酶氨基酸序列和核苷酸序列，这些序列是根据本发明的用途所涵盖 的序列例子。本发明用途还涵盖与本文所公开的氨基酸序列包括图12-28公开的序列中每 一条具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%相同性或 同源性的氨基酸序列。本发明用途还涵盖与本文所公开的核苷酸序列包括图9-28公开的 序列中每一条具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99% 相同性或同源性的核苷酸序列。
[0180] 本文标明了所公开的糖基转移酶的编码序列，本领域技术人员可从这些具体编码 序列确定氨基酸序列。因此，本发明包括编码具有糖基转移酶功能的氨基酸序列的核苷酸 序列，所述糖基转移酶与本文公开的糖基转移酶编码序列中每一个的编码氨基酸序列具有 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和 99%相同性。
[0181] 本发明的范围还包括，根据本发明本文所公开的核苷酸和氨基酸序列中每一个的 功能性片段的用途。
[0182] 还涵盖本文所公开的在蛋白质的N-连接寡糖结构中加入糖（如唾液酸，半乳糖） 的概念和用途在其它动物和其它有机体如植物中的用途。
[0183] 用下列实施例对本发明作进一步说明，但仅以说明方式提供，而不应当解释为对 本发明的限制。将本发明所有引用的参考文献、公开的专利申请以及专利内容整体纳入本 文作参考。
[0184]【实施例】
[0185]【实施例1】
[0186]【在禽类输卵管中表达GalTl的载体设计和构建】
[0187] 利用整合DNA技术（爱荷华州科尔维尔）（Coralville，IA)，使用针对母鸡输卵管 膨大部组织表达优化的密码子合成GalTl编码序列，如下所示（SEQIDN0:40):
[0189] 如图6A所示，将合成编码序列插入到ALV载体（gag、pol和env基因缺失）的卵 类粘蛋白（0M)启动子下游（图9所示序列）。
[0190] ALV载体的LTR是自失活（SIN)，因此该载体称为pALV-SIN，如2008年3月13日 公开的美国专利公开号2008/0064862,将其公开内容整体纳入本文作参考。所用载体也是 SC-阴性载体，如美国专利公开号2008/0064862所述。即从pALV-SIN移除了滴定基因（即 新霉素抗性基因）相关兀件。
[0191] 图6A所示pALV-SIN载体（图9)使用了1.8kb卵类粘蛋白（0M)启动子，该启动子 用于驱动半乳糖基转移酶编码序列的输卵管膨大部组织的特异性表达。0M蛋白质是一种主 要的卵清蛋白质，0M基因的表达完全限制于膨大部组织。所述载体称作pALV-SIN-GalTl。
[0192] 【实施例2】
[0193] 【产生GalTl转基因增强鸟类】
[0194] 通过2007年4月5日公开的美国专利公开号2007/0077650中所公开的瞬时转染 方法将如实施例1所述pALV-SIN-GalTl载体包装入病毒颗粒。
[0195] 转染后48小时收集包含病毒的培养基并离心浓缩，然后立即注射入开窗卵的X期 胚胎（X期是约有50, 000个细胞的胚胎，通常可见于新鲜产下的卵中）。
[0196] 注射约150个胚胎。用热胶栓封闭卵后进行孵育（Andacht等，Mol Reprod Dev 69 :31-4.，2004)。21天后孵化出42只小鸡，于1周后评价血液DNA中转基因的存在。所 述孵化小鸡记作G0，表示第0代。
[0197] 为了评价转基因步骤是否成功，使用Taqman?定量PCR系统确定孵化的G0鸡 血液DNA中的转基因含量（Harvey等，Poultry Science81 :202_12, 2002)。基于糖基转移 酶cds的序列设计引物和荧光标记的探针。纯化血液dna，使用Picogreen⑩试剂盒定量， 并用Taqman实验进行分析。约80%的鸡在其血液DNA中具有可检测水平的转基因。
[0198] 进行进一步的分子确认转基因的整合完整性。使用PCR从阳性鸡的血液中扩增转 基因的不同部分（0M启动子、CDS和3'非翻译区），使用琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大 小。所有测试的GalTl阳性G0鸟均包含完整的转基因拷贝。
[0199] 【实施例3】
[0200] 【产生完全转基因GalTl鸟并评价转基因增强糖基化】
[0201] 收集实施例2中的G0公鸡的精液，用Taqman实验分析精子DNA中转基因的含量 (Harvey，Speksnijder，Baugh，Morris 和 Ivarie. Poultry Science 81:202-12,2002)。将 转基因含量最高的公鸡与野生型母鸡交配，产生的子代经Taqman分析，鉴定出完全完全转 基因G1。
[0202] 收集13只G1母鸡的卵。用PNG酶处理卵清蛋白质，PNG酶可从蛋白质中特异性释 放N-连接寡糖（N-聚糖）。纯化N-聚糖，通过MALDI-MS分析确定结构，结果如图8所示。 如图所示，结果表明在许多寡糖结构中加入了相当数量的半乳糖，证实了本发明的有效性。 此外，图8A-8C显示，与来自野生型母鸡的蛋白质寡糖结构相比（图8D)，GalTl鸟蛋白质的 寡糖结构中加入了更多的唾液酸。
[0203] 【实施例4】
[0204] 【表达SialT3转基因增强鸟的载体设计和构建】
[0205] 使用根据在母鸡输卵管膨大部组织中合成鸡3型a -2, 3-唾液酸转移酶所优化的 密码子合成SialT3编码序列，如下所示（SEQ ID N0:41):
[0207] 如图10所示，将合成编码序列插入到如图6B所示pALV-SIN载体中卵类粘蛋白 (0M)启动子下游，得到pALV-SIN-SialT3,序列如图10所示。组装构建物，产生G0鸟类，并 完全如实施例1和2中GalTIGO鸟所述进行分析，并完全如实施例3中GalTl鸟所述产生 G1鸟。
[0208]【实施例5】
[0209]【用SiaT3阳性鸟和GalTl阳性鸟交配产生SialT3/GalTl转基因增强鸟】
[0210] 如本领域所知，将实施例3中一只或多只GalTIGl鸟（或两只GalTIGl鸟交配所 得纯合子G2GalTl鸟）与实施例4中SialT3Gl鸟交配（或与两只SialT3Gl鸟交配所得纯 合子G2SialT3鸟交配），从而得到带有GalTl和SialT3转基因的子代鸟。如本领域所知， 将这些鸟彼此进行再次交配产生两种转基因的纯合子。
[0211]【实施例6】
[0212] 【用于单一载体产生SialT3和GalTl转基因增强鸟类的载体设计和构建】
[0213] 使用如实施例1和4中为鸡输卵管膨大部组织表达而优化的密码子合成GalTl和 SialT3编码序列。将编码序列插入到单个逆转录病毒载体中单个1. 8kb卵类粘蛋白启动子 的下游。将用于第二或下游⑶S翻译的序列（如IRES)插入到GalTl和SialT3⑶S之间， 从而产生具有双顺反子信息的载体，如图6C和图11所示。
[0214] 上游翻译起始位点起始GalTl的翻译，内部核糖体进入位点（IRES)起始SialT3 的翻译，GalTl和SialT3⑶S从同一 mRNA中表达。如图6C所示IRES来自于脑心肌炎病 (EMCV) (Jang 等，J Virol 62 :2636-43.，1988 ;Ghattas 等，Mol Cell Biol 11 :5848-59， 1991)〇
[0215] 将该载体插入禽类（如鸡、鹌鹑、火鸡）胚胎，如上述实施例关于pALV-SIN-GalTl 的描述，获得胚胎和G0、G1。如本领域所知，可获取纯合子。
[0216] 将本文所引用的所有参开文献整体纳入本文作参考，出于如每一单独公开物、专 利或专利申请所表明的相同程度的所有目的，将其整体纳入本文作参考。
[0217] 对任何公开物引用是因为其在本申请申请日之前公开，不应被解释为承认本发明 是在此公开物之后作出的。
[0218] 虽然已经通过各种具体实施例对这项发明进行描述，应当理解的是并不因此而限 制本发明，并且可根据权利要求范围对本发明进行多种实践。
[0219] 本说明书还包括下列内容：
[0220] 1. -种转基因禽类，其包含含有糖基转移酶编码序列的转基因，其中所述转基因 禽类的输卵管组织产生具有包含至少一个糖的N-连接寡糖的蛋白质，其中在不存在所述 转基因的情况下所述寡糖不包含所述糖。
[0221] 2.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述糖基转移酶是N-乙酰葡糖 胺基转移酶。
[0222] 3.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述糖基转移酶是N-乙酰葡糖 胺基转移酶3。
[0223] 4.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织是输卵管膨大 部组织。
[0224] 5.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织含有管状腺细 胞。
[0225] 6.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织的细胞在卵清 存在时分泌蛋白质。
[0226] 7.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述转基因包含LTR。
[0227] 8.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述转基因包含输卵管特异性 启动子。
[0228] 9.-种包含分离实施方式1所述转基因禽类所产生的蛋白质的方法。
[0229] 10.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质对于禽类是外源性 的。
[0230] 11.-种包含分离实施方式10所述的转基因禽类所产生的外源性蛋白质的方法。
[0231] 12.如实施方式1所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质是治疗性蛋白质。
[0232] 13.如实施方式1所述的方法，其特征在于，所述禽类是鸡。
[0233]14.-种转基因禽类，其包含含有半乳糖转移酶编码序列的转基因，其中所述转基 因禽类的输卵管组织产生具有包含至少一个半乳糖的N-连接寡糖的蛋白质，其中在不存 在所述转基因的情况下所述寡糖不包含所述半乳糖。
[0234] 15.如实施方式14所述的转基因禽类，其特征在于，所述糖基转移酶是1型半乳糖 基转移酶。
[0235] 16.如实施方式14所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质产生于管状腺细 胞。
[0236]17.如实施方式14所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织的细胞在卵 清存在时分泌蛋白质。
[0237]18.如实施方式14所述的转基因禽类，其特征在于，所述寡糖包含1-5个半乳糖。
[0238]19.如实施方式14所述的转基因禽类，其特征在于，所述转基因包含禽类特异性 启动子。
[0239] 20. -种包含分离实施方式14所述转基因禽类所产生的蛋白质的方法。
[0240] 21.如实施方式14所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质是外源性蛋白质。
[0241] 22. -种包含分离实施方式21所述转基因禽类所产生的外源性蛋白质的方法。
[0242] 23.如实施方式22所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是治疗性蛋白质。
[0243] 24.如实施方式22所述的方法，其特征在于，所述禽类是鸡。
[0244] 25. -种转基因禽类，其包含含有唾液酸转移酶编码序列的转基因，其中所述转基 因禽类的输卵管组织产生具有包含至少一个唾液酸的N-连接寡糖的蛋白质，其中在不存 在所述转基因的情况下所述寡糖不包含所述唾液酸。
[0245] 26.如实施方式25所述的转基因禽类，其特征在于，所述糖基转移酶是1型半乳糖 基转移酶。
[0246] 27.如实施方式25所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质产生于管状腺细 胞。
[0247] 28.如实施方式25所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织的细胞在卵 清存在时分泌蛋白质。
[0248] 29.如实施方式25所述的转基因禽类，其特征在于，所述寡糖包含1-5个唾液酸。
[0249] 30.如实施方式25所述的转基因禽类，其特征在于，所述转基因包含禽类特异性 启动子。
[0250] 31. -种包含分离实施方式25所述转基因禽类所产生的蛋白质的方法。
[0251] 32.如实施方式25所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质是外源性蛋白质。
[0252] 33. -种包含分离实施方式32所述转基因禽类所产生的外源性蛋白质的方法。
[0253] 34.如实施方式33所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是治疗性蛋白质。
[0254] 35.如实施方式33所述的方法，其特征在于，所述禽类是鸡。
[0255] 36. -种在禽类中产生蛋白质的方法，其中所述蛋白质对于禽类是外源性的，所述 方法包括产生含有编码糖基转移酶的转基因的转基因禽类，其中所述禽类的输卵管组织产 生由第二个转基因编码的外源性蛋白质，所述蛋白质具有包含半乳糖和唾液酸中至少一个 的N-连接寡糖，其中在不存在编码糖基转移酶的转基因时所述寡糖不包含所述半乳糖和/ 或唾液酸。
【主权项】
1. 转基因禽类，其具有含有半乳糖基转移酶编码序列的转基因， 其中所述半乳糖基转移酶在转基因禽类的输卵管的管状腺细胞中表达，且 其中所述半乳糖基转移酶在所述管状腺细胞中，向由在管状腺细胞中表达的其他转基 因编码的外源性蛋白质的寡糖附加至少一个半乳糖， 其中在不存在所述编码半乳糖基转移酶的转基因的情况下，所述寡糖不包含所述至少 一个半乳糖。2. 权利要求1所述的转基因禽类，其中所述半乳糖基转移酶是1型半乳糖基转移酶。3. 权利要求1所述的转基因禽类，其中所述寡糖包含1~5个半乳糖。4. 权利要求1所述的转基因禽类，其中所述编码半乳糖基转移酶的转基因包含输卵管 特异性启动子。5. 产生在禽类中分离的蛋白质的方法，其中所述蛋白质对于禽类是外源性的，所述方 法包括： (a) 产生含有与输卵管特异性启动子可操作地结合的编码半乳糖基转移酶的转基因的 转基因禽类的步骤， 其中所述半乳糖基转移酶在转基因禽类的输卵管的管状腺细胞中表达，且 其中所述半乳糖基转移酶在所述管状腺细胞中，向由在所述禽类的管状腺细胞中表达 的其他转基因编码的外源性蛋白质的寡糖附加至少一个半乳糖， 其中在不存在所述编码半乳糖基转移酶的转基因的情况下，所述寡糖不包含所述半乳 糖；及 (b) 从由所述转基因禽类产的蛋的卵清分离具有经修饰的寡糖的所述外源性蛋白质的 步骤。6. 权利要求5所述的转基因禽类，其中所述输卵管特异性启动子是卵清蛋白启动子。7. 权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。8. 权利要求5所述的方法，其中所述禽类是鸡。9. 转基因禽类，其具有含有唾液酸转移酶编码序列的转基因， 其中所述唾液酸转移酶在转基因禽类的输卵管的管状腺细胞中表达，且 其中所述唾液酸转移酶向由在所述禽类的管状腺细胞中表达的其他转基因编码的外 源性蛋白质的寡糖附加至少一个唾液酸， 其中在不存在所述编码唾液酸转移酶的转基因的情况下，所述寡糖不包含所述至少一 个唾液酸。10. 权利要求9所述的转基因禽类，其中所述唾液酸转移酶是1、2、3、4、5或6型唾液酸 转移酶。11. 权利要求9所述的转基因禽类，其中所述寡糖包含1~5个唾液酸。12. 权利要求9所述的转基因禽类，其中所述编码唾液酸转移酶的转基因包含输卵管 特异性启动子。13. 权利要求9所述的转基因禽类，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。14. 权利要求9所述的转基因禽类，其中所述禽类是鸡。15. 在禽类中产生蛋白质的方法，其中所述蛋白质对于所述禽类是外源性的，所述方法 包括： 产生具有编码唾液酸转移酶的转基因的转基因禽类的步骤， 其中所述唾液酸转移酶在转基因禽类的输卵管的管状腺细胞中表达，且 其中所述唾液酸转移酶向由在禽类的管状腺细胞中表达的其他转基因编码的外源性 蛋白质的寡糖附加至少一个唾液酸， 其中在不存在所述编码唾液酸转移酶的转基因的情况下，所述寡糖不包含所述至少一 个唾液酸；及 从由所述转基因禽类产的蛋的卵清分离具有经修饰的寡糖的所述外源性蛋白质的步 骤。16. 权利要求15所述的方法，其中所述唾液酸转移酶是1、2、3、4、5或6型唾液酸转移 酶。17. 权利要求15所述的方法，其中所述编码唾液酸转移酶的转基因包含输卵管特异性 启动子。18. 权利要求15所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。19. 权利要求15所述的方法，其中所述禽类是鸡。
【专利摘要】本文公开了在输卵管组织中产生具有修饰寡糖结构的蛋白质的转基因禽类，以及产生这种禽类的方法。本发明还包含转基因个体中产生的修饰的蛋白质。
【IPC分类】C12N15/85, A01K67/02
【公开号】CN105052834
【申请号】CN201510568484
【发明人】A·J·哈维
【申请人】亚莱克逊药物有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2009年1月7日
【公告号】CA2706001A1, CA2706001C, CN101932231A, EP2230900A2, EP2230900A4, US8431770, US20090178147, WO2009088998A2, WO2009088998A3