效应、大的比表面积、优良的导电能力、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应等物质的超常规特性等，在生物传感器方面得到了广泛应用。例如，可以利用纳米粒子大的比表面积来固定生物分子，或者利用纳米材料修饰电极来加速酶和电极之间的电子传递速率等。
[0004]金纳米粒子由于良好的生物相容性和导电性，近年来广泛应用于生物分析化学，在生物分子标记和检测、纳米生物传感器和纳米生物芯片等技术的开发和应用方面应用广泛。
[0005]石墨烯具有独特的平面结构和优良的物化性质，成为研究热点。石墨烯片层之间易于通过较强的范德华力连接在一起，若没有外在保护剂的存在下，石墨烯片层之间很容易发生团聚使其难以分散在常见溶剂中。因此需要对石墨烯纳米片进行功能化修饰，进而提高其在溶剂中的分散性和稳定性，有效调控其性能与结构，从而实现更为丰富的功能与应用。例如，羟基、羧基等功能化基团不仅非常有利于金属离子的吸收和聚集，而且为功能化改性提供了更多的活性位点。
【发明内容】
[0006]本发明开发了一种新型基于金纳米粒子-巯基化石墨稀修饰电极的电化学DNA生物传感器构建及其应用。该传感器由导电性能良好的电极界面和固定在电极界面上的一种特征基因片段构成，以亚甲基蓝(MB)为电化学杂交指示剂，表现出良好的选择性、灵敏性和稳定性。另外该传感器制备工艺简单，适用性好，便于推广使用。本发明中电化学DNA生物传感器的构建方法和应用如下所述。
[0007]1.基于金纳米粒子-巯基化石墨稀修饰电极的电化学DNA生物传感器的构建，包括以下步骤: (1)金纳米粒子修饰电极的制备:
将离子液体修饰碳糊电极(CILE)作为基底电极，在含有氯金酸的溶液中于-0.4 V恒电位沉积300 S，即可得到纳米金修饰电极(Au/CILE)，取出后用二次蒸馏水冲洗晾干后备用；
(2)疏基化石墨稀修饰电极的制备:
将上述制得的Au/CILE电极浸泡在TGR分散液中自组装5 h，即可在纳米Au表面自组装修饰上一层TGR膜，该修饰电极记作TGR/Au/CILE，取出后用二次蒸馏水冲洗晾干后待用；
(3)探针ssDNA的固定及与目标ssDNA的杂交:
采用恒电位吸附的方法将探针s sDNA序列固定在TGR/Au/C ILE的表面，然后分别用5%SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，记作ssDNA/TGR/Au/CILE ；
采用滴涂的方法将目标ssDNA序列溶液滴加在电极表面，使目标ssDNA序列与探针ssDNA序列在室温下发生分子杂交反应20 min，随后用5% SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，杂交后的电极记作dsDNA/TGR/Au/CILE ；
所述电化学DNA生物传感器的构建，步骤(I)中的溶液为含有5.0 mmol/L HAuCl4和0.5mo I/L KNO3的混合溶液；
所述电化学DNA生物传感器的构建，步骤(2)中的TGR分散液浓度为1.0 mg/mL；
所述电化学DNA生物传感器的构建，步骤(3)中探针ssDNA序列的溶液为含有1.0 X 10—611101/1探针序列的50.0 mmol/L pH 7.0 PBS缓冲溶液，吸附电位和时间为+0.5 V和200 S。目标DNA序列溶液的用量和浓度分别为10 uL和1.0X 10—6 mol/L；
所述电化学DNA生物传感器的构建，使用电化学交流阻抗(EIS)技术检测修饰电极表面的电化学信号响应；
所述电化学DNA生物传感器的构建，其中EIS技术所用的电解质溶液为10.0 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0.1 mol/L KCl的混合液。
[0008]2.基于金纳米粒子-巯基化石墨稀修饰电极的电化学DNA生物传感器的应用，其特征在于对金黄色葡萄球菌特征序列的检测。以亚甲基蓝(MB)作为电化学指示剂，研究了所构建电化学DNA生物传感器的灵敏度和及其对PCR扩增样品的检测。
[0009]所述电化学DNA生物传感器的应用，电化学指示剂MB的浓度和吸附时间分别为4.0ΧΙΟ—5 mol/L和8 min。
【附图说明】
[0010]图1为不同修饰电极(a到e分别为TGR/Au/CILE,Au/CILE, ssDNA/TGR/Au/CILE，(180嫩八61?/^11/(:11^和(:11^)在10.0 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的交流阻抗曲线。
[0011]图2为MB在不同ssDNA序列杂交情况电极上的DPV曲线。a到e分别为与目标ssDNA序列杂交后、与单碱基错配序列杂交后、与三碱基错配序列杂交后、与非互补序列杂交后、杂交前的DPV曲线。
[0012]图3为ssDNA/TGR/Au/CILE与不同浓度的目标序列杂交后MB的DPV曲线。a到k的目标序列浓度依次为I.0Χ 10—6，1.0X10—7，1.0X10—8，1.0X10—9，1.0X10—1Q，1.0X10—n, 1.0X10—12，1.0X10—13，1.0X10—14，1.0X10—15，O mol/L，(内嵌图为MB的还原峰电流与目标ssDNA序列浓度间的线性关系)。
[0013]图4为MB在TGR/Au/CILE (a)，与基因序列的PCR产物杂交后(b)和在ssDNA/TGR/Au/CILE (c)上的DPV曲线图。
【具体实施方式】
[0014]下面给出的实施例对本发明作进一步说明，但不超出本发明保护范围的限制。
[0015]实施例1
1.修饰电极的制备
(1)离子液体修饰碳糊电极(ClLE)的制备
按一定的比例将石墨粉和离子液体充分混合研磨后，装入内插细铜丝的玻璃电极管内压实，即得离子液体修饰碳糊电极(CILE)，使用前在抛光纸上打磨至镜面；
(2)纳米材料修饰电极的制备
将CILE置于5.0 mmol/L HAuCl4和0.5 mol/L KNO3混合溶液中在_0.4 V恒电位下沉积300 S，取出后用二次蒸馏水冲洗，室温晾干后得Au/CILE;
将Au/CILE浸泡在1.0 mg/mL的TGR溶液中，利用巯基石墨烯上的巯基与电极表面的纳米金发生自组装作用，5小时后取出即得TGR/Au/CILE，用二次蒸馏水冲洗晾干后待用；
(3)电化学DNA生物传感器的制备
采用电化学吸附的方法将TGR/Au/CILE浸入含有1.0X 10—6 mol/L探针ssDNA序列的50.0 mmol/L pH 7.0 PBS缓冲溶液中，+0.5 V下恒电位吸附200 s，即可将探针ssDNA固定在修饰电极表面，记为ssDNA/TGR/Au/CILE。取出后分别用5% SDS和二次蒸馏水冲洗，然后将10 pL 1.0X10—6 mol/L目标ssDNA序列滴涂在电极表面，室温下杂交20 min后得到dsDNA/TGR/Au/CILE，分别用5% SDS和二次蒸馏水冲洗。
[0016]实例2
不同修饰电极的电化学行为
使用电化学交流阻抗谱(EIS)表征了电极的修饰过程。图1为不同修饰电极在10.0mmol/L K3[Fe (CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的电化学交流阻抗图谱，从a到e分别为TGR/Au/CILE, Au/CILE, ssDNA/TGR/Au/CILE，dsDNA/TGR/Au/CILE和CILE的阻抗谱。可以看出CILE (曲线e)的交流阻抗值最大；当在电极表面修饰纳米金后阻抗值明显降低(曲线b)，这是由于纳米金具有高的金属导电性;进一步自组装TGR后阻抗值进一步降低到最小值(曲线a)，说明巯基化石墨烯被成功组装于Au/CILE表面，其高导电性进一步降低了界面电阻值;在ssDNA/TGR/Au/CILE (曲线c)上电阻值增大，说明ssDNA被固定于电极表面，其带负电结构会阻碍[Fe(CN)6]3V4—向电极表面扩散;而在dsDNA/TGR/Au/CILE (曲线d)上电阻值进一步增大，说明分子杂交反应在电极表面生成了dsDNA，其存在阻碍了 [Fe(CN)6]3—/4—的电极反应。
[0017]实例3
电化学DNA生物传感器的选择性
通过探针ssDNA序列与不同错配序列的杂交检测来研究所构建的电化学DNA生物传感器的选择性。图2是4.0X 10—5 mol/L MB在探针ssDNA与1.0 X 10—6 mol/L不同ssDNA序列杂交后的DPV曲线。在ssDNA/TGR/Au/CILE上MB的电流响应最大(曲线e)，这是由于探针序列是通过恒电位吸附固定在电极表面，探针ssDNA序列随意的平躺在电极表面，因此MB很容易与ssDNA中的G碱基结合。当与完全互补的目标ssDNA序列杂交后电流急剧降低(曲线a)，这是由于电极表面的ssDNA通过碱基互补配对作用形成了 dsDNA，G碱基被包裹在了 dsDNA的双螺旋结构内部，使其难以与MB分子相互结合，MB在电极表面的的富集量变少，进而电流值明显降低。当与不同错配ssDNA序列杂交后，电流值逐渐降低，这是由于在电极表面生成的dsDNA的量逐渐增大，相应的MB的富集量降低，对应的电流值也降低。说明构建的电化学DNA生物传感器对目标ssDNA序列检测具有良好的选择性。
[0018]实例4
电化学DNA生物传感器的灵敏度
在最佳实验条件下将构建的电化学DNA生物传感器与不同浓度金黄色葡萄球菌特征基因目标ssDNA序列片段进行了杂交，并记录MB的还原峰电流，结果如图4所示。随着目标序列浓度的增大，MB的峰电流逐渐减小。当浓度增加至Ijl.0X 10—6 mol/L时，MB的峰电流趋于稳定保持不变，说明固定在电极表面的探针序列全部参加了反应。当目标序列浓度在1.0X 10—15mol/L到1.0 X 10—6 mol/L范围时，MB还原峰电流在杂交前后的差值和目标ssDNA序列浓度的对数呈现良好的线性关系，线性回归方程为A Ip (μΑ)=-5.33 log C-28.71 (γ =0.992)，检测限为4.55X10—16 mol/L。说明该传感器具有良好的灵敏度，并表现出较宽的检测范围和较低的检测限。
[0019]实例5
金黄色葡萄球菌特征基因序列的PCR扩增产物的检测
金黄色葡萄球菌基因序列的PCR扩展模板从变质的猪肉中提取，使用所建立的方法对PCR扩增产物进行检测。将扩增产物用50.0 mmol/L (pH 7.0) PBS缓冲溶液稀释10倍后，沸水浴10 min后迅速置于冰水浴中2 min进行解旋，所得到的溶液为样品溶液，用于杂交和电化学检测，其结果如图4所示。MB在ssDNA/TGR/Au/CILE(曲线c)上比未固定探针序列的TGR/Au/CILE(曲线a)信号有明显增大，这是由于ssDNA上的G碱基与MB相互作用增大了MB在电极表面的浓度。在与变性后的金黄色葡萄球菌PCR扩增产物杂交后(曲线b)MB的电流响应明显降低，说明PCR样品溶液中存在着目标ssDNA序列并且发生了杂交反应生成了 dsDNA，阻碍了MB与G碱基的相互作用，使MB的富集量大为降低。表明构建的电化学DNA生物传感器能够对猪肉实际样品中的金黄色葡萄球菌基因序列的PCR扩增产物进行有效的检测。
【主权项】
1.基于金纳米粒子-巯基化石墨稀修饰电极的电化学DNA生物传感器的构建，其特征在于所述构建方法包括以下步骤: (1)金纳米粒子修饰电极的制备: 将离子液体修饰碳糊电极(CILE)作为基底电极，在含有氯金酸的溶液中于-0.4 V恒电位沉积300 S，即可得到纳米金修饰电极(Au/CILE)，取出后用二次蒸馏水冲洗晾干后备用； (2)疏基化石墨稀修饰电极的制备: 将上述制得的Au/CILE电极浸泡在巯基化石墨烯(TGR)分散液中自组装5 h，即可在纳米金表面自组装修饰上一层巯基化石墨稀膜，该修饰电极记作TGR/Au/CILE，取出后用二次蒸馏水冲洗晾干后备用； (3)探针ssDNA的固定及与目标ssDNA的杂交: 采用恒电位吸附的方法将探针s sDNA序列固定在TGR/Au/C ILE的表面，然后分别用5%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液和二次蒸馏水冲洗，记作ssDNA/TGR/Au/CILE; 采用滴涂的方法将目标ssDNA序列溶液滴加在电极表面，使目标ssDNA序列与探针ssDNA序列在室温下发生分子杂交反应20 min，随后用5% SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，杂交后的电极记作dsDNA/TGR/Au/CILE。2.根据权利要求1所述的构建方法，步骤(I)中的溶液为含有5.0mmol/L HAuCl4和0.5mo I/L KNO3的混合溶液。3.根据权利要求1所述的构建方法，步骤(2)中的TGR分散液浓度为1.0mg/mL。4.根据权利要求1所述的构建方法，步骤(3)中探针ssDNA序列溶液为含有1.0 X 10一611101/1探针序列的50.0 mmol/L pH 7.0 PBS缓冲溶液，吸附电位和时间为+0.5 V和200 s’目标ssDNA序列溶液的用量和浓度分别为10 uL和1.0X 10—6 mol/L。5.根据权利要求1所述的构建方法，使用电化学交流阻抗(EIS)技术检测修饰电极表面的电化学信号响应。6.根据权利要求5所述的EIS技术，电解质溶液为10.0mmol/L K3[Fe (CN)6]和0.1mol/L KCl的混合液。7.基于金纳米粒子-巯基化石墨稀修饰电极的电化学DNA生物传感器的应用，其特征在于对金黄色葡萄球菌特征序列的检测，以亚甲基蓝(MB)作为电化学指示剂，研究了所构建电化学DNA生物传感器的灵敏度及其对PCR扩增样品的检测。8.根据权利要求7所述的电化学指示剂MB，其浓度和吸附时间分别为4.0X10—5 mol/L和8 min。
【文档编号】G01N27/48GK105866205SQ201610216493
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月10日
【发明人】孙伟, 闫丽君, 牛学良, 文作瑞, 王文成, 李小宝
【申请人】海南师范大学