专利名称：一种新的香樟核糖体失活蛋白基因CcRIPII的制作方法
技术领域：
本发明涉及香樟树的一种新的核糖体失活蛋白基因CcRIPII。CcRIPII基因没有内函子，但含有完整的ORF区域，其编码序列全长1758个核苷酸(29-1786)，编码585个氨基酸和一个终止密码子(TGA)。构建了 CcRIPII基因的植物表达载体pCAMBIA2300_CcRIPII，用pCAMBIA2300-CcRIPII转化宁阳大枣获得了转基因植株。CcRIPII是国际上克隆并完成对林木遗传转化的第一个木本植物核糖体失活蛋白基因，它的克隆和对林木遗传转化的成功，对木本植物抗病毒研究和遗传育种具有重要意义。
背景技术：
山东的宁阳大枣是我国著名的优良地方特产，近年来病毒病的流行严重影响了宁阳大枣的发展，造成了重大损失。病毒病不仅对宁阳大枣造成威胁，而且还危害多种果树的生产。泰安市泰山林业科学研究院冯殿齐和刘静研究员发现和宁阳大枣种植在同一地区的一些香樟树对病毒病具有高度抗性。核糖体失活蛋白基因(RIP)是一类广谱抗病毒基因，在保护植物免受病毒危害方面具有重要作用。国内外已有不少报道关于RIP基因转化植物、获得抗病毒植物新种质的报道。但是对木本植物的遗传转化迄今尚未见成功报道。本研究希望在这个领域打开个突破口。
发明内容
本发明根据已经报导的植物核糖体失活蛋白基因的保守序列设计PCR引物，经过同源扩增获得了一种新的香樟树核糖体失活蛋白基因CcRIPII的部分序列。然后通过RACE扩增获得了该基因全长cDNA序列(
图1)。CcRIPII基因不含内函子，但含有完整的ORF区域，ORF全长1758个核苷酸，编码585个氨基酸和一个终止密码子(TGA)(图1)。随后构建了 CcRIPII 基因的植物表达载体pCAMBIA2300-CcRIPII (图 3)，用 pCAMBIA2300_CcRIPII 转化宁阳大枣获得了转基因植株。CcRIPII是国际上克隆并完成对林木遗传转化的第一个木本植物核糖体失活蛋白基因。我们用的双元克隆载体pCAMBIA2300 (购自公司澳大利亚Cambia公司，其结构见图2)，构建了 CcRIPII基因的植物表达载体。在构建目的基因CcRIPII的植物表达载体时，将分子克隆得到的CcRIPII基因片段在SalI和KpnI双酶切位点插入到载体pCAMBIA2300中，建成的表达载体被命名为pCAMBIA2300-CcRIPII (图3)。所用的标记基因是广泛应用的新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，它编码的产物对氨基葡糖苷类抗生素如卡那霉素等具有抗性。在构建本表达载体时考虑到融合基因太大会影响表达，因此没包含报告基因GUS.
由于草本植物和木本植物的结构大不相同，过去RIP基因遗传转化研究用的基因都是来自草本植物，转化的植物也都是草本植物。本研究中我们用来自木本植物的RIP基因转化木本植物，目的基因在木本植物宿主体内更容易表达。
另外，我们转化中所用的目的基因来自当地的和受体植物生长在同一地区的植物，转化的植物对环境没有任何影响。根据CcRIPII基因序列和所用的载体设计了一对特异性PCR引物，正向引物设计在5'端载体序列上，反向引物设计在目的基因的3'端，这样可以保证PCR扩增产物只能来自导入的CcRIPII基因，而不可能来自内源基因序列，提高了检测的特异性和准确性。另夕卜，用这对特异性引物扩增出的PCR产物为550bp，大小合适，检测方便，效率高。
具体实施例方式(一 )以木本植物的离体再生体系作为转化材料，利用农杆菌浸染方法进行遗传转化。(二)转化操作步骤1.农杆菌转化法(1)通过三亲株杂交法将pCAMBIA2300-CcRIPII表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中，用于农杆菌浸染转化实验。(2)菌液制备
I)用接种环刮拭含有重组质粒的农杆菌菌株冻结的培养物表面，划线于含有相应抗生素的上述YEP平板上，置于28°C恒温培养箱培养2天，待平板上有菌落长出来的时候，即可用于液体培养。长出菌落的平板置于4°C冰箱保存。一个月后转接到新的YEP平板上，以保持菌的活性。2)从平板上挑取单菌落，接种于含IOml附加相应抗生素的YEP液体培养基(pH7.0)中，在恒温摇床上，于28°C，180-200rpm振荡培养过夜。3)次日早晨，当菌液OD6tltl = 0.5-0.6时，可用于转化。(经验上一般为头天下午5点左右进行振荡培养，次日早晨8点左右菌液浓度可达到标准)备注:培养基中加入抗生素的时候，一定要等到培养基冷却但未凝固时(即人手所能忍耐的温度)加入，否则抗生素在高温下会失效。(3)农杆菌转化I)预培养:将无菌离体再生组织横向切割2-3个切口，后接种在分化培养基上进行预培养1-2天。2)共培养:用无菌水将农杆菌菌液稀释5-20倍，将经过预培养的离体再生组织浸泡在稀释液中10-20分钟，取出茎段，用无菌滤纸吸干后，转入分化培养基上暗培养2-4天，对照处理是将剪伤的离体再生组织在无菌水中浸10-20分钟，其它处理与实验材料一样。3)选择培养:离体再生组织与农杆菌共培养后，即可看到离体再生组织边缘有乳白色的农杆菌菌落出现，用无菌水冲洗茎段，然后用无菌滤纸吸干。将离体再生组织转移到加有选择压的脱菌分化培养基上，在光照4000-100(K)lX，25°C条件下进行选择培养。4)继代选择培养:选择培养3-4周后，离体再生组织的转化细胞将分化出抗性不定芽，将这些抗性材料转入相应的加大选择压的脱菌选择培养基中进行培养。5)生根培养:待不定芽长到2厘米以上时，切下并插入含有选择压的脱菌生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根，获得转化植株。(三)PCR分子检测
1、植物总DNA的提取(采用CTAB法)(I)称取2克左右植物试管苗新鲜叶片，置研钵中，加入1/10植物材料体积的PVPP,倒入液氮将植物材料研磨成细末。(2)将此粉末放入大离心管中，加入65°C预热过的与植物材料等体积的2XCTAB提取液，再加入I %的β -巯基乙醇，反复颠倒混匀，65°C保温15-20min。(3)取出，冷却到室温，加入等体积的氯仿，轻轻的反复颠倒约lOmin，室温12000rpm离心15分钟。(4)将上清液置于另一离心管中，重复上一步骤1-2次。(5)加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，用玻璃钩挠出絮状沉淀，置于预先放满70%乙醇的Eppendorf管中，洗漆DNA, 12000rpm离心,倒掉乙醇。(6)加入2倍体积70 %乙醇，洗涤DNA2次。(7)吹干，溶于适量TE (ρΗ8.0)缓冲液中。
(8)加入RNase溶液，使终浓度达到10mg/ml，35°C处理20min。然后用酚:氯仿:异戊醇(24: 24: I)，抽提一次，上请液再用氯仿:异戊醇(24: I)，抽提一次。用两倍体积无水乙醇沉淀出DNA。再用75%乙醇洗两次，吹干，DNA溶于无菌水中放于-20°C备用。2、聚合酶链式反应(PCR)检测(I)反应体系以质粒DNA作为阳性对照，以未经转化的组培苗作为阴性对照，对转化再生苗进行PCR扩增检测。根据CcRIPII基因序列设计一对特异性引物。35S-F(5/ 正向引物)AGG GAT GAC GCA CAATCC CAC TAT (位于 pCABIA2300_35S载体克隆位点的_150bp处)。GSP3-403R(3/ 反向引物)CAATTG CAG GGT CAG GAT TAT CTT CAC GT (此引物的5'位于RIPII基因CcRIPII中间的403碱基的位置)。PCR 产物是 550bp。正向引物设计在5'端载体序列上，反向引物设计在目的基因的3'端，用这对特异性引物扩增出的PCR产物为550bp，包含是目的基因的全序列，这样可以保证PCR扩增产物只能来自导入的CcRIPII基因序列，而不可能来自内源基因序列，提高了检测的特异性和准确性。Southern杂交所用的探针是PCR扩增出的片段，经32P_dCTP标记后用作Southern杂交的探针，PCR和Southern杂交检测双重阳性的则被认为是转基因植株。I)反应液ddH2016 μ I
IOX PCRBuffer2μ1
dNTPI μ I
正向引物0.8 μ I
反向引物0.8 μ I
模板DNAI μ I
Taq 酶0.4 μ I (5U/ul)
总体积22 μ I2)反应程序预变性:94°C,5min`
在以下条件下扩增35个循环:变性，94°C 45sec ;复性，55°C 45sec ;延伸，72°C，
Imin ；最后延伸:72°C，5min:4°C，保存备用。五、附图及其说明附图1.CcRIPII基因的编码序列(A)和推导出的氨基酸序列(B)。图1-A.香樟核糖体失活蛋白基因的编码序列，起始码子为ATG，终止密码子TGA。图1-B.香樟核糖体失活蛋白的氨基酸序列，-符号示出终止密码位置附图2.克隆目的基因所用的双元载体PCAMBIA2300的结构示图。附图3.CcRIPII基因植物表达载体pCAMBIA2300_CcRIPII的结构图。
权利要求
1.本发明从我国抗病毒病的香樟树中克隆了一种新的核糖体失活蛋白基因CcRIPII。CcRIPII基因不含内函子，但含有完整的ORF区域，其编码序列全长1758个核苷酸(29-1786)，编码585个氨基酸和一个终止密码子(TGA)(图1)。
2.用pCAMBIA2300为载体构建了CcRIPII的植物表达载体pCAMBIA2300_CcRIPII (图3)，在建成的表达载体中CaMV35S启动子、目的基因、终止子OCS和标记基因NPTII整合在一起构建成嵌合基因，有利于转化和表达。
3.用pCAMBIA2300-CcRIPII转化宁阳大枣，获得了转基因植株。
4.CcRIPII是国际上克隆并完成对林木遗传转化的第一个木本植物核糖体失活蛋白基因，我们拥有完全独立自主的知识产权。CcRIPII基因来源于木本植物，因此转化木本植物更容易表达，转基因植株对环境没有不良影响。它的克隆和对林木遗传转化的成功对木本植物抗病毒研究和遗传育种具有重要意义。
5.根据CcRIPII基因序列设计一对特异性PCR引物。
35S-F(5/ 正向引物)AGG GAT GAC GCA CAA TCC CAC TAT(位于pCABIA2300_35S载体克隆位点的_150bp处)。
GSP3-403R(3/ 反向引物)CAA TTG CAG GGT CAG GAT TAT CTT CAC GT(此引物的 5'位于RIPII基因CcRIPII中间的403碱基的位置)。
PCR产物是550bp。
由于正向引物设计在5'端载体序列上，反向引物设计在目的基因的3'端，这样可以保证PCR扩增产物只能来自导入的CcRIPII基因，而不可能来自内源基因序列，提高了检测的特异性和准确性。另外，用这对特异性引物扩增出的PCR产物为550bp，大小合适，检测方便，效率高。
1)反应液: ddHiO16 μ IIOX PCR Buffer2u\ dNTPI μ I 正向引物0.8μ1 反向引物0.8 μ I 模板DNAI μ ITaq 酶 0.4 μ I (5U/ul) 总体积22 μ I 2)反应程序 预变性:94°C，5min 在以下条件下扩增35个循环:变性，94°C 45sec ;复性，55°C 45sec ;延伸，72°C，Imin ； 最后延伸:72°C，5min4°C，保存备用。
全文摘要
本发明根据已经报导的植物核糖体失活蛋白基因的保守序列设计PCR引物，经过同源扩增获得了一种新的香樟树核糖体失活蛋白基因CcRIPII的部分序列。然后通过RACE扩增获得了该基因全长cDNA序列。CcRIPII基因不含内函子，但含有完整的ORF区域，ORF全长1758个核苷酸，编码585个氨基酸和一个终止密码子(TGA)。构建了CcRIPII基因的植物表达载体pCAMBIA2300-CcRIPII，用pCAMBIA2300-CcRIPII转化宁阳大枣获得了转基因植株。CcRIPII是国际上克隆并完成对林木遗传转化的第一个木本植物核糖体失活蛋白基因。
文档编号C12N15/84GK103184226SQ201110460840
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者冯殿齐, 翁曼丽, 刘静, 王斌, 赵进红, 罗磊, 黄艳艳, 张虹 申请人:泰安市泰山林业科学研究院,翁曼丽, 翁曼丽