可调型基因自杀机制组合物和方法
【专利说明】可调型基因自杀机制组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2008年6月25日提交的美国临时专利申请61/075687号和2009年4月10 日提交的61/168457号的权益，在此通过引用将每个这些相关申请的内容全文并入。
[0003] 发明背景 发明领域
[0004] 本发明的实施方案涉及用于产生、纯化、配制和使用作为靶向递送媒介的真细菌 小细胞的组合物和方法，所述媒介用于体内和体外核酸、蛋白和小分子药物的递送以及靶 向体内成像和诊断技术。
[0005] 相关技术的描述
[0006] 提供下列说明以辅助理解本发明公开内容，但是并非承认描述或构成针对本公开 的现有技术。本申请中所提及或引用的文章、专利和专利申请和所有其他文献以及电子化 可利用信息的内容，都通过引用的方式全文并入本文，其并入的程度，如同每篇单独的出版 物被特别且单独指出通过引用的方式并入一样。本申请人保留将任何和所有来源于任何此 类文章、专利、专利申请或其他的文献的材料和信息在物理上并入本申请的权利。
[0007] 小细胞是非染色体的、被膜包裹的生物纳米粒子(<400nm)，该纳米粒子在细菌细 胞的正常分裂器破坏后，由细菌形成。本质上，小细胞是正常细菌细胞的小的、新陈代谢活 跃的复制品，但是它们不含有染色体DNA并因此为非分裂的和无存活力的。尽管小细胞不含 有染色体DNA、质粒DNA分子、RNA分子，但已证明天然和/或重组表达蛋白和其他的代谢物都 可分离出小细胞。
[0008] 在整个上世纪中，研究科学家已利用小细胞作为研究细胞分裂、质粒复制、质粒分 离、RNA产生、蛋白产生、质粒隔离、质粒表征和原核生物中质粒源性毒力因子产生的工具。
[0009] 作为微生物学、微生物遗传学和分子生物学领域中进展的结果，任何给定的小细 胞，不管其来自哪种亲代细胞种类，现在都可以被"改造"并随后用作体内或体外靶向递送 或成像的媒介。
[0010] 小细胞特别适合于作为体内递送和成像的媒介，因为它们将许多其他的递送技术 的单独的优势组合成单一的通用递送媒介。小细胞可以被"改造"为优先封装、偶联或吸收 包括各种核酸、蛋白和小分子药物的生物活性分子，以用于随后的治疗和预防医药应用。如 下文更为详细描述的，因为通过使用几种不同的抗体或基于亲和力的方法，它们可以靶向 于特定的细胞、组织和器官类型，所以小细胞具有更多优势。
[0011] 发明概述
[0012] -些实施方案提供了产生小细胞的细菌，所述细菌包含:编码产生小细胞的基因 产物的可表达基因，该基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一个或多个;和编 码核酸内切酶的可表达基因，其中所述产生小细胞的细菌的染色体包含一个或多个核酸内 切酶的识别位点。在一些实施方案中，产生小细胞的基因是细胞分裂基因。细胞分裂基因包 括但不限于ftsZ、sulA、 CCdB以及sfiC。在一些实施方案中，在诱导型启动子的控制下，表达 所述产生小细胞的基因。在一些实施方案中，核酸内切酶基因位于产生小细胞的细菌的染 色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶是归巢核酸内切酶(homing endonuclease)。所述 归巢核酸内切酶包括但不限于1-〇6111、？1-5〇61、1-〇1111、1-〇口31、1-5〇6111、1-〇61、1-Msol、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-Dmol、I-Porl、PI-T1 il、PI-T1 ill 和PI-ScpI。在一些实 施方案中，在诱导型启动子的控制下，表达所述核酸内切酶。在一些实施方案中，产生小细 胞的细菌是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni)、乳杆菌属种(Lactobacillus spp.)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、嗜 肺军团菌（Legionella pneumophila)、沙门氏菌属种（Salmonella spp ·)、志贺氏菌属种 (Shigella spp·)、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌包含编码参与脂多糖合成的 基因产物的基因，与相应的野生型基因相比，所述基因是遗传修饰的。在一些实施方案中， 所述基因是msbB基因，该基因编码基因产物，与相应的野生型细菌中的脂质A分子相比，所 述基因产物引起细菌产生改变的脂质A分子。在一些实施方案中，与相应的野生型细菌中的 脂质A分子相比，对于将肉豆蔻酸(myristolic acid)添加至脂多糖分子的脂质A部分而言， 所述改变的脂质A分子是有缺陷的。产生小细胞的细菌可以是革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性 细菌包括但不限于葡萄球菌属种（Staphylococcus spp.)、链球菌属种（Streptococcus spp.)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)或錯样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。在一些实 施方案中，产生小细胞的细菌包含参与同源重组的基因，其中与相应的野生型基因相比，这 一基因是遗传修饰的，其中所述产生小细胞的细菌在DNA损伤修复方面是有缺陷的。
[0013] -些其他的实施方案提供了制备小细胞的方法，包括培养本文所公开的产生小细 胞的细菌和将小细胞与产生小细胞的亲代细胞基本分离，因此产生包含小细胞的组合物。 在一些实施方案中，所述方法还包括由产生小细胞的亲代细胞诱导小细胞的形成。在一些 实施方案中，所述方法还包括诱导编码核酸内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，通过 一种或多种选自异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜 二糖(melbiose)和四环素的化学化合物的存在诱导小细胞形成。在一些实施方案中，通过 温度变化诱导编码核酸内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，所述方法还包括由所述 组合物纯化小细胞。在一些实施方案中，通过选自离心、超速离心、密度梯度、免疫亲和性和 免疫沉淀的方法将所述小细胞与亲代细胞基本分离。
[0014] -些其他的实施方案提供了包含外膜的真细菌小细胞，其中所述外膜包含没有肉 豆蔻酸部分的脂质A分子。在一些实施方案中，本文所公开的真细菌小细胞的外膜具有这样 的成分:与来自相应的野生型细菌的真细菌小细胞的外膜相比，所述成分导致哺乳动物宿 主中促炎症免疫反应的减少。在一些实施方案中，所述真细菌小细胞还包含一种或多种生 物活性化合物。在一些实施方案中，至少一种生物活性化合物选自放射性同位素、多肽、核 酸和小分子。生物活性化合物可以是小药物分子、小分子成像剂、化学治疗剂或前体药物转 化酶。生物活性化合物也可以是核酸和小分子的组合，小分子成像剂和小分子药物的组合， 小分子药物、小分子成像剂和核酸的组合，或核酸和多肽的组合。在一些实施方案中，本文 所公开的真细菌小细胞还包含细胞表面定位的革E向部分（cell-surface localized targeting moiety)。在一些实施方案中，细胞表面定位的革El向部分是融合蛋白，其中所述 融合蛋白是所述真细菌的外膜锚定结构域和抗体片段的融合物。在一些实施方案中，细胞 表面定位的靶向部分是融合蛋白，其中所述融合蛋白是淋病奈瑟氏菌IgAP和识别哺乳动物 细胞表面抗原的抗体片段的融合物。在一些实施方案中，哺乳动物细胞表面抗原选自脂肪 分化相关蛋白（adipophilin)、AIM-2、BCLX(L)、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、 Ep-CAM(上皮细胞粘附分子）、EphA3、FGF5(纤维母细胞生长因子5)、G250/MN/CAIX、HER-2/ neu、IL_13Ra2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白（alpha-foetoprotein)、M_CSF(巨·细胞集落刺激因 子）、]\?^、111(1111-2、]\^3-2(基质金属蛋白酶-2)、]\11](：-1、？53、？8?、？1^1^、？3]\^(前列腺特异性 膜抗原）、RAGE-1、RGS5(G蛋白信号调节蛋白5)、RNF43(环指蛋白43)、RU2AS、分离蛋白1 (secernin 1)、S0X10、STEAP1、生存素 （survivin)、端粒酶(Telomerase)、WT1 (肾母细胞瘤 1)、Cdc27、CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶4)、CDKN2a(细胞周期蛋白依赖性激酶2&)、80?_ ABL、BAGE-1、GAGE1-8、GnTV、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、 MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A9、粘蛋白（mucin)、NA-88、NY-ES0-1、LAGE-2、 SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、CD-I66和TRP2-INT2。
[0015] 附图简要说明
[0016] 图1是显示I-CeuI对E.coli培养物生长影响的图。
[0017] 图2是显示I-CeuI对E.coli生存力影响的图。
[0018] 图3A和3B是显示与单独的minCDE突变体或ftsZ超表达相比，同时ftsZ超表达和I-CeuI诱导导致更高的小细胞产量的柱状图。
[0019] 图4A-D是显示基于ftsZ超表达和I-CeuI诱导的自杀系统使亲代细胞丝状形成增 加的图。
[0020] 图5是显示基于I-CeuI的自杀系统引入不可修复的双链染色体断裂的柱状图。
[0021] 图6是显示基于I-CeuI的自杀系统减少纯化的小细胞中的亲代细胞污染的柱状 图。
[0022]图7是显示鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)中msbb基因的缺失改变脂多糖(LPS) 谱的银染色的SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶。
[0023]图8是显示msbb的缺失引起J774.A1小鼠巨噬细胞样细胞产生较低水平的抗鼠伤 寒沙门氏菌LPS的肿瘤坏死因子a(TNFa)的柱状图。
[0024] 图9显示单链I-CeuI DNA识别序列和双链I-CeuI DNA切割位点。
[0025]发明的详细描述 [0026]
[0027] 本文所使用的术语"细胞分裂基因"指的是编码参与细胞分裂过程的基因产物的 基因。在本领域中已发现并表征了许多细胞分裂基因。所述细胞分裂基因的实例包括但不 限于 zipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsI、ftsN、ftsK、ftsL、ftsQ、ftsW、 ftsZ、minC、minD、minE、seqA、ccdB、sfi(^PddlB〇
[0028] 本文所使用的术语"转基因"指的是天然地或通过许多基因工程技术的任何一种 从一个生物体转移到另一个生物体的基因或遗传物质。在一些实施方案中，所述转基因是 含有基因序列的DNA区段，所述基因序列已被从一个生物体分离出来并被引入到不同的生 物体中。这种非天然的DNA区段可以保留在转基因生物体中产生RNA或蛋白的能力，或它可 以改变转基因生物体遗传密码的正常功能。在一些实施方案中，所述转基因是人工构建的 DNA序列，不管它是否包含基因编码序列，将所述DNA序列引入到其中之前不存在该转基因 的生物体。
[0029] 如本文所使用的，如果相对于进行纯化前的组合物，在组合物中该试剂的浓度增 加和/或一种或多种不期望的污染物的浓度减少，则说已纯化这一试剂。因此纯化包括富集 组合物中的试剂和/或从所述组合物中分离试剂。
[0030] 本文所使用的术语"结构域"或"蛋白结构域"指的是具有共同的物理和/或化学特 征的分子或结构的区域。蛋白结构域的非限制性实例包括疏水的跨膜或外周膜结合区、球 状的酶促区或受体区、蛋白-蛋白相互作用结构域和/或核酸结合结构域。
[0031] 本文所使用的术语"真细菌"和"原核生物"如本领域技术人员所使用的那些术语 一样。本文所使用的术语"真细菌"和"原核生物"包括真细菌，其包括革兰氏阴性细菌和革 兰氏阳性细菌、原核病毒(例如噬菌体)和专性细胞内寄生虫(例如立克次体(Richettsia)、 衣原体(Chlamydia)等）。
[0032]本文所使用的术语"核酸"指的是不同核酸分子的任何集合。核酸可以是ssDNA(单 链DNA)、dsDNA(双链DNA)、ssRNA(单链RNA)、dsRNA(双链RNA)、tRNA(转运RNA)(包括稀有密 码子使用的tRNA)、mRNA(信使RNA)、核糖体RNA(rRNA)、肽核酸(PNA)、DNA-RNA杂合体、反义 寡核苷酸、核酶或适体。
[0033] 本文所使用的术语"超表达"指的是宿主细胞中DNA所编码的多肽或蛋白的表达， 其中所述多肽或蛋白不是宿主细胞中正常存在的，或其中所述多肽或蛋白在宿主细胞中的 存在水平高于编码所述多肽或蛋白的内源性基因所正常表达的多肽或蛋白的水平。
[0034] 本文所使用的术语"调节"指直接或间接与靶标相互作用以至于改变所述靶标活 性来调节生物学过程。"调节"的模式包括但不限于增强靶标的活性、抑制靶标的活性、限制 靶标的活性或扩展靶标的活性。
[0035]
[0036]真细菌小细胞非常适于用作靶向递送载体和成像载体。因为它们来自通常是固有 致病的或至少条件致病的细菌，所以在体内系统给药特别是静脉内给药之前，从给定的群 体中功能性地消除污染性亲代细胞是有利的。因此，理想的小细胞制剂将是这样的制剂，在 所述制剂中，随着小细胞被处理和纯化，残余的活亲代细胞计数应尽可能低。实现这一目的 的一种方法是，在物理分离步骤已完成后，引入自杀机制以杀死残余的亲代细胞。这种增强 的安全特性减少了感染和败血症的风险，降低了通过与其他细菌的重组事件而导致的遗传 回复突变的可能性，并且使宿主中插入事件的风险最小化。优选的是从产生小细胞的亲代 细胞菌株的细菌染色体中除去抗生素抗性标记物。从产生小细胞的细菌株中除去抗生素抗 性基因标记物是理想的，因为这样可以满足美国食品和药品管理局(FDA)对人类应用的监 管要求。对于最终产品意图应用于人类的菌株而言，FDA只允许出于选择细菌或细菌生产株 的目的而使用的卡那霉素(Kanamycin)抗性基因标记物。而且，FDA要求用于分析药物产品 和最终的小细胞制剂的某些证明标准必须满足USP(美国药典）和ICH(国际协调会议)对纯 度、聚集物缺乏和特定物质缺乏的指标。因此，药物产品的上游和下游加工都归入公司的化 学、生产和控制(CMC)药物产品产生活动。
[0037 ]对更好的纯化方法的需求是研发来自致病菌的小细胞的难题。本发明的实施方案 涉及可调型基因自杀机制的引入和用途，一旦暴露于适当的信号，该机制就将不可修复的 双链断裂引入至产生小细胞的亲代细胞的染色体中，从而导致亲代细胞死亡。与其他的产 生小细胞的菌株相比，自杀机制的激活也增加了小细胞的产量，而且同时使所有产生小细 胞的亲代细胞转化为不可逆的丝状表型。因此，本文所公开的自杀机制不限于促进携带染 色体的亲代细菌细胞的死亡，而是能具有其他多功能作用，即共同作用以改进小细胞产生。 在一些实施方案中，本文所公开的多功能自杀机制即"MSM"系统所发挥的作用是，杀死携带 染色体的亲代细胞。在一些实施方案中，本文所公开的"MSM"系统所发挥的作用是，增加小 细胞的产量。在一些实施方案中，本文所公开的"MSM"系统所发挥的作用是，专门地诱导亲 代细胞的不可逆的丝状表型以辅助亲代细胞与小细胞分离。在一些实施方案中，本文所公 开的"MSM"系统同时发挥以下作用：（i)杀死携带染色体的亲代细胞，（i i)增加小细胞的产 量，和（iii)专门地诱导亲代细胞的不可逆的丝状表型以辅助亲代细胞与小细胞分离。所述 MSM系统的多功能作用能利用本文所述的技术改善小细胞的产生和纯度。
[0038] -些实施方案涉及组合物和方法，所述组合物和方法用于通过将多功能基因自杀 机制即"MSM"系统引入至产生小细胞的亲代细胞系，从而减少或消除可存活的污染性产生 小细胞的活真细菌亲代细胞的数量，同时优化所产生的小细胞的产量和纯度。一些实施方 案还涉及MSM系统用于在合成生物学应用中的用途。
[0039] 污染性的活亲代细胞在最终的小细胞制剂中的存在，尤其对于来自活致病细菌和 条件致病细菌的小细胞来说，是有问题的。当由细菌产生意图在人类或其他的哺乳动物中 使用的生物制剂或药物时，因为细菌可能引起疾病、严重炎症和在某些情况下导致死亡，因 此与污染性亲代细菌相关的安全性和CMC问题是至关重要的。本文所述的产生细菌小细胞 的组合物和方法不但改进了小细胞的产生和纯度，而且同时改善了用于体内和其他用途的 小细胞制剂的安全特性。不限于下文的实施例，高纯度和安全的小细胞制剂的体内应用可 以用于靶向生物成像和癌症、遗传病症和感染性疾病的治疗性预防和治疗。本发明公开内 容的一些实施方案涉及可调型基因 MSM机制的引入和用途，即一旦暴露于适当的信号，所述 可调型基因 MSM机制就会将不可修复的损伤引入至产生小细胞的亲代细胞的染色体。所述 自杀机制同时有利于纯化技术，所述纯化技术旨在从意图用于多数靶向递送应用中的小细 胞制剂中更好地消除可存活的亲代细胞。
[0040] 本文所用的术语"可调型基因自杀机制"指的是这样一种机制，其中一个细胞或一 组细胞受已知的和外部的来源刺激产生一种或多种基因产物，所述基因产物可以不可逆地 损伤细胞的生物学必需组件或细胞过程，从而使得所述细胞不再有存活力，也不能从所述 事件中恢复。术语"多功能自杀机制"即MSM，指的是使用可调型基因自杀机制同时诱导高水 平的小细胞产生、诱导亲代细胞死亡和在诱导自杀元件期间专门在亲代细胞中诱导产生丝 状表型。
[0041 ]本文所用的术语"靶向小细胞"或"祀向递送"指的是这样的小细胞组合物，其中所 述小细胞封装一个或多个所选择的生物活性分子而且展现小细胞的外部表面上的靶向部 分，不管小细胞是（i)完全完整的，（ii)原生质体(外膜和细胞壁被移除）或（iii)原生质体 (外膜被移除或可通透的），从而使得所述部分特异性结合、被结合或通过一些其他的方法 特异性识别并因此在特定的细胞、器官或组织类型中递送、定位或聚集以递送所述小细胞 的分子内容物至体外或体内的所述靶细胞、组织和器官类型。意图通过这种特异的靶向来 使用小细胞来递送有效载荷至靶细胞或组织。
[0042]这种利用小细胞的体内递送应用包括但不限于：生物活性的（与生物学上有活性 的同义)小分子药物、生物活性核酸、生物活性蛋白和生物活性脂多糖的靶向递送，用以在 动物中产生"生物学效应"（与生物学反应同义）。所述生物学效应包括但不限于:杀死靶细 胞(例如癌细胞）的效应、取代在特定靶向细胞类型中可能缺陷的或功能异常的基因的效 应、减少在特定靶细胞中失调的蛋白或信号传导分子的表达和/或活性的效应、减少或增加 来自特定细胞的激素的分泌的效应、刺激针对一种或多种抗原的适应性细胞免疫反应的效 应、刺激针对一种或多种抗原的适应性体液反应的效应、同时刺激针对一种或多种抗原的 适应性体液反应和细胞免疫反应的效应、刺激或抑制一种或多种固有性免疫反应的效应； 积极地或消极地影响动物体内的生物学过程的效应，以及影响致病寄生虫、细菌、病毒或其 他的致病微生物中的生物学过程以治疗或预防所述动物体内的疾病的效应。生物活性元件 本身并不一定就具有免疫原性而诱导宿主动物中的免疫反应，但可以是因为其生物活性的 结果而间接地引起免疫反应。
[0043]真细菌小细胞对于递送而言的独特优势是它们可以被改造从而靶向并将生物活 性分子递送至体内的特定细胞类型。通过与特异性针对祀细胞表面分子的小细胞抗体或抗 体衍生物的表面偶联实现所述靶向。可选地，靶向可以通过产生小细胞的亲代菌株的基因 工程来完成，从而使得它们产生的小细胞在小细胞外膜上表达并展现与靶细胞特异性表面 分子有亲和力的抗体片段或其他多肽。在这后一种情况下，可以通过制备细胞表面定位的 靶向部分和例如来自淋病奈瑟