dcf1基因调控ATP1B1的表达的应用
【专利摘要】本发明涉及一种dcf1基因调控ATP1B1的表达的应用。本发明运用野生型（作为对照）和dcf1敲除两种小鼠检测发现dcf1基因通过ATP1B1对星形胶质细胞的影响：通过细胞免疫荧光观察发现dcf1敲除后星形胶质细胞的体积缩小；之后细胞免疫荧光和免疫共沉淀证明了DCF1同具有影响胶质细胞体积功能的ATP1B1的相互作用，通过两者相互作用关系和上下游调节关系的研究，与此同时，在利用RNA干扰技术降低ATP1B1的表达量，观察到星形胶质细胞的异常出现缓解，最终证明DCF1对星形胶质细胞异常引起的智力障碍的治疗潜力。
【专利说明】
dcf 1基因调控ATP1B1的表达的应用
技术领域
[〇〇〇11本发明涉及一种dcf 1基因调控ATP1B1的表达的应用。【背景技术】[〇〇〇2]智力障碍是一种常见的因神经系统发育障碍引起的智力损伤和适应能力弱化的疾病。患者表现为语言学习迟缓，记忆能力减退，适应能力较弱等，全球大约有2~3%的人口受此疾病的影响，这些患者中有超过四分之一的由于基因水平的异常。
[0003]星形胶质细胞，是中枢神经系统中胶质细胞的一种。星形胶质细胞约占总胶质细胞的20%?40%左右，可调节细胞外离子和化学环境，支持脑血屏障，为神经组织提供营养物质，除此之外，星形胶质细胞在神经系统发育中起着重要的作用，它的异常会导致神经系统正常发育受影响，引起一系列包括智力障碍在内的神经系统相关的疾病。
[0004]树突状细胞因子(dendritic cel 1 factor 1，dcf 1 )，也称为跨膜蛋白59 (transmembrane protein 59,dcf 1)，属于一种单次跨膜蛋白。Wen等通过研究SD大鼠神经干细胞分化前后基因表达变化，发现dcf 1对神经干细胞分化起重要的作用；同时实验证明， 在小鼠神经干细胞系C17.2中过表达dcfl，可维持神经干细胞的未分化状态，这些结果都说明了 dcfl基因在神经系统发育中的重要作用，同时实验室前期研究表明dcfl基因敲除鼠的学习记忆能力下降。
[0005]ATP1B1是Na+/K+_ATP酶的调节亚基，可以通过对细胞膜内外Na+/K+离子浓度的调节实现非常多的功能，如维持神经元的静息电位，协助物质跨膜运输，改变细胞体积等。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供dcfl基因调控ATP1B1的表达在制备治疗星形胶质细胞异常引起的智力障碍药物中的应用，为智力障碍的治疗提供新的思路。
[0007]本发明运用野生型(作为对照)和dcfl敲除两种小鼠检测发现dcfl基因通过 ATP1B1对星形胶质细胞的影响:通过细胞免疫荧光观察发现dcfl敲除后星形胶质细胞的体积缩小；之后细胞免疫荧光和免疫共沉淀证明了DCF1同具有影响胶质细胞体积功能的 ATP1B1的相互作用，通过两者相互作用关系和上下游调节关系的研究，与此同时，在利用 RNA干扰技术降低ATP1B1的表达量，观察到星形胶质细胞的异常出现缓解，最终证明DCF1对星形胶质细胞异常引起的智力障碍的治疗潜力。【附图说明】
[0008]图1为dcfl的敲除引起星形胶质细胞体积缩小。
[0009]图2为ATP 1B1的表达量对星形胶质细胞体积的影响。[〇〇1〇]图3为dcfl的敲除引起ATP1B1表达量的变化。[〇〇11] 图4为DCF1与ATP1B1相互关系的验证。[0〇12] 图5为DCF1调节ATP1B1的表达。
[0013]图6为利用RNA干扰降低ATP1B1表达量对星形胶质细胞异常的缓解作用。[0〇14]图7为dcfl对智力障碍疾病影响的示意图。【具体实施方式】
[0015]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0016]实施例1:细胞免疫荧光将新生鼠放入含有无水乙醇的烧杯中，无水乙醇的量要能完全淹没新生鼠，观察待新生鼠完全不动后开始取鼠脑。；小心将新生鼠鼠脑取出，置于预先加水预冷PBS的玻璃皿中， 并在体视镜下用尖头镊小心剥取新生鼠的海马组织;将新生鼠海马组织转移到干净的15ml 离心管里，用移液器轻轻吹打数次;观察组织完全破碎后即可4°C条件下瞬间离心，弃去上清，重新加入适量预冷IX PBS吹打重悬，重复步骤三次后；用含有5%FBS生长因子B-27及双抗的Neuro培养基轻轻吹打重悬细胞，取20ul培养基加入20ul台盼蓝染色，在细胞计数仪中观察细胞密度。按实际实验需要将细胞以合适的浓度转移到培养皿中，37 °C培养三天，三天后半定量换液。取出原代七天后即可转染并进行细胞免疫荧光实验:将待处理的细胞的培养基弃去，并用IX PBS清洗三遍;加入含有2% BSA和0.1% Triton的IX roS，室温孵育30分钟;弃去步骤2中的液体，加入按1:200稀释的一抗，4度孵育过夜;弃去一抗，用IX PBS清洗三次，加入按1:500稀释的带有荧光的二抗，避光孵育2个小时;加入IX DAPI工作液，十分钟后弃去液体，并用IX PBS清洗三次;滴加封片机，封片，观察。参见图1，dcfl敲除后星形胶质细胞形态异常，参见图2 ATP1B1的过表达引起星形胶质细胞异常，参见图4,细胞免疫荧光显示两蛋白的共同定位。参见图6，RNA干扰技术使ATP1B1的表达量降低后，星形胶质细胞形态的异常有所缓解。[0〇17]实施例2:蛋白免疫印迹检测蛋白表达量按不同组别转染HEK293细胞，48小时后将细胞转移到干净的1.5ml离心管，经PBS清洗后加入已提前加好蛋白酶抑制剂的裂解液(直径为1 〇cm的皿加入400u 1的裂解液)，稍加吹打混匀，放置在冰上;30分钟后将组织/细胞转移到干净的1.5ml超速离心管中，配平后在超速离心机中以l〇,〇〇〇g 4°C离心十分钟；小心将100ul上清转移到干净的1.5ml离心管中， 加入25ul 5X SDS Loading Buffer(已提前加入lul巯基乙醇)，稍加混匀后在99°C金属浴中孵育10分钟；瞬时离心后即可点样，80V，30分钟；120V，90?120分钟(蓝色的Loading dye 至胶最下面)；截取合适大小的PVDF胶，并经无水甲醇活化后，与滤纸，胶放入转膜液中，轻摇15分钟。然后按照底层滤纸-膜-胶-顶层滤纸方向制成“三明治”样放入转半干转仪中进行转膜。用玻璃棒轻碾防止“三明治”中存在气泡。25V，0.4A，转膜时间根据蛋白大小控制在 30分钟?1个小时;封闭:转膜完成后用IX PBS稍加清洗后，用5% BSA-PBS室温摇床上封闭1 小时;一抗:封闭后回收封闭液后直接加入一抗，室温孵育两个小时或者4 °C过夜(一抗用 IX PBS按抗体推荐的稀释比例稀释)<ax PBST(0.1% Tween-20溶于IX PBS中)洗膜3次，转速在lOOrprn左右，每次5分钟；二抗:加入Odessy荧光二抗(1:10000)。室温孵育30分钟；IX PBST洗膜3次，每次5分钟;将洗好的膜锡箱纸包好，Odessy仪器扫膜。参见图3，dcfl的敲除影响ATP1B1的表达;参见图5，DCF1蛋白量的变化会引起ATP1B1表达量的变化，反之则不同， ATPlBl的过表达并未对DCFl的表达有任何影响，S卩DCFl调控ATPlBl的表达。
【主权项】
1. dcfl基因调控ATP1B1的表达在制备治疗星形胶质细胞异常引起的智力障碍药物中 的应用。
【文档编号】G01N33/68GK105974126SQ201610371968
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】文铁桥, 王董, 王娇, 冯瑞丽
【申请人】上海大学