中四分之四的GlcNac残基附连有 半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之一的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如， 其中寡糖中五分之二的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之三的 GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之四的GlcNac残基附连有半乳 糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之五的GlcNac残基附连有半乳糖残基。
[0036]在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组 中包含一种或多种SialTl、SialT2、SialT3、SialT4、SialT5和SialT6编码转基因并在输 卵管组织，如输卵管膨大部组织（例如在管状腺细胞中）中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白 质，其中寡糖中一分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中二分之一 的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中二分之二的半乳糖残基附连有唾 液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其 中寡糖中三分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之三的半 乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之一的半乳糖残基附连有唾液酸 残基，或者例如，其中寡糖中四分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡 糖中四分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之四的半乳糖 残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基， 或者例如，其中寡糖中五分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五 分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之四的半乳糖残基附 连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之五的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例 如，其中寡糖中六分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之二 的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之三的半乳糖残基附连有唾 液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之四的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其 中寡糖中六分之五的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之六的半 乳糖残基附连有唾液酸残基。
[0037] 在一个实施方式中，本发明涉及转基因母鸡，所述转基因母鸡在其基因组中包含 一种或多种SialTl、SialT2、SialT3、SialT4、SialT5和SialT6编码转基因，所述转基因在 其输卵管组织，如输卵管膨大部组织（例如在管状腺细胞中）中产生N-聚糖，与非转基因 鸟类相比，所述N-聚糖中具有唾液酸结尾的分支的比例增加。例如，外源性蛋白质具有末 端位置30 %被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置40 %被唾 液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置50 %被唾液酸占据的N-聚 糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置60 %被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例 如，外源性蛋白质具有末端位置70%被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白 质具有末端位置80%被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置 90 %被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置95 %被唾液酸占 据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置100 %被唾液酸占据的N-聚糖结 构。
[0038] 在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组 中包含一种或多种GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6、GalT7、SialTl、SialT2、 SialT3、SialT4、SialT5和SialT6编码转基因，例如GalTl和SialT3编码转基因，并在输 卵管组织，如输卵管膨大部组织（例如在管状腺细胞中）中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白 质，其中寡糖中一分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中二分之一 的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中二分之二的半乳糖残基附连有唾 液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其 中寡糖中三分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之三的半 乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之一的半乳糖残基附连有唾液酸 残基，或者例如，其中寡糖中四分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡 糖中四分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之四的半乳糖 残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基， 或者例如，其中寡糖中五分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五 分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之四的半乳糖残基附 连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之五的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例 如，其中寡糖中六分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之二 的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之三的半乳糖残基附连有唾 液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之四的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其 中寡糖中六分之五的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之六的半 乳糖残基附连有唾液酸残基。
[0039] 在一个实施方式中，本发明提供了转基因母鸡，所述转基因母鸡在其基因组中包 含一种或多种 GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6、GalT7、SialTl、SialT2、SialT3、 SialT4、SialT5和SialT6编码转基因，例如GalTl和SialT3编码转基因，并在输卵管组 织，如输卵管膨大部组织（例如在管状腺细胞中）中产生外源性蛋白质，与非转基因鸟类相 比，所述外源性蛋白质具有唾液酸结尾的分支比例增加。例如，外源性蛋白质具有末端位置 20 %被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置30 %被唾液酸占 据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置40%被唾液酸占据的N-聚糖结 构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置50 %被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外 源性蛋白质具有末端位置60%被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有 末端位置70 %被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置80% 被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置90 %被唾液酸占据的 N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置95%被唾液酸占据的N-聚糖结构，或 者例如，外源性蛋白质具有末端位置100 %被唾液酸占据的N-聚糖结构。
[0040] 在一个实施方式中，本发明的蛋白质包含具有1_5个唾液酸（如1-4个唾液酸） 的寡糖。
[0041] 在一个实施方式中，本发明的蛋白质包含具有1-5个半乳糖（如1-4个半乳糖） 的寡糖。
[0042] 为了产生可生产外源性蛋白质的转基因-增强糖基化鸟类，可将转基因_增强糖 基化鸟类与已有鸟类交配，其中所述已有鸟类是转基因的，在其输卵管中产生治疗性蛋白， 其中通过在所述治疗性蛋白中加入具有半乳糖和/或唾液酸的寡糖，使其效果增强。可使 用转基因-增强糖基化鸟类产生卵或胚胎供体。可将转基因编码蛋白质，如治疗性蛋白质 引入胚胎，例如通过本领域已知方法，以产生在输卵管中产生转基因编码蛋白质的禽类品 系，其中所述糖基化的转基因编码蛋白质在其寡糖结构中可具有另外的糖，如半乳糖和唾 液酸。在另一实施方式中，用于产生治疗性蛋白质的已有鸟类可用于产生卵或胚胎供体，并 且将编码糖基转移酶（如GalT、SialT)转基因的载体引入供体卵或胚胎。
[0043] 在一个实施方式中，本发明涉及产生雌鸟如母鸡，从而在卵清来源的治疗性蛋白 质中产生寡糖结构，所述治疗性蛋白质更接近于哺乳动物蛋白质尤其是人蛋白质中出现的 天然寡糖结构。
[0044] 根据本发明产生的第一代转基因鸟类统称称为G0代，并且通常对于每一插入转 基因是半合子。可将G0代与非转基因鸟类配种得到完全转基因G1后代，所述G1后代也是 转基因半合子。G1半合子后代可与非转基因动物配种，产生G2半合子后代，或互相配种产 生转基因纯合的G2后代。GO代鸟类的转基因半合子或纯合子后代与GO代鸟类的另一转基 因半合子或纯合子后代配种，从而产生两种转基因的半合子后代。可将双半合子鸟类种间 杂交，从而产生一种或两种转基因的纯合子。这些仅仅是一些有用的育种计划的例子。本 发明关注本领域一般技术人员所知的任何有用的育种方案的使用。
[0045] 只要本文所述特点的任何组合所包含的特点不互相抵触，所述任何组合所包含的 特点均在本发明的范围之内。基于本说明书和本领域一般技术人员的知识，此类组合是清 楚明了的。
[0046]【附图简要说明】
[0047] 图1A和B显示了天然的（1A)和符合本发明的（1B)与卵清蛋白质附连的N-聚糖 的示例性结构。偶然发现Gal占据了末端GlcNac残基，并似乎是如图1A所示的0 1，4-连 接。在天然产生的卵清蛋白质中未在平分型GlcNac上检测到Gal的存在。此外，似乎当Gal 在N-连接寡糖上出现时，有时，虽然很少，被唾液酸化。根据本发明在末端GlcNac残基上 加入Gal，与不存在转基因增强糖基化时的唾液酸化相比，更多的末端GlcNac残基被唾液 酸化。图1B显示根据本发明在禽类输卵管中产生的蛋白质上存在的示例性N-连接寡糖结 构。在这个示例性图解和非限制性结构中，所有的末端GlcNac残基（除了平分型GlcNac) 都与唾液酸化Gal附连。
[0048] 图2显示了鸡半乳糖基转移酶的表达分析。mRNA分离自培养成纤维细胞（F)、产 卵母鸡的输卵管膨大部组织（M)、肝脏（L)和肾脏（K)组织，并用Northern印迹法进行分 析。用鸡1、2和3型0 1，4半乳糖基转移酶的互补序列探测印迹。左边显示RNA分子量标 记物的大约位置。1型mRNA的期望大小为2. 2kb。1型印迹中约4. 3kb的条代可能代表部 分加工的RNA。数据表明在输卵管膨大部组织不产生1型。
[0049] 图3显示了鸡唾液酸转移酶1、3、4和6的表达分析。mRNA分离自培养成纤维细 胞（F)、产卵母鸡的输卵管膨大部组织（M)、肝脏（L)和肾脏（K)组织，并用Northern印迹 法进行分析。用鸡1、3、4和6型唾液酸转移酶的互补序列探测印迹。左边显示RNA分子量 标记物的大约位置。数据表明在输卵管膨大部组织低表达3型，以及可能低表达4型。
[0050] 图4显示了示例性两种载体方案的流程图。GalTl群可由如图6A所示 pALV-SIN-1. 8-0M-GalTl 转基因产生。SialT3群可由如图 6B所示pALV-SIN-1. 8-0M-SialT3 转基因产生。EW指卵清。Sial指唾液酸。Gal指半乳糖。GS鸟类指同时含GalTl和SialT3 转基因的鸟类。Gal/Sial指Gal和唾液酸。GGSS鸟类指GalTl和SialT3转基因均为纯合 子的鸟类。"蛋白质产生群"指产生附连寡糖结构的蛋白质的群，如治疗性蛋白质，可通过在 寡糖结构中加入Gal和/或唾液酸提高其效率。
[0051] 图5显示了示例性载体方案的流程图。用图6C所示载体pALV-SIN-1. 8-0M-GalT l-IRES-SialT3产生群。EW指卵清。
[0052] 图 6A、B 和 C 分别显示了 pALV-SIN-1. 8-0M-GalTl、pALV-SIN-1. 8-0M-SialT3 和 pALV-SIN-1. 8-0M-GalTl-IRES-SialT3载体的图谱。显示了每一载体的逆转录病毒转基 因部分。简便起见未显示载体主链。一旦载体整合入鸡胚细胞，3' SIN LTR拷贝至5' LTR 上，使转基因被失活的LTR侧接。图6A显示了 1. 8kb卵类粘蛋白启动子可操作的与鸡1型 0-1，4-半乳糖基转移酶编码序列连接。图6B显示了 1. 8kb卵类粘蛋白启动子可操作的与 鸡3型a -2, 3-唾液酸转移酶连接。图6C显示了 1. 8kb卵类粘蛋白启动子通过两个编码 序列间的IRES可操作的与1型鸡0 -1，4-半乳糖基转移酶编码序列和鸡a -2, 3-唾液酸 转移酶3编码序列连接，如1990年6月26日提交的美国专利号4, 937, 190所公开的，将其 公开内容整体纳入本文作参考。
[0053] 图7产生转基因增强糖基化鸟类的一般方法和时间表。
[0054] 图8A显示了转基因增强糖基化鸡所产生的卵清蛋白质的寡糖结构的MALDI-MS分 析，其中使用如图6A所示载体将GatTl转基因插入所述转基因增强糖基化鸡的基因组（图 9)。进行13次独立分析，并显示具有代表性的一次实验结果。图8B-8C显示其它加入Gal 和/或唾液酸寡糖结构，在另外12次分析中的一次或多次也有同样发现（每一次实验的质 量/mz)。图8D是对照样品。数据显示Gal和一些唾液酸加入到卵清蛋白质中出现的寡糖 结构中，这是转基因增强糖基化的结果。图例：鲁=甘露糖；▲=岩藻糖；〇=半乳糖；= N-乙酰葡糖胺；?=唾液酸。
[0055] 本发明包含具有N-连接寡糖的蛋白质，例如人蛋白质，包括本申请所公开的那些 (如人蛋白质），可在具有新颖寡糖结构的转基因增强糖基化鸟类的输卵管中表达。
[0056]图 9A-C(SEQ ID NO: 1)显示长为 7434bp 的 pSIN-OM-1. 8-GalTl。序列的特点如 下：LTR-核苷酸 370. ? 542 ;LTR-3645. ? 3990 ;CDS-268. ? 7356 ;启动子 4441. ? 6214。
[0057] 图 10A-C(SEQ ID N0:2)显示长为 7545bp 的 pSIN-OM-1. 8-SialT3。序列的特点如 下：LTR-核苷酸 370. ? 542 ;LTR-3645. ? 3990 ;CDS6362. ? 7540;启动子 4431. ? 6309。
[0058] 图 11A-C(SEQ ID N0:3)显示长为9119bp 的pSIN-OM-1. 8-GalTl-IRES-SialT3。序 列的特点如下：LTR -核苷酸3653. . 3998 ;LTR-核苷酸378. . 550 ;CDS-核苷酸7930. . 9108 ; CDS-核苷酸 6276. . 7361;启动子核苷酸 4449. . 6222 ;IRES 7362. .. 7929。包括一种或多 种下列IRES产生的翻译产物量的核苷酸取代：nt 7920T-G;nt 7918C-A;nt 7917G-T;nt 7836G-A;用 AAITCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAAC(SEQ ID N0:39)替换 nt 7366-7368(CCC)。
[0059] 图12A(SEQIDN0:4)显示了鸡1型0-l，4-半乳糖转移酶（CKI)mRNA-登录号 U19890。特征是：5'UTR-核苷酸 1.?57;CDS-核苷酸 58.?1146 ;3'UTR-核苷酸 1147.?2279 ; 聚A_信号-核苷酸2260..2265。
[0060] 图128彼〇1〇勵:5)显示了鸡0-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
[0061] 图13A(SEQ ID N0:6)显示了鸡2型0 -1，4-半乳糖转移酶（CKII)mRNA -登录号 U19889。核苷酸 202. . 1323 显示了 CDS。
[0062] 图138彼〇1〇勵:7)显示了鸡0-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
[0063] 图14A(SEQ ID N0:8)显示了鸡3型0 -1，4-半乳糖转移酶mRNA -登录号 XM_416564。核苷酸 1. . 1029 显示了 CDS。
[0064] 图14B(SEQ ID NO:9)显示了鸡3型-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
[0065] 图15A (SEQ ID N0:10)显示了鸡4型0 -1，4-半乳糖转移酶mRNA -登录号 XM_416563。核苷酸 221. . 1288 显示了 CDS。
[0066] 图15B(SEQ ID NO: 11)显示了鸡4型-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
[0067] 图16六(5￡〇1〇勵：12)显示了鸡5型0-1，4-半乳糖转移酶1111?熟。核苷酸1..1773 显示了 CDS。
[0068] 图16B(SEQ ID NO: 13)显示了鸡5型-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
[0069] 图17A-B(SEQ IDN0:14)显示了鸡6型0-1,4-半乳糖转移酶mRNA。核苷酸 294. ? 1400 显示了 CDS。
[0070] 图17C(SEQ ID NO: 15)显示了鸡6型f3 -1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
[0071] 图18A(SEQ ID N0:16)显示了鸡7型0-1,4-半乳糖转移酶mRNA。核苷酸 57. ? 1016 显示了 CDS。
[0072] 图18B(SEQ ID NO: 17)显示了鸡7型-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
[0073] 图19A (SEQ ID N0:18)显示了鸡1型a -2. 3唾液酸转移酶mRNA。核苷酸 132. ? 1160 显示了 CDS。
[0074] 图19B(SEQ ID NO: 19)显示了鸡a -2. 3-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
[0075] 图20A (SEQ ID N0:20)显示了鸡2型a -2. 3唾液酸转移