专利名称：人类17号染色体1区3带3亚带区域内人肿瘤相关基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类17号染色体1区3带3亚带(17p13．3)定点克隆人肿瘤相关基因及应用。
恶性肿瘤的死亡率在我国仅次于心、脑血管疾病名列第二。在恶性肿瘤中肝癌的死亡率列在肺癌、胃癌之后居第三位。目前对肝癌(除小肝癌外)缺乏有效的诊治手段。人们普遍认为癌的发生是一种多因子多步骤的复杂事件，是多种癌基因激活和抑癌基因失活的结果。其中抑癌基因可能更为关键。因此寻找肿瘤抑癌基因是目前研究的热点之一。基因经常通过一个等位基因的丢失(杂合子缺失，Loss of Heterozygocity，LOH)而失去一种正常性状，LOH频发部位可能存在抑癌基因。
上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室长期从事人肝癌基因的研究，早在1991年就发现肝癌的发生与p53失活有关，该基因不仅249编码子突变，还有其它编码子出现点突变(Li D．Z；Gu JR et alCarcinogenesis 14(2)169，1993)。p53位于17p13．1。
另外对17p13．3区段内的研究结果国外也有报道。Nishida等(NoashiNishida et al．，Cancer Research 53368-372，1993)在17P上选10个多态性探针，研究人肝癌的17p LOH和p53基因突变之间的关系，他认为肝癌的发生可能与17p13．3上未被证明的肿瘤抑制基因有关。Schultz等(DavidC．Schultz，et al．，Cancer Research 561997-2002 1996)，用等位基因丢失作图和定点克隆方法证明了两个新基因OVCA1和OVCA2，定位于17p13．3这两个新基因，在正常的卵巢上皮细胞有表达，在卵巢瘤或卵巢瘤细胞株中表达减少或无表达。Wales等(MicheleM．Wales，et al．，Nature Medicine570-577，1995)，通过肿瘤组织DNA高度甲基化分析，在17p13．3区域发现一个后选基因Hic-l，它是一个锌指结构转录因子，在正常组织普遍表达，在肿瘤细胞中表达降低。
上述已有技术不足之处是1．没有报道肝癌组织LOH频率的最小范围和位点。2．上述发现的后选基因与肝癌的关系未见报道。3．我们从该位点中分离出的cDNA克隆，其结构、功能以及与肝癌及其它癌的相关性均未见报道。
这些基因在诊断、治疗和预防肿瘤中具有潜在的应用价值，因此，分离和克隆与人肝癌或其它癌有关的癌相关基因的研究工作，是很有意义的。
本发明的目的是提供一类人类17号染色体l区3带3亚带区域内人肿瘤相关基因，即从人染色体17p13．3在肝癌中共同存在的LOH的最高频率的位点中分离、克隆与癌相关基因。
本文中癌相关基因的定义是1．在某一种癌及几种癌的病人中存在一个或两个等位基因的缺失或突变；另一种情况是癌与非癌组织在mRNA表达存在差异。
2．上述改变与某一种或几种癌的发生(Development)或演进(Progression)，包括浸润、转移有关。
用17p13．3区域内LOH最高频率位点对应的P579克隆为探针筛选人正常肝cDNA文库，得到3个新的cDNA克隆，用RACE法获得全长cDNA，并得到全长核苷酸序列和编码的氨基酸序列，通过Northern杂交，PT-PCR和Southern杂交，证明了3个新基因与肝癌密切相关，体外细胞实验证明，对肝癌细胞生长有抑制作用。
1．17p13．3区域内LOH共同缺失最小范围(0．5-0．6Mb)的确定用17p13．3区段内YNZ22．2多态性位点的序列为探针，发现30％以上的肝癌有LOH。后来又选用17p13．3区域内14个多态性位点标志，采用PCR方法对22例肝细胞肝癌样品中杂合性丢失进行详细研究，确定了肝癌在17p13．3区域内LOH的共同缺失的最小范围为0．5-0．6Mb，缺失频率高达60-100％。
2．HC56、HC71、HC90基因克隆用对应于17p13．3中926位点的PAC579(P579)克隆(Genome System公司提供)人DNA的插入片段(100kb)为探针，筛选人正常肝cDNA文库(λgtⅡHL3006b Clontech公司)得到阳性噬菌体cDNA克隆，分离、纯化每一个噬菌体克隆的DNA插入片段，然后亚克隆在pBK-CMV表达质粒中(Strantagen公司)。用pBK-CMV质粒所具有的T3和T7引物进行两端一次反应的测序，所得核苷酸序列用BLAST程序进行同源比较。证实获得HC56、HC71和HC90 3个新cDNA克隆。对所获得的3个新基因进行cDNA完全测序和编码框架分析。同时用3个新cDNA为探针，对多种组织mRNA膜片(Clontech公司)和肝癌、癌旁组织总RNA进行Northern杂交，以确定cDNA克隆的全长大小。其中HC90克隆已含有全部编码框架，说明已得到全长cDNA。另外2个克隆根据所测序列设计引物用RACE方法(Clontech公司)分别获得HC56、HC71 2个新基因的全长cDNA。
3．HC56、HC71、HC90核苷酸、氨基酸序列测定及同源比较HC56、HC71和HC90全长cDNA克隆测序用常规方法进行。
HC56全长cDNA为4779个碱基，起始编码子在1370，ATG，终止编码子在4513，TGA，见图1。
HC71全长cDNA为1814个碱基，起始编码子在25，ATG，终止编码子在966，TAA，见图2。
HC90全长cDNA为1731个碱基，起始编码子在488，ATG，终止编码子在1284，TGA，见图3。
根据核苷酸序列得到相应编码的氨基酸序列，并进行同源比较，预测多肽或蛋白所含潜在的功能域。
HC56核苷酸编码1047个氨基酸见图1。同源比较结果未发现有同源的已知多肽或蛋白。
HC71核苷酸编码313个氨基酸见图2。同源比较显示231个氨基酸中有138个氨基酸(59％)和线虫3号染色体上32．0KD蛋白C16C10．10同源。
HC90核苷酸编码278个氨基酸见图3，同源比较显示其中小片段氨基酸序列与酵母或细菌的RNA甲基化酶同源，57个氨基酸中，阳性为29(50％)。
4．HC56、HC71和HC90三个基因肝癌相关性的证明(1)Northern杂交以HC56、CH71和HC90 cDNA为探针，对肝癌患者的癌和癌旁组织总RNA以及多种人组织(心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰)的mRNA作杂交，结果如下HC56克隆用反转录PCR(RT-PCR)方法检测9对肝癌和癌旁组织，同时用“看家”基因β-微球蛋白做内参，结果3对标本中(G2、G12、D24)癌旁组织的表达高于癌组织，1对标本中(G15)癌组织有表达，癌旁组织无表达，5对标本(G16、G11、D22、D1、G4)癌和癌旁表达无差异。见图4，说明HC56在某些肝癌组织中表达受到抑制。
多种人组织mRNA杂交结果显示在心脏、胎盘和骨骼肌中高表达，肺表达较低，其它组织表达中等。见图5。
HC71克隆Northern杂交检测8对肝癌和癌旁组织，同时用GAPDH(葡萄糖磷酸脱氢酶)作内参，结果为4对标本(D22、D24、G2、G11)中癌旁表达明显高于癌，4对标本(D1、G4、G15、G16)癌和癌旁表达无差异。见图6，说明HC71在某些肝癌组织中的表达受到抑制。
多种人组织mRNA杂交结果显示在肺和骨骼肌中无表达，心脏高表达，其它组织表达中等。见图7。
HC90克隆用RT-PCR方法检测9对肝癌和癌旁组织，同时用β-微球蛋白作内参，结果为2对标本(D24、G2)中癌旁组织的表达高于癌组织，1对标本(G15)中癌的表达高于癌旁，6对标本(D1、D22、G4、G11、G22、G16)中癌和癌旁的表达无差异。见图8，说明HC90在肝癌组织中的表达降低。
(2)Southern杂交用上述三种同样的探针对肝癌患者的癌和癌旁组织的DNA做Southern杂交，发现这些基因在肝癌组织中都有不同比例的杂合性缺失(LOH)或DNA重排，结果如下表
Southern杂交结果见图9，1O，11，12，13，14，15，16，17，18。
(3)三个基因的cDNA导入肝癌细胞体外试验结果分别用在原核或真核细胞中都可以表达的重组表达载体PBK-CMV-HC56、PBK-CMV-HC71和PBK-CMV-HC90的cDNA转染肝癌7721细胞，发现3个克隆对肝癌细胞生长都有明显的抑制作用。结果如下表
图19是空载体PBK-CMV转化7721细胞的结果，可形成克隆。
图20是含有HC56 cDNA的表达载体转化7721细胞的结果，无克隆形成，说明对7721细胞有抑制作用。
HC71和HC90的结果类似HC56，对7721细胞也有抑制作用。
本发明优点本发明的特点是首先确定了肝癌组织在17p13．3范围内有高频率LOH(60-100％)。最近本发明人实验室和国家人类基因组南方研究中心合作，对肝癌全基因组扫描也证明17p13．3是LOH的最高区域，因此有较强的针对性。另外在克隆新基因的同时，对LOH最高频率区域，进行大规模DNA测序，基因组DNA序列和克隆的cDNA序列相互比较，有利于cDNA克隆的定位和序列分析。本发明获得了3个新基因，用Southern证明在肝癌组织中存在LOH或DNA重排。Northern杂交证明在某些肝癌组织中表达受抑制，说明它们可能与肝癌的发生发展有关，是肝癌抑癌基因的候选者。体外DNA转染实验证明HC56、HC71和HC90克隆对肝癌细胞生长具有明显抑制作用。根据以上情况说明上述癌相关基因作为药物或试剂对肝癌的诊断、治疗和预防将具有很大的潜在应用价值。
图1人类17号染色体1区3段3亚带区域内人肝癌相关基因HC56全长cDNA的核苷酸序列(共4779个碱基)及克隆编码的氨基酸序列(共1047个氨基酸)。
图2人类17号染色体1区3段3亚带区域内人肝癌相关基因HC71全长cDNA的核苷酸序列(共1814个碱基)及克隆编码的氨基酸序列(共313个氨基酸)。
图3人类17号染色体1区3段3亚带区域内人肝癌相关基因HC90全长cDNA的核苷酸序列(共1731个碱基)及克隆编码的氨基酸序列(共278个氨基酸)。
图4HC56克隆在肝癌和癌旁组织中的表达(RT-PCR)G2，G4，G11，G12，G15，G16，D1，D22，D24肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织+阳性对照-阴性对照β-Mβ-微球蛋白 对照探针图5HC56克隆在人正常组织中的表达H心脏 Li肝B脑 SM股骼肌P胎盘 K肾Lu肺 Pa胰图6HC71克隆Northern杂交结果D1，D22，D24，G2，G4，G11，G15，G16肝癌患者L癌旁肝组织
K癌组织GAPDH葡萄糖脱氢酶对照探针图7HC71克隆在人正常组织中的表达H心脏 Li肝B脑 SM骨骼肌P胎盘 K肾Lu肺Pa胰图8HC90克隆在肝癌和癌旁组织中表达(RT-PCR)D1，D22，D24，G2，G4，G11，G12，G15，G16肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织NC正常肝组织β-Mβ-微球蛋白对照探针图9HC56克隆Southern杂交结果基因组DNA用MSPI酶切G7，Q7，D40，G9，D2，D43肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织图10HC56克隆Southern杂交结果基因组DNA用E-CoRⅠ酶切D12，D13，D14，肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织图11HC56克隆Southern杂交结果基因组DNA用E-CORI酶切
G5，Q9，D10肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织图12HC71克隆Southern杂交结果基因组DNA用E-CoRⅠ酶切G5，Q9，肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织图13HC71克隆Southern杂交结果基因组DNA用E-CORⅠ酶切30，31，95-3肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织图14HC71克隆Southern杂交结果基因组DNA用MSPⅠ酶切D38，D45肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织S外周血白细胞DNA图15HC71克隆Southern杂交结果基因组DNA用MSPⅠ酶切Q3，Q6，D16肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织S外周血白细胞DNA
图16HC71克隆Southern杂交结果基因组DNA用MSPⅠ酶切G3，G6肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织图17HC90克隆Southern杂交结果基因组DNA用E-CoRⅠ酶切G5，Q9，D10，D12，D13，D14肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织图18HC90克隆Southern杂交基因组DNA用E-CoRⅠ酶切12，27，28肝癌患者L癌旁肝组织K癌组织图19pBK-CMV载体转染7721细胞图20pBK-CMV-HC56转染7721细胞图21重组PBR-CMV-CHx表达载体构建图本发明通过以下的实施例作进一步阐述。
实施例1HC56、HC71和HC90的cDNA克隆1．1探针制备和标记从含有P579(Genome System公司提供)菌的平板上挑一个PAC单菌，接种在5ml LB中(含25μg／ml卡那霉素)37℃ 3000rpm振摇过夜，在75ml LB中加入2．5ml过夜培养物振摇1．5小时，加入IPTG至终浓度0．5mM诱导继续生长5小时后收获细菌离心10，000g 10分钟，细菌沉淀按“分子克隆”(美J．Sambrook，E．F．Fritsch，T．Maniatis．金冬雁，黎孟枫等译。1992年第二版，科学出版社)书中抽提质粒DNA的方法制备PAC DNA，约获得10μgp579DNA。
取P579DNA，用Not Ⅰ酶切37℃×2-3小时，插入片段约100Kb，用低熔点胶回收DNA片段做为探针。
取200-300ng上面纯化的DNA片段，用(32P-αdATP或32p-αdCTP)采用随机引物进行标记，操作步骤按试剂盒说明书进行(Megaprime DNAlabelling system，Amersham intematoanalplc)．1．2筛选克隆HC56、HC71和HC90从human liver 5’-stretch pluscDNA library(Plc CgtⅡ HL3006b)筛选。将cDNA文库的噬菌体溶液按每块平皿50，000pfu铺制30块平皿(直径150mm)，41℃培养3-5小时，至噬斑直径为0．5mm且相邻噬斑未联合时，从培养箱取出平皿放4℃至少1小时。从冰箱取出平皿放室温轻轻的将硝酸纤维素滤膜(Hybond-c AmershamLIFE Science)铺于平板上，用注射器以碳素墨水作4个点以定方向，取下滤膜再按同样操作铺另一张硝酸纤维素滤膜作为复片(记号按原来的碳素墨水点作标记)。取下滤膜碱变性5分钟(0．5mol NaOH-1．5mol NaCl)，中和5分钟(1mol Tris-Hil pH7．4，1．5mol NaCl)转移至6×SSC中稍作浸泡，置3MM滤纸上干燥，然后80℃烘膜2小时。
1．3预杂交膜片在预杂交液中65-68℃杂交6-8小时。预杂交液含有如下成分6×SSC，5×Denhart’s，0．5％SDS，变性的鱼精DNA 200μg／ml变性的胎盘DNA 100μl／ml和变性的混合DNA(γDNA5．8，γDNA7．3和PBR322质粒DNA，各为30μg／ml)。
1．4杂交已标记的300μl探针溶液中加入Cot-1 DNA 1mg混合DNA各50μg 20×SSC 250μl，100℃煮沸15分钟冰上放置10分钟，60-65℃水浴封闭杂交20分钟，冰上放置20分钟，加入到有膜片的预杂交液中，65-68℃杂交16-24小时。杂交完成后弃去杂交液，用42℃预温的2×SSC-0．1％SDS溶液漂洗膜片2次，每次10分钟，一面洗一面用同位素监测仪监测，调整洗膜片的时间和温度，洗涤结束后进行放射自显影。用同样的方法进行第二、三轮筛选，最后得到阳性单克隆，挑取单个的阳性噬菌体斑(phage)放在1ml SM缓冲液中加1滴氯仿，放在室温或4℃做为阳性单克隆的贮存液(phage stock)。通过筛选得到3个阳性噬菌体克隆HC56、HC71和HC90。
实施例2阳性噬菌体克隆HC56、HC71和HC90重组表达载体pBK-CMV-HC56、pBK-CMV-HC71、pBK-CMV-HC90的构建(亚克隆)见图21。
取20μl噬菌体克隆HCX(X=56、71、90)贮存液加100μl Y1090菌(过夜生长用10mM MgSO4处理过)37℃温育20分钟加3．5ml，50℃保温的0．7％的LB琼脂糖，铺在含有1％琼脂胶的平皿上(直径90mm)37℃温育过夜，取出平皿，每块加3ml SM溶液4℃过夜，收集含有噬菌体的溶液。
取150μl板扩的噬菌体加lml 10mM MgSO4处理过的Y1090菌37℃温育15分钟，加40ml LB(含1／100 0．5M CaCl2)37℃，强烈振摇直至液体由混浊变清(3小时左右)加1ml氯仿37℃振摇20分钟，4000rpm离心10分钟，上清液加入50μlRNaseA／DNase溶解液37℃温育1小时，4℃过夜，然后离心10000rpm×10分钟，上清进行超离心，27000rpm×70分钟。取沉淀加0．5ml SM溶解转移到1．5ml的小离心管中加入5μl蛋白酶K和1／5体积的0．5M STE 50℃温育30分钟，酚／氯仿抽提最后酒精沉淀得phageDNA。phage DNA用E-CoRⅠ酶切，用胶回收DNA片段(胶回收试剂盒上海华舜生物工程有限公司)。表达载体PBK-CMV(Stratagene公司)DNA同样用E-CoRⅠ酶切，并用CIAP酶处理。DNA插入片段和载体PBK-CMV DNA以克分子3∶1的量用T4 DNA Ligase在12℃连接过夜，转化感受态细胞XLI-blue。挑取白色阳性克隆制备质粒DNA酶切证明亚克隆的插入片段。结果分别得到3个cDNA克隆的重组表达载体pBK-CMV-HC56、pBK-CMV-HC71和pBK-CMV-HC90。
实施例3HC71 cDNA的Northern杂交人肝癌和癌旁组织总RNA各5μg，按“分子克隆”一书的方法制做成Northern膜片，在42℃预杂交3-4小时(预杂交液含有50％ formamide0．05M Tris，1％ SDS，5×Denhardt’s 0．1％sodium pyrophosphate 100μg／ml变性的sperm DNA)。HC71DNA探针(50ng)用随机引物，32p-αdATP或32p-αdCTP标记，100℃煮沸10分钟变性放入冰浴中10分钟，然后加入预杂交液中42℃杂交12-16小时。取膜片用1×SSC-0．05％ SDS溶液42℃洗2次，每次30分钟，再用0．1×SSC-0．1％ SDS 42℃洗2次，每次30分钟，最后X光片自显影。见图6，4对标本(D22，D24，G2，G11)中癌旁表达明显高于癌，4对标本(D1，G4，G15，G16)癌和癌旁表达无差异。说明HC71在某些肝癌组织中表达受到抑制。
实施例4HC56、HC71和HC90的Southern杂交人肝癌和癌旁组织DNA 5μg用E-CoRⅠ或MSPⅠ内切酶彻底酶切，然后按“分子克隆”一书的方法制成Southern膜片，其后预杂交、杂交、洗膜片等程序，同实施例3的Northern杂交步骤。用HC56为探针杂交，结果如图9中G7，D2和D43肝癌组织(K)中的条带和相应的癌旁组织(L)中的条带位置不同，说明肝癌组织中DNA有重排。图10，图11中HC56在D13和Q9的癌旁组织(L)有一条带，而在癌组织中无条带，说明有缺失。
同样用HC71为探针杂交，其余步骤同HC56，结果如图12，13，14，15，16中，HC71在G3，G5，G6，Q3，Q6，D16，D38，30肝癌组织中的条带少于癌旁组织，说明HC71在肝癌组织中有缺失。
用HC90为探针杂交，其余步骤同HC56，结果如图17，图18中，HC90在12肝癌组织(K)中有缺失，在27，28，G5，D12，D13和D14肝癌组织中DNA有重排。以上结果说明3个HC56、HC71、HC90 cDNA克隆与肝癌的发生密切相关。
实施例5HC56、HC90半定量反转录PCR(RT-PCR)5．1反转录取肝癌和癌旁组织总RNA 1μg总反应体积20μl按Superscript Ⅱ RT Kit(GIBCO，BRL)操作程序合成第一链cDNA。合成后反应体积稀释120μl，1μl约含8ng总RNA，反转录后得到的第一链cDNA。
5．2 PCR反应依次加入下列试剂反转录单链cDNA 1μl(稀释后)10×PCR缓冲液1．5μl2mMdNTP 1．5μlβ-M引物(上游) 1．5μlβ-M引物(下游) 1．5μl被检克隆的引物(上游) 1．5μl被检克隆的引物(下游) 1．5μl32p-αdATP或32p-αdCTP 0．1 μlTaq酶(promaga 0．5u／μl)1．5μlH2O Xμl总体积15μl5．3 PCR反应程序94℃ 3分钟 5．4电泳和显影PCR反应结束后，取3μl PCR产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，在150-200V电压下，电泳约30-45分钟，然后凝胶真空干燥，X光片自显影。
引物序列β-M(内参DNA)上游引物5’ACCCCCACTGAAAAAGATGA 3’下游引物5’ATCTTCAAACCTCCATGATG 3’HC56克隆上游引物5’CTGCCCACCACCATCTGCCA 3’下游引物5’AGCAGCATGGCCAACAGGGG 3’HC90克隆上游引物5’GGAGAGGTGGTGGAACAGAA 3’下游引物5’AGCCAGACTCTTCCCAGGT 3’图4中，HC56在G2，G12，D24中的表达条带和β-M内渗比较，L明显强于K。G15K强于L，其余的L和K无差异。
图8中，HC90在D24，G2中L强于K，G15K强于L，其余的L和K无差异。
说明HC56和HC90在某些肝癌组织中的表达受到抑制。
实施例6HC56、HC71全长cDNA克隆6．1所用主要试剂cDNA池(Marathon-Ready cDNAs，Clontech)，聚合酶系统(Advantage cDNA polymerase Mix，Clontech)TA克隆系统(TOPOTA cloning)。
6．2引物设计用于RACE(Rapid amplification of cDNA ends)反应的基因特异引物应符合下列条件(a)长度23-28nt；(b)GC含量50-70％；(c)Tm值大于65℃。
HC71的引物5’RACE 71-b5’GCGTGCAGCAACGTCACACACTC 3’5’RACE巢式N71-b5’GTATCGTCAGGCGCTGGAATGG 3’HC56的引物3’RACE56-A5’CTG-CCCACCACCATCTGCCA 3’巢式N56-A5’GGACGTCTGGTAGGTGATGAAG 3’5’RACE56-B5’AGCAGCATGGCCAACAGGGG3’巢式N56-B5’CCTAAGCCTCTTTGGAGGATGGGGG 3’6．3 RACE反应PCR扩增反应可在12．5μl或25μl的反应体积中进行，按下列条件设置RACE反应+
PCR反应条件
RACE产物的亚克隆取回收的PCR产物0．5-2．5μl，加PCR-TOPO载体0．5μl混匀室温放置5分钟置冰上，再按常规方法进行细菌转化，涂板37℃生长12-16小时，兰、白斑筛选。
6．4 RACE产物的筛选鉴定在96孔板中，每孔加入含Amp抗性的LB 30μl，对于每个RACE反应，挑取10-20个白斑重组子至上述96孔板的LB中，用该菌液作模板，直接进行PCR反应，初步筛出候选阳性RACE克隆。对候选阳性克隆进行小量液扩，抽提质粒DNA，内切酶酶切，电泳分析，筛选出大片段RACE克隆，再进行PCR鉴定。
6．5 RACE产物的测序及序列分析对候选大片段阳性克隆进行测序，依据RACE产物的长度和该基因的mRNA大小，确定是否已获得该基因的全序列，全序列即包括完整的阅读框架，在第一个起始编码子ATG前面相同阅读框架内有终止编码子。在阅读框架的3’端有polyA序列。另外也含有相应的5’端和3’端非编码区。用RACE方法获得HC56和HC71的全长cDNA序列和相应的编码框架，见图1和图2。
实施例7用脂质体试剂盒转染细胞的体外实验
7．1细胞株原发肝细胞肝癌细胞系7721。
7．2 DNA来源于实施例2的表达质粒PBK-CMV-HC56，PBK-CMV-HC71和PBK-CMV-HC90的DNA。
7．3脂质体LIPOFECT AMINETM Reagent Kit(BRL公司)7．4培液无血清培液简称SF-DMEM全培液(10％小牛血清)含G418的全培液T25培养瓶。
7．5 DNA-脂质体复合物(DNA-liposome complex)的制备lipofectin 50μl加50μl SF-DMEM混匀。分别将HC56、HC71、HC90的DNA(20μg在20μl TE中)加80μl SF-DMEM混匀。将稀释的DNA加入稀释的lipofectin溶液中，混匀置室温5-10分钟。加1．3ml SF-DMEM进入DNA-lipofectin complex中，终体积为1．5ml。
7．6转染细胞细胞长到80-90％满度为好，实验前换培液一次。加1．5ml lipofectin Reagent-DNA complex入细胞表面，轻轻摇动，铺均匀，37℃温育1-3小时。加入1．5ml SF-DMEM混匀，37℃生长过夜。换培液37℃过夜，细胞长到70％满度换含G418培液以后常规换液至克隆出现，数克隆数。
图19显示空表达载体(pBK-CMV)转染7721细胞有较多克隆形成。而含有外来基因插入片段(HC56或HC71，HC90)的重组表达载体转染7721细胞无克隆或少数克隆形成。说明HC56、HC71和HC90在体外对肝癌细胞生长有抑制作用。图20显示含有HC56 cDNA的重组表达载体转化7721细胞的结果，无克隆形成。
权利要求
1．一种人类17号染色体1区3带3亚带区域内人肿瘤相关基因，其特征在于人肿瘤相关基因HC56具有下列全长核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列1 C TAG AAT TCA GCG GCC GCT GAA TTC AGA ATG GCC GTG TGA TTG CTC 4647 TGT GCC CAT TAC CCT GTG GCC GTG TGA CTG CTG CTG TGC CCA TTA CCC 9495 TGT GGC CGT GTG ATT GCT GCT GTG CCC ATT ACC CTG TGG CCG TGT GAT 142143 TGC TCT GTG CCC ATT ATC CTG TGG CCG TGT GAT TGC TCT GTG CCC ATT 190191 ACC CTG TGG CCG TGT GAT TGC TCT GTG CCC ATT ACC CTG TGG CCG TGT 238239 GAT TGC TCT GTG CCC ATT ATC CTG TGG CCG TGT GAT TGC TCT GTG CCC 286287 ATT ATC CTG TGG CCG TGT GAT TGC TCT GTG CCC ATT ATC CTG TGG CCG 334335 TGT GAT TGC TCT GTG CCC ATT ATC CTG TGG CCG TGT GAT TGC TGC TGT 382383 GCC CAT TAC CCT GTG GCC GTG TGA TTG CTC TGT GCC CAT TAT CCT GTG 430431 GCC GTG TGA TTG CTC TGT GCC CAT TAT CCT GTG GCT GTG TGA TTG CTC 478479 TGT GCC CAT TAT CCT GTA GCC GTG TGA TTG CTT CTG TGC CCA TTA CCC 526527 TGT GGC TGT GTG ATT GCT GCT GTG CCC ATT ATC CTG TGG CTG TGT GAT 574575 TGC TGC TGT GCC CAT TAC CCT GTG GCT GTG TGA TGC TCT GTG CCC ATT 622623 ACC CTG TGG CTG TGT GAT TGC TCT GTC CCA TTA TCC TGT GGC CGT GTG 670671 ATT GCT GCT GTG CCT GTT ACC CTG TGG CTG TGT GAT TGC TCT GTG CCC 718719 ATT ACC CTG TGG CTA TGC TCC CTT CAT CTG TCA TGA GAA GCT CAG CTG 766767 TCA TGT CCT GTG GTA CAT GCT CAG TGG CCC CTG TAG TTT GTA CTG TCC 814815 TCC TAT TTC TAA ACC CCT CTC CCC ACA TCC TCT GCT GGC CCA GCC TTT 862863 GCT GGA GGG TCT CGC CTC AGC AGC CCA GCT TTT TCT TTT CAC ACA CTT 910911 TTC CTG AAG GAT CTC ATT CAC CGT CTT GGT TCC GGT GAT CCC CTC TGG 958959 GCA GAT ACC TCT CAG AAT CAC ATT TCC CAG CTT ACT TCC CTC CTG AAC10061007TTC CAC CTG GCA TTT CCG TTG CTG GAG GAC ATC TGT ACC TTG ATG GCC1054续后页1055 AAA GCT GAA CTC ATC TTT CCT CAC ACC TGC TCT GAT TCT CCT CCA TTC11021103 CCT GTA TGT GAT GTC ACC TGG TGG CCT CCC AGT TCC CAG GCT GGA GAG11501151 CTC GGA AGC CAT TCT GGA TTC CTC GGC CAA GTC CTT CTG ACT CCA GCT11981199 GTG CAG TGG CTC TTG TAG TCA TCC ATT CTC CCC GTC CGC TGA TGT CCT12461247 TTA AAA CCC TTG TCA TCT CAA ACC ATG ACA GCC TAC TAA CAG CAG TGG12941295 CCA TCT GGA AAC ATT TTC ACT ATA CTG TCT TAT TTG GCT TGT CTG TGT13421343 GCA GGA CCC TTG AAC ATC TGT GAA GAA ATG ACT ATT CTG CAT GGA GGC13901 Met Thr I1e Leu His Gly Gly 71391 TTC TTG CTG GCC GAG CAG CTG TTC CAC CCT AAG GCA CTG GCA GAA TTA14388 Phe Leu Leu Ala Glu Gln Leu Phe His Pro Lys Ala Leu Ala Glu Leu 231439 ACA AAG TCT GAC TGG GAA CGT GTT GGA CGG CCC ATC GTG GAG GCC TTA148624 Thr Lys Ser Asp Trp Glu Arg Val Gly Arg Pro Ile Val Glu Ala Leu 391487 AGG GAG ATC TCC TCG GCT GCA GCA CAC TCC CAG CCC TTT GCC TGG AAG153440 Arg Glu Ile Ser Ser Ala Ala Ala His Ser Gln Pro Phe Ala Trp Lys 551535 AAG AAA GCC CTG ATC ATC ATC TGG GCC AAG GTT CTG CAG CCG CAC CCC158256 Lys Lys Ala Leu Ile Ile Ile Trp Ala Lys Val Leu Gln Pro His Pro 711583 GTG ACC CCG TCC GAC ACA GAG ACA CGG TGG CAG GAA GAC CTG TTC TTC163072 Val Thr Pro Ser Asp Thr Glu Thr Arg Trp Gln Glu Asp Leu Phe Phe 871631 TCG GTG GGC AAC ATG ATC CCC ACC ATC AAC CAC ACC ATC CTC TTC GAG167888 Ser Val Gly Asn Met Ile Pro Thr Ile Asn His Thr Ile Leu Phe Glu 1031679 CTG CTC AAA TCC CTG GAA GCT TCT GGA CTC TTT ATC CAG CTC CTG ATG1726104 Leu Leu Lys Ser Leu Glu Ala Ser Gly Leu Phe Ile Gln Leu Leu Met 119续后页1727 GCC CTG CCC ACC ACC ATC TGC CAT GCA GAA CTA GAG CGC TTT CTG GAA1774120 Ala Leu Pro Thr Thr Ile Cys His Ala Glu Leu Glu Arg Phe Leu Glu 1351775 CAT GTG ACC GTT GAC ACT TCT GCC GAA GAC GTG GCC TTC TTC CTG GAC1822136 His Val Thr Val Asp Thr Ser Ala Glu Asp Val Ala Phe Phe Leu Asp 1511823 GTC TGG TGG GAG GTG ATG AAG CAC AAG GGT CAC CCG CAG GAC CCC CTG1870152 Val Trp Trp Glu Val Met Lys His Lys Gly His Pro Gln Asp Pro Leu 1671871 CTC TCC CAG TTT AGT GCA ATG GCC CAT AAG TAC CTG CCT GCC TTA GAT1918168 Leu Ser Gln Phe Ser Ala Met Ala His Lys Tyr Leu Pro Ala Leu Asp 1831919 GAG TTC CCC CAT CCT CCA AAG AGG CTT AGG TCA GAC CCA GAC GCG TGC1966184 Glu Phe Pro His Pro Pro Lys Arg Leu Arg Ser Asp Pro Asp Ala Cys 1991967 CCC ACC ATG CCC CTG TTG GCC ATG CTG CTC CGC GGG CTG ACA CAG ATC2014200 Pro Thr Met Pro Leu Leu Ala Met Leu Leu Arg Gly Leu Thr Gln Ile 2152015 CAG AGT CGG ATC CTG GGC CCG GGG AGG AAG TGC TGT GCG CTG GCC AAC2062216 Gln Ser Arg Ile Leu Gly Pro Gly Arg Lys Cys Cys Ala Leu Ala Asn 2312063 CTG GCT GAC ATG CTG ACT GTG TTT GCG CTG ACA GAG GAC GAC CCC CAG2110232 Leu Ala Asp Met Leu Thr Val Phe Ala Leu Thr Glu Asp Asp Pro Gln 2472111 GAG GTG TCT GCA ACC GTG TAT CTG GAC AAA CTG GCC ACG GTG ATC TCT2158248 Glu Val Ser Ala Thr Val Tyr Leu Asp Lys Leu Ala Thr Val Ile Ser 2632159 GTG TGG AAC TCG GAC ACC CAG AAT CCC TAC CAC CAG CAG GCG CTG GCA2206264 Val Trp Asn Ser Asp Thr Gln Asn Pro Tyr His Gln Gln Ala Leu Ala 279续后页2207 GAG AAG GTG AAG GAG GCA GAA CGG GAT GTC AGC CTG ACC TCG CTG GCC2254280 Glu Lys Val Lys Glu Ala Glu Arg Asp Val Ser Leu Thr Ser Leu Ala 2952255 AAA CTC CCC AGT GAG ACC ATT TTC GTG GGC TGC GAG TTC CTG CAC CAC2302296 Lys Leu Pro Ser Glu Thr Ile Phe Val Gly Cys Glu Phe Leu His His 3112303 CTG CTG CGG GAG TGG GGG GAG GAG TTG CAG GCC GTG CTC CGC AGC AGC2350312 Leu Leu Arg Glu Trp Gly Glu Glu Leu Gln Ala Val Leu Arg Ser Ser 3272351 CAG GGG ACA AGT TAC GAC AGC TAC CGG CTG TGC GAC AGT CTG ACT TCC2398328 Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser Tyr Arg Leu Cys Asp Ser Leu Thr Ser 3432399 TTC AGC CAG AAC GCG ACG CTC TAC CTG AAC CGC ACC AGC CTG TCC AAG2446344 Phe Ser Gln ASh Ala Thr Leu Tyr Leu Asn Arg Thr Ser Leu Ser Lys 3592447 GAG GAC AGG CAG GTG GTC TCT GAG CTG GCG GAG TGT GTC AGG GAC TTC2494360 Glu Asp Arg Gln Val Val Ser Glu Leu Ala Glu Cys Val Arg Asp Phe 3752495 CTG AGG AAA ACG AGC ACG GTG CTG AAG AAC AGG GCC TTG GAG GAT ATC2542376 Leu Arg Lys Thr Ser Thr Val Leu Lys Asn Arg Ala Leu Glu Asp Ile 3912543 ACA GCT TCC ATT GCC ATG GCC GTC ATC CAG CAG AAG ATG GAC CGC CAT2590392 Thr Ala Ser Ile Ala Met Ala Val Ile Gln Gln Lys Met Asp Arg His 4072591 ATG GAA GTG TGC TAC ATT TTT GCC TCT GAG AAG AAG TGG GCC TTC TCG2638408 Met Glu Val Cys Tyr Ile Phe Ala Ser Glu Lys Lys Trp Ala Phe Ser 4232639 GAC GAG TGG GTA GCC TGC CTG GGG AGT AAC AGG GCC CTC TTC CGA GAG2686424 Asp Glu Trp Val Ala Cys Leu Gly Ser Asn Arg Ala Leu Phe Arg Glu 439续后页2687 CCA GAC TTG GTG TTG AGG CTG CTG GAA ACA GTG ATA GAC GTC AGC ACA2734440 Pro Asp Leu Val Leu Arg Leu Leu Glu Thr Val Ile Asp Val Ser Thr 4552735 GCT GAC AGA GCC ATC CCT GAG TCT CAG ATC CGG CAG GTG ATC CAC CTG2782456 Ala Asp Arg Ala Ile Pro Glu Ser Gln Ile Arg Gln Val Ile His Leu 47l2783 ATC CTG GAA TGT TAC GCA GAC CTC TCC CTG CCA GGT AAA AAT AAA GTC2830472 Ile Leu Glu Cys Tyr Ala Asp Leu Ser Leu Pro Gly Lys Asn Lys Val 4872831 CTT GCA GGT ATC CTG CGT TCC TGG GGG CGA AAG GGC CTC TCT GAA AAG2878488 Leu Ala Gly Ile Leu Arg Ser Trp Gly Arg Lys Gly Leu Ser Glu Lys 5032879 TTG CTG GCT TAT GTG GAG GGT TTT CAG GAA GAC CTC AAT ACA ACT TTT2926504 Leu Leu Ala Tyr Val Glu Gly Phe Gln Glu Asp Leu Asn Thr Thr Phe 5192927 AAC CAG CTC ACT CAG AGT GCC TCC GAA CAG GGC TTG GCA AAA GCT GTG2974520 Asn Gln Leu Thr Gln Ser Ala Ser Glu Gln Gly Leu Ala Lys Ala Val 5352975 GCC TCC GTG GCC CGC CTG GTC ATA GTG CAC CCG GAA GTC ACG GTG AAG3022536 Ala Ser Val Ala Arg Leu Val Ile Val His Pro Glu Val Thr Val Lys 5513023 AAA ATG TGC AGC CTG GCT GTG GTC AAT CTC GGC ACC CAC AAG TTC CTG3070552 Lys Met Cys Ser Leu Ala Val Val ASn Leu Gly Thr His Lys Phe Leu 5673071 GCC CAG ATT CTC ACT GCC TTC CCT GCC CTT AGG TTT GTG GAA GTG CAG3118568 Ala Gln Ile Leu Thr Ala Phe Pro Ala Leu Arg Phe Val Glu Val Gln 5833119 GGT CCC AAT TCA TCT GCC ACT TTC ATG GTG TCA TGC CTC AAA GAA ACC3166584 Gly Pro Asn Ser Ser Ala Thr Phe Met Val Ser Cys Leu Lys Glu Thr 599续后页3167 GTC TGG ATG AAG TTC TCT ACA CCC AAG GAA GAA AAG CAA TTT TTA GAG3214600 Val Trp Met Lys Phe Ser Thr Pro Lys Glu Glu Lys Gln Phe Leu Glu 6153215 CTC CTG AAC TGC CTG ATG AGT CCC GTG AAA CCC CAA GGG ATT CCA GTG3262616 Leu Leu Asn Cys Leu Met Ser Pro Val Lys Pro Gln Gly Ile Pro Val 6313263 GCT GCT CTT CTT GAG CCA GAC GAG GTG CTG AAG GAA TTT GTC CTG CCT3310632 Ala Ala Leu Leu Glu Pro Asp Glu Val Leu Lys Glu Phe Val Leu Pro 6473311 TTC TTG AGG TTA GAT GTT GAA GAG GTA GAC CTC AGT CTG AGG ATC TTC3358648 Phe Leu Arg Leu Asp Val Glu Glu Val Asp Leu Ser Leu Arg Ile Phe 6633359 ATC CAG ACT CTA GAG GCA AAC GCG TGT CGA GAG GAA TAC TGG CTC CAG3406664 Ile Gln Thr Leu Glu Ala Asn Ala Cys Arg Glu Glu Tyr Trp Leu Gln 6793407 ACC TGC TCC CCG TTT CCA CTC CTC TTC AGC TTG TGC CAG CTC TTG GAC3454680 Thr Cys Ser Pro Phe Pro Leu Leu Phe Ser Leu Cys Gln Leu Leu Asp 6953455 CGC TTC AGC AAA TAC TGG CAG CTT CCC AAG GAG AAG CGG TGC CTC TCT3502696 Arg Phe Ser Lys Tyr Trp Gln Leu Pro Lys Glu Lys Arg Cys Leu Ser 7113503 TTG GAT AGG AAG GAT CTA GCG ATC CAT ATC CTG GAG CTC CTG TGT GAG3550712 Leu Asp Arg Lys Asp Leu Ala Ile His Ile Leu Glu Leu Leu Cys Glu 7273551 ATT GTA TCA GCC AAT GCT GAG ACC TTC TCC CCG GAT GTC TGG ATC AAG3598728 Ile Val Ser Ala Asn Ala Glu Thr Phe Ser Pro Asp Val Trp Ile Lys 7433599 TCC CTG TCC TGG CTC CAC CGC AAG TTA GAA CAG CTA GAC TGG ACT GTG3646744 Ser Leu Ser Trp Leu His Arg Lys Leu Glu Gln Leu Asp Trp Thr Val 759续后页3647 GGC CTG AGG CTG AAG AGC TTC TTC GAG GGG CAC TTC AAG TGT GAA GTG3694760 Gly Leu Arg Leu Lys Ser Phe Phe Glu Gly His Phe Lys Cys Glu Val 7753695 CCA GCC ACA CTT TTT GAG ATC TGT AAG CTT TCA GAA GAC GAG TGG ACC3742776 Pro Ala Thr Leu Phe Glu Ile Cys Lys Leu Ser Glu Asp Glu Trp Thr 7913743 TCC CAG GCC CAC CCA GGG TAC GGG GCT GGC ACG GGG CTC CTG GCC TGG3790792 Ser Gln Ala His Pro Gly Tyr Gly Ala Gly Thr Gly Leu Leu Ala Trp 8073791 ATG GAG TGC TGC TGC GTC TCC AGC GGC ATC TCG GAG AGG ATG CTG TCT3838808 Met Glu Cys Cys Cys Val Ser Ser Gly Ile Ser Glu Arg Met Leu Ser 8233839 CTC TTG GTG GTG GAC GTG GGC AAT CCT GAG GAG GTC AGA CTG TTC AGC3886824 Leu Leu Val Val Asp Val Gly Asn Pro Glu Glu Val Arg Leu Phe Ser 8393887 AAA GGC TTT CTG GTG GCC CTG GTG CAA GTC ATG CCT TGG TGC AGC CCT3934840 Lys Gly Phe Leu Val Ala Leu Val Gln Val Met Pro Trp Cys Ser Pro 8553887 AAA GGC TTT CTG GTG GCC CTG GTG CAA GTC ATG CCT TGG TGC AGC CCT3934840 Lys Gly Phe Leu Val Ala Leu Val Gln Val Met Pro Trp Cys Ser Pro 8553935 CAG GAG TGG CAG CGC CTT CAC CAG CTG ACC AGG AGA CTG CTG GAG AAG3982856 Gln Glu Trp Gln Arg Leu His Gln Leu Thr Arg Arg Leu Leu Glu Lys 8713983 CAG CTC CTC CAT GTC CCT TAT AGC CTG GAA TAT ATT CAG TTT GTT CCC4030872 Gln Leu Leu His Val Pro Tyr Ser Leu Glu Tyr Ile Gln Phe Val Pro 8874031 CTG CTC AAC CTG AAG CCC TTT GCC CAG GAG TTG CAA CTC TCC GTC CTC4078888 Leu Leu Asn Leu Lys Pro Phe Ala Gln Glu Leu Gln Leu Ser Val Leu 903续后页4079 TTC CTG AGG ACT TTC CAG TTT CTC TGC AGC CAT AGC TGT CGT AAT TGG4126904 Phe Leu Arg Thr Phe Gln Phe Leu Cys Ser His Ser Cys Arg Asn Trp 9194127 CTT CCT CTG GAA GGC TGG AAC CAC GTG GTC AAA CTC CTC TGT GGC AGT4174920 Leu Pro Leu Glu Gly Trp Asn His Val Val Lys Leu Leu Cys Gly Ser 9354175 CTG ACC CGC CTC CTG GAC TCA GTC AGG GCG ATA CAG GCA GCT GGC CCT4222936 Leu Thr Arg Leu Leu Asp Ser Val Arg Ala Ile Gln Ala Ala Gly Pro 9514223 TGG GTT CAA GGA CCA GAG CAG GAC CTG ACC CAG GAA GCC CTG TTT GTT4270952 Trp Val Gln Gly Pro Glu Gln Asp Leu Thr Gln Glu Ala Leu Phe Val 9674271 TAC ACC CAG GTG TTC TGC CAT GCT CTG CAC ATC ATG GCC ATG CTC CAC4318968 Tyr Thr Gln Val Phe Cys His Ala Leu His Ile Met Ala Met Leu His 9834319 CCG GAG GTC TGT GAG CCA CTC TAC GTT TTA GCC TTG GAA ACC CTC ACC4366984 Pro Glu Val Cys Glu Pro Leu Tyr Val Leu Ala Leu Glu Thr Leu Thr 9994367 TGC TAT GAG ACT TTG AGC AAG ACC AAC CCT TCT GTC AGC TCC TTG CTC44141000 Cys Tyr Glu Thr Leu Ser Lys Thr Asn Pro Ser Val Ser Ser Leu Leu10154415 CAG AGG GCA CAC GAG CAG CGC TTC TTA AAG TCC ATT GCT GAG GGC ATT44621016 Gln Arg Ala His Glu Gln Arg Phe Leu Lys Ser Ile Ala Glu Gly Ile10314463 GGC CCT GAA GAA CGG CGC CAA ACC CTG TTG CAG AAG ATG AGC AGC TTC45101032 Gly Pro Glu Glu Arg Arg Gln Thr Leu Leu Gln Lys Met Ser Ser Phe10474511 TGA CTT GGC GTG GGG AGC TGG GCC CCA ACA TGG CGG GTC TGC AGA AGA45581048 *** 1048续后页4559TCA GCA GCT TCT TAC CTG TGC GGG AGC GAA AAA GCT GGG CTT CAA CAT 46064607GGC AGG TCT GTA GGG GTC AGA CCC AAG CAG CCT GGA CTT TAC AGT TAT 46544655GTG AAA CTG TCC ACA AAA AGT CAT GGC AAT AAT GGT GTA AAG AAA ATA 47024703GTT TCT TGG GTA TTT GTA ACG TAC AAA CTA TCA TAA AAA TTC TCC TCT 47504751TTC CCA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA 4779
2．一种人类17号染色体1区3带3亚带区域内人肿瘤相关基因，其特征在于人肿瘤相关基因HC7l具有下列全长核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列1 TGA CGG CTG CGT GCG GCG GGA ATC ATG GCT GCT CGC AGA GCT CTG CAC481 Met Ala Ala Arg Arg Ala Leu His 849 TTC GTA TTC AAA GTG GGA AAC CGC TTC CAG ACG GCG CGT TTC TAT CGG969 Phe Val Phe Lys Val Gly Asn Arg Phe Gln Thr Ala Arg Phe Tyr Arg2497 GAC GTC CTG GGG ATG AAG GTG GAG TCT TGC TCT GTC GCC AGG CTG GAG 14425 Asp Val Leu Gly Met Lys Val Glu Ser Cys Ser Val Ala Arg Leu Glu40145 TGC AGT GGC GCG ATC TCG GCT CAC TGC TCT GAC TAC ACC CGG ATA ACA 19241 Cys Ser Gly Ala Ile Ser Ala His Cys Ser Asp Tyr Thr Arg Ile Thr56193 GAA GAC AGT TTC TCA AAG CCT TAT GAT GGG AAA TGG AGT AAA ACA ATG 24057 Glu Asp Ser Phe Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Lys Trp Ser Lys Thr Met7224l GTG GGA TTT GGG CCT GAG GAT GAT CAT TTT GTC GCA GAA CTG ACT TAC 28873 Val Gly Phe Gly Pro Glu Asp Asp His Phe Val Ala Glu Leu Thr Tyr88续后页289 AAT TAT GGC GTC GGA GAC TAC PAG CTT GGC AAT GAC TTT ATG GGA ATC 33689 Asn Tyr Gly Val Gly Asp Tyr Lys Leu Gly Asn Asp Phe Met Gly Ile 104337 ACG CTC GCT TCT AGC CAG GCT GTC AGC AAC GCC AGG AAG CTG GAG TGG 384105 Thr Leu Ala Ser Ser Gln Ala Val Ser Asn Ala Arg Lys Leu Glu Trp 120385 CCA CTG ACG GAA GTT GCA GAA GGT GTT TTT GAA ACC GAG GCC CCG GGA 432121 Pro Leu Thr Glu Val Ala Glu Gly Val Phe Glu Thr Glu Ala Pro Gly 136433 GGA TAT AAG TTC TAT TTG CAG AAT CGC AGT CTG CCT CAG TCA GAT CCT 480137 Gly Tyr Lys Phe Tyr Leu Gln Asn Arg Ser Leu Pro Gln Ser Asp Pro 152481 GTA TTA AAA GTA ACT CTA GCA GTG TCT GAT CTT CAA AAG TCC TTG AAC 528153 Val Leu Lys Val Thr Leu Ala Val Ser Asp Leu Gln Lys Ser Leu Asn 168529 TAC TGG TGT AAT CTA CTG GGA ATG AAA ATT TAT GAA AAA GAT GAA GPA 576169 Tyr Trp Cys Asn Leu Leu Gly Met Lys Ile Tyr Glu Lys Asp Glu Glu 184577 AAG CAA AGG GCT TTG CTG GGC TAT GCT GAT AAC CAG TGT AAG CTG GAG 624185 Lys Gln Arg Ala Leu Leu Gly Tyr Ala Asp Asn Gln Cys Lys Leu Glu 200625 CTA CAG GGC GTC AAG GGT GGG GTG GAC CAT GCA GCA GCT TTT GGA AGA 672201 Leu Gln Gly Val Lys Gly Gly Val Asp His Ala Ala Ala Phe Gly Arg 216673 ATT GCC TTC TCT TGC CCC CAG AAA GAG TTG CCA GAC TTA GAA GAC TTG 720217 Ile Ala Phe Ser Cys Pro Gln Lys Glu Leu Pro Asp Leu Glu Asp Leu 232721 ATG AAA AGG GAG AAC CAG AAG ATT CTG ACT CCC CTG GTG AGC CTG GAC 768233 Met Lys Arg Glu Asn Gln Lys Ile Leu Thr Pro Leu Val Ser Leu Asp 248续后页769 ACC CCA GGG AAA GCA ACA GTA CAG GTG GTC ATT CTG GCC GAC CCT GAC 816249 Thr Pro Gly Lys Ala Thr Val Gln Val Val Ile Leu Ala Asp Pro Asp 264817 GGA CAT GAA ATT TGC TTT GTC GGG GAT GAA GCA TTT CGA GAA CTT TCT 864265 Gly His Glu Ile Cys Phe Val Gly Asp Glu Ala Phe Arg Glu Leu Ser 280865 AAG ATG GAT CCA GAG GGA AGC AAA TTG TTG GAT GAT GCA ATG GCA GCA 912281 Lys Met Asp Pro Glu Gly Ser Lys Leu Leu Asp Asp Ala Met Ala Ala 296913 GAT AAA AGT GAC GAG TGG TTT GCC AAA CAC AAT AAA CCC AAA GCT TCA 960297 Asp Lys Ser Asp Glu Trp Phe Ala Lys His Asn Lys Pro Lys Ala Ser 312961 GGT TAA CGG AAG ACA TGA TGC AGA GCA AGC CTC TGT GAT TCC TGC CCA 1008313 Gly***3141009 GCA CCT GTG AGG CCT GAC GTG TCA GTT CCC AAT AAA TGC TCT TCT GAT10561057 TTG TTT CCC GTA CAG GCA AGG AGG CTT GGG TAG TGC AGA TTT GTG TAT11041105 TTC AAT CTT TGA AAG CTC TGA TGT AAT TTA GAA ATG AAA TCC AAT CAT11521153 GAG TCC AGG TAG AGA ACG CCT GCT GTA ATC TAC ACT GTT GCT GCG ACT12001201 GCG CAT TCT GTA TAT AAC TGT GTT GGA TGA GTG ACA GAT GAT TGT CCA12481249 GAC TAG GAC AGC GGC ATG AAC ATG ACT TTG GTT GGG ATT GCG GAT AGT12961297 TAG GGT TAC CTC TGA ATC GTG TAG CTT TTA TGA GAG CAG CTG TGC AAG13441345 TGA ATC CAC ATT AAT GCC TTG TCG TGG TGC CAT TCC CAG CGC CTG ACG13921393 ATA CGC TCT TCT ATT GTC TTA TTC TGG CAG GTT TTG ACG TTT TAA ATT14401441 TTT TAA AGA AAT TTT ATT CCT TGG ACC AAA AGG TTT GGT TAA CCA CCC14881489 CCC TCT TAC TTG CTT TCA CAT TTT GAG TGT CCA GAG GAA ACA GAA AGG15361537 AAT GAG TGT GTG ACG TTG CTG CAC GCC TGA CTC TGT GCG AGC TTC TTT15841585 CTG TGT ATA TAT TTT GTT TTA TTT TTT TCC GTG TAT ATT TTT AAT CCC1632续后页1633 GAC AGA ACA TCA TGT GAG ATT TCT TTA AAA TGG ATT AAA CGA TTT CTT16801681 CAG CCT GAA AAA AAA GGT TTT GAA AAT GTT TTC TTG TAG TTT TGT TTG17281729 GTT CTA AAC AAC AAA TAG GTT TTA ATC ACT CGA AAT GGA ATT ATA TTG17761777 TGT ATT CAT TGA ATA AAT TTT TTT TGA AAG TAA AAA AAC C 1816
3．一种人类17号染色体1区3带3亚带区域内人肿瘤相关基因，其特征在于人肿瘤相关基因HC90具有下列全长核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列1 GGG CCC GGG TCT CAG GGA ACA TGG CGG CGC TGG TGA GAC CCG CGA GGT 4849 TTG TCG TGC GAC CGT TGC TGC AGG TGG TCC AGG CTT GGG ACC TTG ACG 9697 CGA GGC GCT GGG TCC GGG CGC TGC GGC GGA GCC CAG TGA AAG TGG TGT 144145 TTC CTT CCG GAG AGG TGG TGG AAC AGA AGC GCG CTC CTG GGA AGC AGC 192193 CCC GCA AGG CAC CAT CTG AGG CCA GTG CCC AGG AGC AAC GAG AGA AAC 240241 AAC CGC TCG AGG AGT CCG CAT CCC GCG CTC CCA GCA CCT GGG AAG AGT 288289 CTG GGC TTC GCT ACG ATA AAG CTT ATC CCG GGG ACA GGA GGC TGA GCA 336337 GTG TAA TGA CAA TAG TAA AGT CCA GGC CAT TTC GGG AAA AAC AAG GGA 384385 AGA TCC TGC TGG AAG GTC GCA GGC TCA TTT CAG ACG CTC TCA AGG GCT 432433 GGA GCT GTG CCA AAA ATG TTC TTC TTT AGC CGT CTA GAA TAC CTA AAG 4801 Met Phe Phe Phe Ser Arg Leu Glu Tyr Leu Lys 11481 GAG TTG CCA GTC GAT AAG CTG AAA GGT GTC AGC CTC ATT AAG GTG AAA 52812 Glu Leu Pro Val Asp Lys Leu Lys Gly Val Ser Leu Ile Lys Val Lys 27529 TTT GAG GAT ATC AAG GAT TGG TCC GAC CTC GTA ACG CCA CAA GGA ATA 57628 Phe Glu Asp Ile Lys Asp Trp Ser Asp Leu Val Thr Pro Gln Gly Ile 43577 ATG GGG ATT TTT GCC AAG CCT GAC CAT GTT AAG ATG ACA TAT CCA AAG 62444 Met Gly Ile Phe Ala Lys Pro Asp His Val Lys Met Thr Tyr Pro Lys 59续后页625 ACT CAG CTT CAG CAT TCA CTG CCT TTA TTA TTG ATT TGT GAC AAT CTC 67260 Thr Gln Leu Gln His Ser Leu Pro Leu Leu Leu Ile Cys Asp Asn Leu 75673 CGT GAC CCT GGG AAC CTG GGG ACA ATT CTG AGA TCT GCA GCT GGG GCA 72076 Arg Asp Pro Gly Asn Leu Gly Thr Ile Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 91721 GGC TGC AGC AAA GTG TTA CTC ACC AAA GGC TGT GTG GAT GCC TGG GAG 76892 Gly Cys Ser Lys Val Leu Leu Thr Lys Gly Cys Val Asp Ala Trp Glu 107769 CCC AAA GTG CTC CGG GCG GGT ATG GGC GCA CAT TTC CGG ATG CCC ATT 816108 Pro Lys Val Leu Arg Ala Gly Met Gly Ala His Phe Arg Met Pro Ile 123817 ATC AAT AAT CTG GAA TGG GAA ACC GTG CCC AAT TAC CTG CCC CCT GAC 864124 Ile Asn Asn Leu Glu Trp Glu Thr Val Pro Asn Tyr Leu Pro Pro Asp 139865 ACT CGG GTC TAT GTG GCT GAC AAC TGT GGC CTT TAT GCC CAG GCT GAG 912140 Thr Arg Val Tyr Val Ala Asp Asn Cys Gly Leu Tyr Ala Gln Ala Glu 155913 ATG TCT AAT AAA GCT AGT GAC CAT GGC TGG GTG TGT GAT CAA CGA GTG 960156 Met Ser Asn Lys Ala Ser Asp His Gly Trp Val Cys Asp Gln Arg Val 171961 ATG AAG TTT CAC AAG TAT GAG GAA GAG GAA GAT GTA GAA ACC GGA GCC1008172 Met Lys Phe His Lys Tyr Glu Glu Glu Glu Asp Val Glu Thr Gly Ala 1871009 AGT CAA GAT TGG CTG CCT CAT GTT GAG GTT CAG AGT TAC GAC TCG GAC1056188 Ser Gln Asp Trp Leu Pro His Val Glu Val Gln Ser Tyr Asp Ser Asp 2031057 TGG ACA GAG GCG CCG GCA GCT GTG GTG ATT GGC GGG GAG ACC TAC GGC1104204 Trp Thr Glu Ala Pro Ala Ala Val Val Ile Gly Gly Glu Thr Tyr Gly 219续后页1105 GTG AGC CTG GAG TCC CTG CAG CTG GCC GAG AGC ACT GGT GGC AAG AGG1152220 Val Ser Leu Glu Ser Leu Gln Leu Ala Glu Ser Thr Gly Gly Lys Arg 2351153 CTG CTG ATC CCC GTT GTG CCT GGT GTG GAC AGC CTC AAC TCG GCC ATG1200236 Leu Leu Ile Pro Val Val Pro Gly Val Asp Ser Leu Asn Ser Ala Met 2511201 GCG GCA AGC ATC CTG CTT TTC GAA GGG AAA AGA CAG CTG CGG GGG AGG1248252 Ala Ala Ser Ile Leu Leu Phe Glu Gly Lys Arg Gln Leu Arg Gly Arg 2671249 GCG GAG GAC TTG AGC AGG GAC AGG AGT TAC CAC TGA GGA CGC AGA AGT1296268 Ala Glu Asp Leu Ser Arg Asp Arg Ser Tyr His *** 2791297 GAC TTC TGC TTG AGG ACG TCT GCA GCT CCT CCT ACA CCA GCA CAC TGG13441345 TGG GAG GCT GGC GGA GTC AGT GAC TAT GGC CCC CAC GTT CAG GAG GAA13921393 GGT GTG ATG CCG TCA TAC AGT TAC AGG AAA AAT AAG AAC TTC CTC AGA14401441 AAG AAC AGG TCC GAA TTC TTC CTG TCG CGT CAC TGA TTT TGA GGT TCT14881489 TTT TTC TCT TGG TGA CAA TAG GTG ACC CAC GTG GCT CTG TGT GTT TTT15361537 AAA AAT TGT CCA CCA AGA AGC ACT TTG TGC CCA GAA AGT TCC TGA AGC15841585 ATC ATA CCT GGC AGG GAG GCG CCT GCT CCA CCA GCT GGT GGG TGT TTG16321633 TAA TCG CCA AGC ACC AGC TAT AGG TCA CAG CCA CAT CAC TCA CAG CTG16801681 ATC ACT GGT TGG TGG AAA ATA AAC TAT GAG CAG CAG AAA AAA AAA AAA17281729 AAA1731
4．按权利要求1、2、3所述的人肿瘤相关基因，其特征在于所述人肿瘤相关基因具有在所述基因HC56、HC71、HC90的编码框架中90％以上同源的核苷酸序列。
5．按权利要求1、2、3所述的人肿瘤相关基因，其特征在于所述人肿瘤相关基因具有所述基因HC56、HC71、HC90编码的氨基酸序列的60％以上同源的氨基酸序列相应的核苷酸序列。
6．含有权利要求1所述人肿瘤相关基因HC56的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是由所述的HC56基因与E-CoRⅠ酶切后的原核或真核表达载体pBK-CMV构建而成的重组表达载体pBK-CMV-HC56。
7．含有权利要求2所述人肿瘤相关基因HC71的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是由所述的HC71基因与E-CoRⅠ酶切后的原核或真核表达载体pBK-CMV构建而成的重组表达载体pBK-CMV-HC71。
8．含有权利要求3所述人肿瘤相关基因HC90的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是由所述的HC90基因与E-CoRⅠ酶切后的原核或真核表达载体pBK-CMV构建而成的重组表达载体pBK-CMV-HC90。
9．按权利要求1、2、3所述的人肿瘤相关基因的应用，其特征在于所述HC56、HC71、HC90基因的核苷酸和氨基酸序列可用作为治疗、诊断、预防肿瘤的药物或试剂。
全文摘要
本发明涉及到人17号染色体短臂13.3位点的癌相关基因(cDNA)的分离和克隆。用对应于17p13.3区段内926位点的噬菌体人工染色体(PAC)579号(P579)为探针筛选人正常肝cDNA文库得到3个新基因HC56、HC71、HC90并得到全长核苷酸序列和编码的氨基酸。通过Northern、Southern杂交,证明它们与肝癌相关,体外实验证明它们可以抑制肝癌细胞7721的生长。因此,3个基因有望作为药物或试剂应用于肿瘤的诊断、治疗和预防。
文档编号A61K48/00GK1281899SQ99113909
公开日2001年1月31日 申请日期1999年7月23日 优先权日1999年7月23日
发明者万大方, 赵新泰, 顾健人 申请人:上海市肿瘤研究所