专利名称：tdcBC/pckA基因失活的微生物和利用该微生物生产L－苏氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种产生L-苏氨酸的微生物和一种利用该微生物生产L-苏氨酸的方法。更具体地说，本发明涉及一种包含染色体上失活的tdcBC和pckA基因以及由于这两个基因的失活而显著地提高L-苏氨酸的产量的微生物，以及利用所述的微生物生产L-苏氨酸的方法。
背景技术：
L-苏氨酸以作为必需氨基酸为人所知，其已经广泛地用作动物饲料和食物的添加剂、动物生长的刺激剂，以及药物水溶液的组分和其它用于医药产品的原料。目前L-苏氨酸仅仅在包括日本的Ajinomoto公司在内的发达国家的五家公司得以生产，并且比赖氨酸昂贵两至三倍，所述赖氨酸由于其在国际市场上每吨5,000-6,000美元的高价而为人所知是非常贵重的。因此，L-苏氨酸具有在世界市场上的高增长潜力。
目前L-苏氨酸仅仅通过主要利用来源于野生型微生物的突变株，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)和普罗威登斯菌属(Providencia)的微生物发酵技术得以生产。这些突变株的实例包括对氨基酸类似物或药物具有抗性的突变株，以及它们的用于二氨基-庚二酸、甲硫氨酸、赖氨酸和异亮氨酸的营养缺陷型(日本专利公开No.平成2-219582；韩国专利申请No.1998-32951；Appl.Microbiol.Biotechnol.，29550-553，1988)。然而，由于它们对二氨基-庚二酸或异亮氨酸的营养缺陷型的性状，就其具有低L-苏氨酸产量和仅在补充了昂贵的二氨基-庚二酸或异亮氨酸的培养基中得以生长而言，所述的突变株是不适宜的。也就是说，在利用生长需要二氨基-庚二酸的突变株的情况下，L-苏氨酸的发酵生产需要高成本。同样地，如果利用异亮氨酸营养缺陷型，用于该营养缺陷型的发酵培养基必须补充昂贵的异亮氨酸，导致增加L-苏氨酸的生产成本。
这些问题通过使用异亮氨酸渗漏突变型得以解决，如韩国专利公开No.92-8365中公开的，其在培养基中不需要异亮氨酸以及比已知菌株产生更高水平的L-苏氨酸。然而，该传统的突变方法在选择能产生高水平的L-苏氨酸的新细菌菌株方面也是费时和低效的，并具有限制L-苏氨酸产量提高的最大缺点。
在这方面，不使用营养缺陷型并用于大量生产L-苏氨酸的其它的方法已经得以发展，该方法使用L-苏氨酸生产微生物的重组体，所述微生物通过代谢遗传工程技术提高了参与L-苏氨酸生物合成的酶的活性。也就是说，对应于参与L-苏氨酸代谢的酶的基因通过使用遗传重组技术得以分离、克隆入合适的基因载体，以及导入微生物突变株来提高该突变株的L-苏氨酸产量。
本发明者以前开发了利用所述的代谢遗传工程技术来研制L-苏氨酸生产菌株的方法，如韩国专利申请No.2001-6976所公开的。具体地脱，L-苏氨酸的高产量可通过使用重组体微生物得以实现，该微生物在染色体上具有一个或多个拷贝的编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(在下文中，简称为″ppc″)和操纵子，所述羧化酶可催化作为由磷酸烯醇丙酮酸(PEP)起始的L-苏氨酸生物合成的前体的草酰乙酸(OAA)的形成，所述操纵子包括编码三种参与由天冬氨酸起始的L-苏氨酸生物合成的酶，即天冬氨酸激酶1-高丝氨酸脱氢酶(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)和苏氨酸合酶(thrC)的基因。
L-苏氨酸经由多步骤途径从天冬氨酸得以合成，其中天冬氨酸由OAA形成，而OAA则从PEP通过PPC转化而来。当葡萄糖以较高水平存在于培养基时，与细菌生长速率和TCA循环的总速率相比，L-苏氨酸生物合成受到抑制。在该情况下，ppc基因表达受到抑制，而编码催化OAA转化为PBP的PEP羧基激酶(在下文中，简称为″pckA″)的基因的表达得到提高。增加的pckA水平导致PEP从作为氨基酸生物合成的前体的OAA的形成，其中其它的副产物从PEP得以合成(Goldie H.Medina V.，Mol.Gen.Genet.，220(2)191-196，1990；Dang等人，E.coli and Salmonella，1191-102，1996)。因此，pckA基因应当基本上受到失活，以便通过增加负责L-苏氨酸合成的代谢途径的通量来高水平生产L-苏氨酸。
另一方面，已经知道用于L-苏氨酸降解的几种途径，其中包括下列三种途径。其一涉及由苏氨酸脱氢酶起动的产生α-氨基β-丁酮酸的途径。α-氨基-β-丁酮酸可被转化为乙酰辅酶A和甘氨酸，或被自然降解为可转化为丙酮酸的氨基丙酮。第二种途径涉及苏氨酸脱水酶产生α-丁酮酸，其中α-丁酮酸进一步被分解代谢为丙酰辅酶A并最终代谢为TCA循环中间体，琥珀酰辅酶A。第三种途径利用苏氨酸醛缩酶(Neidhardt F.C.等人，Escherichia coli andSalmonellacellular and molecular biology，第二版，ASM出版社，Washington DC，pp369-370)。在它们之中，苏氨酸脱水酶是可在缺氧和高含量苏氨酸下表达的操纵子。通过经由遗传重组技术特异失活该操纵子基因(tdcBC)(韩国专利申请No.2002-015380)，本发明者研制了L-苏氨酸产量得到提高的微生物。
在另一方面，国际专利公开No.WO 02/29080 A2公开了利用pckA基因缺陷的微生物生成L-苏氨酸的方法，该微生物通过将携带部分缺失pckA基因的重组载体导入该微生物的野生型菌株得以制备。然而，至于L-苏氨酸的产量该微生物是有问题的，因为在该微生物中用于合成的L-苏氨酸的降解和胞内流入的途径依旧是激活的。
为了解决现有技术中遇到的问题，对于制备即使当生长在含有高浓度的葡萄糖的培养基中也能产生高水平的L-苏氨酸和并不降解所产生的L-苏氨酸的微生物的方法，本发明者进行了充分和彻底的研究而获得本发明，结果发现当微生物染色体的pckA基因通过遗传重组技术得以失活时，本发明者研制的tdcBC操纵子-基因剔除的微生物与常规的L-苏氨酸生产微生物相比提高了L-苏氨酸的产量。
因此本发明的目的是提供能够有效地生产高水平的L-苏氨酸的微生物。
发明内容
为了达到以上目的，本发明提供了新的大肠杆菌菌株，其包含在染色体上失活的tdcBC和pckA基因。
在tdcBC/pckA基因失活的大肠杆菌菌株中，pckA基因通过将两端各自含有抗生素抗性基因和位点特异性重组酶结合位点的外源pckA基因片段导入大肠杆菌菌株得以失活，所述大肠杆菌菌株含有L-苏氨酸降解相关操纵子，即失活的tdcBC，然后使得外源pckA基因片段和染色体上的pckA基因进行同源重组以失活染色体的pckA基因。
此外，本发明提供了利用tdcBC/pckA基因失活的大肠杆菌菌株生产L-苏氨酸的方法。
附图的简要说明本发明以上的和其它目的、特征和其它优势可从下列连同附图一起所作的详细描述中得以更加清楚地理解，其中
图1是显示了克隆pckA基因的过程的示意图。
图2是显示了制备重组体微生物的示意图，其中导入了含有氯霉素抗性基因(cat)和loxP位点的pckA基因片段(ΔpckA∷loxpcat)；和图3是显示了Southern印迹法的结果照片，其中发现氯霉素抗性基因(cat)被插入L-苏氨酸生产大肠杆菌菌株的染色体上的pckA基因(泳道1在氯霉素存在的情况下根据本发明所选择的重组体菌株；泳道2亲本菌株TRN212；和泳道3标准带分子量)。
发明详述大肠杆菌菌株，其包含通过遗传重组而特异性失活的L-苏氨酸降解相关操纵子并且由于操纵子的失活而提高了L-苏氨酸的产量，可用作本发明的亲本菌株。优选的亲本菌株是大肠杆菌菌株TRN212(保藏号KCCM-10353；韩国专利申请No.2002-015380)，是由本发明者研制的。
本发明特征在于通过在亲本大肠杆菌菌株中失活抑制L-苏氨酸合成中所涉及的pckA基因而制备新的产生高水平和高产量的L-苏氨酸的大肠杆菌菌株，所述亲本菌株含有失活的L-苏氨酸降解相关操纵子(tdcBC)。tdcBC和pckA基因的失活可防止由tdcBC操纵子的翻译产物所介导的L-苏氨酸的降解和胞内流入，并且可防止由pckA基因的翻译产物所介导的对L-苏氨酸合成的抑制，从而导致L-苏氨酸的高水平生产。
因此，本发明提供了tdcBC/pckA基因失活的大肠杆菌菌株，其通过将包含在其两端各具有位点特异性重组酶结合位点的抗生素抗性基因的外源pckA基因片段导入大肠杆菌菌株得以制备，所述大肠杆菌菌株含有L-苏氨酸降解相关操纵子，即失活的tdcBC，然后使得外源pckA基因片段和染色体上的pckA基因进行同源重组以失活染色体的pckA基因。
此外，亲本大肠杆菌菌株染色体上的pckA基因通过除去被插入染色体pckA基因的抗生素抗性基因得以失活，所述抗性基因的去除是通过细菌菌株中位点特异性重组酶表达的活性以及在染色体pckA基因中一拷贝位点特异性重组酶的结合位点的存在进行的。
细菌染色体上的pckA基因的失活通过与外源pckA基因片段的同源重组得以实现。外源pckA基因片段通过抗生素抗性基因在其中的插入得以失活。该外源失活的pckA基因片段被导入亲本大肠杆菌菌株，然后在细菌染色体上的pckA基因和外源失活的pckA基因片段之间进行双交换重组，以失活细菌染色体上的pckA基因。在外源失活的pckA基因中抗生素抗性基因的存在促进pckA基因失活的细胞的选择。
用于失活pckA基因的抗生素抗性基因的非限制性实例包括氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
另一方面，在选择了pckA基因失活的大肠杆菌菌株后，使位点特异性重组酶得到表达以除去已插入细菌染色体的抗生素抗性基因。也就是说，抗生素抗性基因是连同位点特异性重组酶结合部位一起插入细菌染色体上的pckA基因，并通过在细菌菌株中表达的位点特异性重组酶的活性得以去除。位点特异性重组酶的非限制性实例包括FLP、Cre和XerC/D的结合位点。当同一细菌菌株的另一个基因需要被失活时，抗生素抗性基因的去除可使同样的抗生素抗性基因再次用作选择性标记。
在本发明中，为了失活染色体的pckA基因，利用了含有在其每一末端都与loxP位点连接的氯霉素抗性基因的pckA基因片段。loxp位点可被位点特异性重组酶Cre识别。通过Cre重组酶在大肠杆菌菌株中的表达活性，位于两个loxp位点间的抗生素抗性基因从细菌染色体上得以除去。
Cre重组酶在大肠杆菌菌株中的表达可通过本领域的已知方法得以实现。在本发明中，携带cre基因的质粒pJW168，被导入大肠杆菌菌株以在其中表达Cre酶。
在本发明的一个实施方案中，部分pckA基因通过利用分离自生产L-苏氨酸的、并含有失活的tdcBC操纵子的大肠杆菌菌株的模板基因组DNA的PCR得以扩增。扩增的部分pckA基因被克隆入pT7Blue载体(Novagen Co.)，从而获得含有部分pckA基因的重组载体pT7Blue/pckA。此外，含有氯霉素抗性基因和loxP位点的DNA片段，loxpcat2，可从ploxpcat2质粒(Beatriz Palmeros等人，Gene，247255-264，2000)获得，并连接于NruI消化的pT7Blue/pckA，从而生成含有pckA基因片段的重组质粒pT7ΔpckAloxpcat，所述pckA基因片段包含氯霉素抗性基因和loxP位点。因此，本发明提供如以上制备的重组质粒pT7ΔpckA∷loxpcat。
在本发明的另一个实施方案中，含有在其每一末端都与loxP位点连接的氯霉素抗性基因的pckA基因片段被导入含有tdcBC操纵子的大肠杆菌菌株TRN212，所述操纵子通过利用在其两端各具有loxP位点的卡那霉素抗性基因的同源重组得以失活。然后，在细菌染色体的pckA基因与含有氯霉素抗性基因和loxP位点的外源pckA基因片段之间进行同源重组，从而生成含有染色体上失活的tcdBC基因和pckA基因的重组大肠杆菌菌株。重组大肠杆菌菌株被命名为″FTR2717″，并于2003年3月20日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM-10475。
重组大肠杆菌FTR2717菌株表现下列特征(1)与其野生型相比，该菌株具有对苏氨酸类似物、赖氨酸类似物、异亮氨酸类似物和甲硫氨酸类似物的抗性；(2)其染色体包含内源ppc基因和内源苏氨酸操纵子，所述操纵子含有thrA、thrB和thrC基因以及一个或多个拷贝的外源ppc基因和外源thrA、thrB和thrC基因；(3)其包括L-苏氨酸降解中所涉及的并被失活的操纵子基因tdcBC；和(4)其包括抑制L-苏氨酸合成中所涉及的并被失活的pckA基因，以致在培养基中高浓度葡萄糖时该菌株可产生高水平的L-苏氨酸。
具体实施例方式
通过下列所列出的用于举例说明，但并非理解为限制本发明的实施例可实现对本发明的更好理解。
实施例1pckA基因的克隆制备携带pckA基因的重组载体(参见图1)。首先，利用QIAGEN Genomic-tip系统(QIAGEN Co.)从包含失活的tdcBC操纵子的产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株TRN212(保藏号KCCM-10353)中分离细菌基因组DNA。将分离的基因组DNA用作模板，进行PCR以扩增pckA基因的约1.5kb部分区域。在PCR中，使用分别由如SEQ ID NOs1和2所示的正向引物和反向引物组成的引物组。PCR条件包括30循环的在94℃变性30秒、在55℃退火30秒以及在72℃延伸1分30秒。
将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，并从凝胶上切下1.5kb的带。使用DNA凝胶纯化试剂盒(QIAGEN Co.)从切下的带中纯化1.5kb的DNA片段，并通过在16℃平末端连接法将其克隆入EcoRV消化的pT7Blue载体(NovagenCo.)，从而生成含有部分pckA基因的重组载体pT7Blue/pckA。然后，用pT7Blue/pckA转化大肠杆菌NM522菌株，并涂抹在含有氨苄青霉素(100mg/L)的固体培养基(LB1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)上，随后在37℃温育过夜。将固体培养基上长出的菌落接种到含有氨苄青霉素的3ml液体培养基中，随后在37℃温育过夜。使用QIAGEN小型制备试剂盒(QIAGEN Co.)从培养的细菌中分离质粒DNA，并分析其大小。也可通过使用NruI和StuI进行限制性作图来分析pckA基因的取向。此后，用NruI消化质粒DNA，并在0.7％琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶上切下约4.3kb的带，并从所述带中纯化4.3kb的片段。
实施例2构建携带失活的pckA基因的重组载体，并制备pckA基因失活的大肠杆菌菌株2-1)构建携带失活的pckA基因的重组载体通过使用HincII消化ploxpcat2质粒(携带在其两末端各具有loxP位点的氯霉素抗性基因的质粒；Beatriz Palmeros等人，Gene，247255-264，2000，G.Gosset教授，墨西哥大学)，获得含有在其两末端各具有loxP位点的氯霉素抗性基因的1.2kb的DNA片段loxpcat。通过平末端连接法将1.2kb的DNA片段连接到NruI消化的实施例1中制备的pT7Blue/pckA中，从而生成含有失活的pckA基因的约5.7kb的重组载体pT7ΔpckAloxpcat(参见图2)。
2-2)制备pckA基因失活的大肠杆菌菌株将实施例2-1)中制备的pT7ΔpckAloxpcat重组载体导入大肠杆菌NM522菌株。将转化的NM522菌株涂抹到含有氨苄青霉素和氯霉素的固体培养基(LB1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)上，随后在37℃温育过夜。将固体培养基上长出的菌落接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的3ml液体培养基中，随后在37℃温育过夜。使用QIAGEN小型制备试剂盒从培养的细菌中分离质粒DNA，并分析其大小以及所插入的pckA基因的取向。此后，用PstI和KpnI双酶切质粒DNA，并在0.7％琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶上切下约2.7kb的带，并从所述带中纯化2.7kb的片段(ΔpckA∷loxpcat)。
通过电穿孔法，将含有在其两末端各具有loxP位点的氯霉素抗性基因的pckA基因片段，ΔpckAloxpcat，导入产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株TRN212(保藏号KCCM-10353)。此后，将转化的TRN212菌株涂抹在含有氯霉素的固体培养基上，以仅仅挑选氯霉素抗性细胞，其中所挑选的细胞其染色体上的pckA基因被外源pckA基因片段(ΔpckA∷loxpcat)取代。根据如以下实验实施例1的相同方法，通过Southern印迹分析来评价所挑选的克隆是否染色体pckA基因被特异性剔除。
所挑选的克隆，其通过Southern印迹分析被鉴定具有在染色体上特异性剔除的pckA基因，用含有编码位点特异性重组酶识别loxP位点的cre基因的pJW168质粒(墨西哥大学的Guillermo Gosset教授惠赠)进行转化。将转化的细胞在含有10mM的L-阿拉伯糖的培养基中培养过夜，以除去插入到细菌染色体中的氯霉素抗性基因。然后，将培养物流体稀释107倍，并涂抹在补充了氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上，随后在30℃温育过夜。将固体培养基上生长的每100个菌落各自接种到含有或不含氨苄青霉素的3ml LB液体培养基中，随后于30℃温育过夜。确定在含有氯霉素的培养基中被杀死而在不含氯霉素的培养基中存活的菌落。在该挑选中，仅仅具有氯霉素抗性基因缺失的克隆被挑选出。
实验实施例1通过Southern印迹法评价染色体上pckA基因的剔除将作为亲本菌株的TRN212菌株和实施例2-2)中挑选的一个氯霉素抗性克隆在含有氯霉素(15mg/L)的3ml液体培养基中培养过夜。然后，使用QIAGEN基因组试剂盒20从培养细胞中分离基因组DNA，并用EcoRV消化过夜。所得的DNA片段在0.7％琼脂糖凝胶上根据它们的大小得以分离。电泳后，通过毛细管转移法(Molecular Cloning，Vol 1.，pp6.31-6.38)将分离的DNA片段转移到尼龙膜(Biodyne B membrane，Young Sci.)上过夜。干燥膜，然后暴露于紫外线(120mJ/cm2，SpectroLinkerTM)以固定膜上的DNA片段(Molecular Cloning，Vol 1.，pp6.45)。所得到的膜在预杂交溶液I(Roche #1093657)中于55℃温育2小时，然后与变性DNA探针在杂交炉(BAMBINO 230300)中于55℃杂交过丸如下制备DNA探针。首先，使用QIAGEN试剂盒分离ploxpcat2质粒，并用HincII消化以生成含有在其两末端各具有loxP位点的氯霉素抗性基因的DNA片段(约1.2kb)。将1.2kb的片段置于沸水5分钟，并置于冰上快速冷却，从而生成单链DNA。使用DIG标记和检测试剂盒(Roche #1093657)将单链DNA用DIG-UDP于37℃温育过夜进行标记。
杂交后，用洗液I和II(Roche #1093657)洗膜以除去非特异性附着的DNA分子。使用预杂交液II(Roche #1093657)将洗过的膜于室温封闭30分钟，然后与特异结合DIG-UTP的抗DIG抗体于室温反应30分钟。用洗液III(Roche#1093657)洗膜以除去非特异性附着的抗DIG抗体，并使用标记和检测试剂盒(Roche #1093657)于室温显色，直到出现带。结果如图3所示。
如图3所示，在亲本菌株TRN212的情况时，检测不出带(泳道2)，因为TRN212菌株不含有氯霉素抗性基因。相反，根据本发明所挑选的氯霉素抗性克隆显示一条约3.6kb的带(泳道1)。这些结果表明所挑选的克隆在其染色体上含有氯霉素抗性基因。
实施例3比较所挑选的克隆在锥形瓶中培养L-苏氨酸的产率在实施例2-2)最终挑选的重组大肠杆菌克隆之中，其中除去了所导入的氯霉素抗性基因，评价30个克隆的L-苏氨酸生产率。将它们中每个在含有根据以下表1所列的组分而制备的培养基的锥形瓶中进行培养。然后，评价每个培养物流体的L-苏氨酸产率。简而言之，在30个克隆中每个在LB固体培养基上于32℃生长后，将一接种环的用于每个克隆的单菌落接种于25ml的培养基中，并于32℃以250转/分进行培养48小时。在离心每个培养物流体后，上清液用蒸馏水稀释250倍。通过HPLC测量稀释的上清液中L-苏氨酸浓度。结果如以下表2所示。
表1
表2
亲本菌株TRN212显示23g/L的L-苏氨酸产率。如表2所示，在30个测试的克隆中，发现28个具有比TRN212菌株更高的L-苏氨酸产率。具体地说，9个克隆显示高于26g/L的L-苏氨酸产率，其高于TRN212菌株的产率约13.04％。在30个克隆中，挑选一个具有最高的L-苏氨酸产率(高于26g/L)的克隆，并命名为“FTR2717(保藏号KCCM-10475)”。
工业实用性如上文描述，本发明提供pckA基因被失活的微生物，其通过将抗生素抗性基因导入可产生高水平L-苏氨酸的亲本大肠杆菌菌株的染色体DNA得以制备，也就是说，含有L-苏氨酸降解中所涉及的、通过DNA重组技术被失活的tdcBC操纵子的大肠杆菌菌株。由于菌株的染色体tdcBC操纵子被失活，根据本发明的微生物具有防止L-苏氨酸降解和胞内流入的作用。此外，由于抑制L-苏氨酸合成中所涉及的pckA基因的失活，本发明的微生物具有L-苏氨酸生物合成的更多活化途径。由于甚至在高浓度葡萄糖的存在下也能高水平和高产量地产生L-苏氨酸，因此本发明的微生物可用于L-苏氨酸的大量生产。
涉及保藏的微生物或其它生物材料的说明
序列表<110>CJ Corp.
<120>tdcBC/pckA基因失活的微生物和利用该微生物生产L-苏氨酸的方法<150>KR10-2003-0021458<151>2003-04-04<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR的正向引物<400>1gttaacaccc ccaaaaagac 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR的反向引物<400>2gataaagagt tcgcagttcg t2权利要求
1.一种包含被失活的tdcBC和pckA基因的大肠杆菌菌株。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌菌株，其中通过将含有在其两末端各具有一个位点特异性重组酶结合位点的抗生素抗性基因的外源pckA基因片段导入含有失活的L-苏氨酸降解相关操纵子tdcBC的亲本大肠杆菌菌株中，然后在外源pckA基因片段和染色体上的pckA基因之间进行同源重组以失活染色体pckA基因而使pckA基因失活。
3.如权利要求2所述的大肠杆菌菌株，其中pckA基因通过除去插入其中的抗生素抗性基因而得以失活，所述抗性基因的去除是通过在大肠杆菌菌株中表达的位点特异性重组酶的活性和在染色体pckA基因中一拷贝位点特异性重组酶的结合位点的存在进行的。
4.如权利要求2所述的大肠杆菌菌株，其中位点特异性重组酶是FLP、Cre或XerC/D。
5.如权利要求2所述的大肠杆菌菌株，其中菌株是包含染色体上失活的pckA基因的大肠杆菌FTR2717(KCCM-10475)，所述pckA基因通过将含有在其两端各具有一个loxP位点的抗生素抗性基因的外源pckA基因片段导入含有失活的L-苏氨酸降解相关操纵子tdcBC的亲本大肠杆菌菌株中得以失活。
6.一种利用权利要求1至5中任一权利要求所述的大肠杆菌菌株生产L-苏氨酸的方法。
7.一种包含具有氯霉素抗性基因和loxP位点的pckA基因片段的重组质粒pT7ΔpckA::loxpcat，其中通过将部分pckA基因克隆入pT7Blue载体以生成pT7Blue/pckA质粒、获得含有氯霉素抗性基因和来自ploxpcat2质粒的loxP位点loxpcat2的DNA片段、并将loxpcat DNA片段连接到NruI消化的pT7Blue/pckA质粒而制备重组质粒。
全文摘要
公开了包含染色体上失活的tdcBC和pckA基因的微生物，其由于这两个基因的失活可显著地提高L－苏氨酸的产量。本发明也公开了利用该微生物生产L－苏氨酸的方法。该微生物通过重组技术将抗生素抗性基因导入含有失活的、L－苏氨酸降解相关操纵子基因tdcBC的细菌菌株的染色体上的pckA基因中而得以制备。该微生物具有由于tdcBC操纵子基因的失活而防止L－苏氨酸降解和胞内流入的作用，并包含L－苏氨酸生物合成的多种活化途径。由于甚至在高浓度葡萄糖的存在下能高水平和高产量地产生L－苏氨酸，因此该微生物可用于L－苏氨酸的大量生产。
文档编号C12N1/21GK1768132SQ200480008692
公开日2006年5月3日 申请日期2004年4月2日 优先权日2003年4月4日
发明者朴永薰, 李炳春, 金大哲, 李珍镐, 赵载熔 申请人:希杰株式会社