专利名称：实时定量pcr技术检测人21号染色体数目的方法
技术领域：
本发明属分子生物学，涉及检测染色体数目的方法，尤其涉及应用多重实时定量PCR技术检测人21号染色体数目的方法。
背景技术：
21三体综合征(简称21三体，又称唐氏综合征或先天愚型)是人类最常见的染色体病，在活产婴中发病率约为1/600[1]，表现为21号染色体数目异常，即患者在正常两条的基础上多了一条(或多了部分21号易位染色体)。该病患者有严重的智力发育迟缓，且易并发心脏病、白血病，免疫功能低下，患儿早期死亡率高。目前该病尚无有效的治疗方法，主要是通过产前诊断来避免缺陷儿的出生。经典的先天愚型的产前诊断主要是依靠细胞遗传学的方法，即对培养的羊水细胞、绒毛间叶细胞或胎儿血细胞进行核型分析，准确但效率低，难以满足临床的需求。
随着分子生物学技术的发展，出现了几种快速分子诊断21三体的方法，如荧光原位杂交(FISH)、同源基因定量PCR方法(HGQ-PCR)、基于多态性位点的PCR检测(STR-PCR)等新技术。其中，FISH操作复杂，通常是作为一种辅助性检测方法用于疑难病例的分析[2]；HGQ-PCR虽然快捷，但准确性较差，且需要昂贵的光密度扫描仪，普及应用有障碍[3]；STR-PCR目前研究较多，但该法对纯合子诊断困难[4][5]，且需要电泳来判断，容易受到主观因素的影响。因此，临床仍期待着准确、实用、易于普及、能满足大规模临床应用的21三体综合征的实验检测方法问世。
实时荧光定量PCR技术是近年发展起来的PCR定量新技术，该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，可以做到每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，从而准确地确定ct值，并根据ct值确定起始DNA拷贝数，做到真正意义上的定量。其方法可分为Taqman探针法和SYBR Green荧光染料法两种，比较而言，探针法在原理上更为严格，所得数据更为精确。实时荧光定量PCR技术因其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应，能够检测普通PCR不能识别的微小的基因量的差异，目前已成为分子生物学研究中的重要工具[6][7][8]，除此之外，它还具有高通量和自动化的特点，这使之在临床也具有极好的应用前景。
从理论上讲，21三体患者存在21号染色体(或21号部分易位染色体)数目的固定改变，可以分别标记21号染色体及其它染色体上的特异性单拷贝序列(分别为目标序列和内参序列)，通过实时定量PCR测定标记序列的基因量的相对倍性改变，并由此确定21号染色体的数目及作出诊断(正常人两序列基因量相对倍性为1，而21三体为1.5)。但由于21三体与正常人在21号染色体基因量上的差异仅1.5倍，要稳定地从定量结果上获得这种差异并非易事，这对实时定量PCR的方法学有很高要求。已有研究者通过分管扩增目标基因及内参基因、采用绝对定量的方法在21三体分子诊断上进行了探索[9]。但分管实验中的一些因素，如孔间差异、模板加样差异等，都可以导致结果完全不同；另外，绝对定量的方法不仅影响检测通量，用不同于模板的标准品绘制的标准曲线还有可能得到错误的结果。
对于21三体检测来说，只需要确定21号染色体数目相对于其它染色体(无单体或三体改变)数目的差异，因此更为理想的方法是能准确可靠地测定这种相对差异。测定相对差异的Delta ct方法与一般使用的基于标准曲线的绝对定量方法在理论上是一致的，是由公式Rn＝Ro(1+E)Ct推导而来(其中Ro是起始模板量，ct是到达阈值时的循环数，Rn是扩增进行到ct循环时的拷贝数，E为扩增效率)。从该公式可看到，当用于比较的目标序列和内参序列扩增效率一致时，两序列基因量的相对倍性取决于ct值的差异(即delta ct)，换句话说，可根据不同的delta ct值(或范围)来判断基因量的相对倍性并由此确定21号染色体的数目。相对于建立在标准曲线基础上的绝对定量方法，基于delta ct值检测的相对定量方法由于无需建立标准曲线，不仅检测通量更大，而且更加准确、方便。另外，由于目前实时定量仪器已可以进行多色检测，采用多重实时定量PCR方法同管扩增目标序列和内参序列，可避免加样和孔间差异导致的检测误差，也使结果更加真实、可信。
迄今为止，国内外尚未见采用多重实时定量PCR检测21号染色体数目并由此检测21三体的报道。
发明内容
本发明应用基因组特异性单拷贝序列作为染色体的分子标记，在21号染色体的唐氏综合征关键区域选择DSCR4基因的部分非多态性片段为目标序列(目标分子标记)，在1号染色体上不易发生缺失或三体的区域选择RABIF基因的部分片段为内参序列(内参分子标记)。设计两对引物及相应的Taqman探针，采用多重实时定量PCR技术同管扩增这两个序列，通过反映相对量的delta ct(相对定量方法)来确定21号染色体的数目并由此检测21三体。
具体步骤如下1.染色体的分子标记选择21号染色体上的目标序列(目标分子标记)GTTGATGGGC TTGCGCTTAT CTGCTTGTCC CTTCTCCCAT CTGATTTCTT GTGGAGCCCA TGG其中，上游引物序列5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探针序列5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1号染色体上的内参序列(内参分子标记)TCAACATGGG CCCCACATGG TCCTAGTTTC CCCGGCTCAT TATGCTTCAG GCACACTGGCTTTCTTGC其中，上游引物序列5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探针序列5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’2.标本制备标本为0.2ml新鲜EDTA抗凝全血或10ml羊水(1000rpm 15min离心沉淀胎儿细胞，并稀释于0.2ml PBS缓冲液中)，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国Qiagen公司)提取DNA，用紫外分光光度计(Biorad)检测DNA纯度及浓度。
3.多重实时定量PCR扩增采用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪同管扩增目标序列及内参序列。反应体系25μl，含基因组500～25000拷贝，加入两对引物各500nM，相应Taqman探针各200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX200nM。反应条件95℃5min预变性；95℃ 30S，60℃ 30S，两步法40个循环。
4.定量分析方法采用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪随机附带软件进行定量分析。分析参数设定阈值设定原则以阈值线刚好超过无规则的噪音线的最高点，本发明体系设置为0.14；基线范围起点为第6个循环，终点为同板反应最小ct值的前1-3个循环。
软件自动输出在设定条件下的各扩增片段的ct值，计算delta ct值(21号目标序列ct值减去1号内参序列ct值)。正常人(或胎儿)与21三体患者(或胎儿)有截然不同的delta ct范围(具体范围与标本制备方法、探针来源及反应体系成分有关，本发明体系设置为delta ct在-0.6～0.4时为正常；delta ct在-1.8～-0.7时为21三体)，以此判定21号染色体数目。
本发明的有益之处是利用特异性单拷贝基因与染色体数目的1∶1对应关系，从21号染色体唐氏综合征关键区域选取无多态性的单拷贝基因序列为目标序列，以及从1号染色体上不易发生缺失或三体区域选取另一单拷贝基因序列为内参序列，应用多重实时定量PCR技术同管扩增这两个序列，通过判断它们基因量的相对倍性(delta ct方法)来确定21号染色体数目并由此检测21三体。本发明将染色体的数目分析转化为分子信号检测，充分利用分子定量的优势，能够快速、简便、灵敏、准确、高通量和自动化地检测21三体综合征。
具体实施例方式
实施例一1.染色体的分子标记选择21号染色体上的目标序列为GTTGATGGGC TTGCGCTTA TCTGCTTGTCC CTTCTCCCAT CTGATTTCTT GTGGAGCCCA TGG其中，上游引物序列5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探针序列5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1号染色体上的内参序列为TCAACATGGG CCCCACATGG TCCTAGTTTC CCCGGCTCAT TATGCTTCAG GCACACTGGCTTTCTTGC其中，上游引物序列5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探针序列5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’2.标本制备标本为0.2ml新鲜EDTA抗凝全血或10ml羊水(1000rpm 15min离心沉淀胎儿细胞，并稀释于0.2ml PBS缓冲液中)，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国Qiagen公司)提取DNA，用紫外分光光度计(Biorad)检测DNA纯度及浓度。
3.多重实时定量PCR扩增采用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪同管扩增目标序列及内参序列。反应体系(日本Takara公司)25μl，含基因组500～25000拷贝，加入两对引物各500nM(上海生工合成)，相应Taqman探针(美国ABI公司)各200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX(英国Abgene公司)200nM。反应条件95℃ 5min预变性；95℃ 30S，60℃ 30S，两步法40个循环。
4.定量分析方法采用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪随机附带软件进行定量分析。分析参数设定阈值设定原则以阈值线刚好超过无规则的噪音线的最高点，本发明体系设置为0.14；基线范围起点为第6个循环，终点为同板反应最小ct值的前1-3个循环。
软件自动输出在设定条件下的各扩增片段的ct值，计算delta ct值(21号目标序列ct值减去1号内参序列ct值)。正常人(或胎儿)与21三体患者(或胎儿)有截然不同的delta ct范围(具体范围与标本制备方法、探针来源及反应体系成分有关，本发明体系设置为delta ct在-0.6～0.4时为正常；delta ct在-1.8～-0.7时为21三体)，以此判定21号染色体数目。
实施例二采用本发明检测方法对250例正常血标本、38例21三体血标本、400例正常羊水标本、11例21三体羊水标本(羊水标本中有胎儿细胞)进行了多批次反复试验，以同期进行的染色体G带分析为检测标准，结果见表1
按照我们确定的检测范围，本发明方法对21三体的检测灵敏度达100％，特异性95.6％，假阳性率4.4％，假阴性率为0。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的部分参考文献1.Connor M.1993.Biochemical screening for Down’s syndrome.Bmj 3061705-1706.
2.Yurov YB，Laurent AM，Marcais B，et al.1995.Analysis of per icentromeric chromosome 21specific YAC clones by FISHidentification of new markers for molecular cytogeneticapplication.Hum Genet，95287-292.
3.Hsien-Hsiung Lee，Jan-Gowth Chang，Shuan-Pei Lin，et al.1997.Rapid detection of trisomy21 by homologous gene quantitative PCR(HGQ-PCR).Hum Genet，99364-367.
4.Yang YH，Kim IK，Oh SH.1998.Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 by polymerase chainreaction-associated analysis of small tandem repeats and S100 B in chromosome 21.FetalDiagn Ther，！3361-366.
5.王修海，刘雪霞。2003。快速检测21三体综合征基因诊断方法的研究。中华检验医学杂志，26559-561。
6.Heid CA，Stevens J，Livak KJ，et al.1996.Real time quantitative PCR.Genome Res.6986-994.
7.Chiu RW，Murphy MF，et al.2001.Determination of RHD zygositycomparison of a doubleamplification refractory mutation system approach and multiplex real-time quantitative PCRapproach.Clin Chem.47667-672.
8.Bieche l，Olivi M，et al.1998.Novel approach to quantitative polymerase chain reaction usingreal-time detectionL application to the detection of gene amplification in breast cancer.Int JCancer.78661-666.
9.郑明明，胡娅莉等。2004。实时荧光定量聚合酶链反应技术在产前诊断唐氏综合征中的应用。中华妇产科杂志，39678-681。
权利要求
1.检测人21号染色体数目的方法，其特征是通过应用基因组特异性单拷贝序列作为染色体的分子标记，在21号染色体的唐氏综合征关键区域选择DSCR4基因的部分非多态性片段为目标分子标记，在1号染色体上不易发生缺失或三体的区域选择RABIF基因的部分片段为内参分子标记，分别设计两对引物及相应的Taqman探针，采用多重实时定量PCR技术对目标分子标记和内参分子标记进行同管扩增，通过delta ct值来确定21号染色体数目并由此诊断21三体综合征，通过以下步骤实现(1)选择染色体的分子标记21号染色体上的目标分子标记为GTTGATGGGC TTGCGCTTAT CTGCTTGTCC CTTCTCCCAT CTGATTTCTT GTGGAGCCCA TGG其中上游引物序列5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探针序列5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1号染色体上的内参分子标记为TCAACATGGG CCCCACATGG TCCTAGTTTC CCCGGCTCAT TATGCTTCAG GCACACTGGCTTTCTTGC其中上游引物序列5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探针序列5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’(2)标本制备取新鲜EDTA抗凝全血或羊水，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取DNA，用紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度；(3)多重实时定量PCR扩增采用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪同管扩增目标分子标记及内参分子标记，反应体系25μl，含基因组500-25000拷贝，加入两对引物各500nM，相应Taqman探针200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX200nM，反应条件为95℃5分钟预变性；95℃30秒，60℃30秒，两步法40个循环；(4)定量分析采用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪随机附带软件进行定量分析，分析体系设置为0.14，基线范围起点为第6个循环，终点为同板反应最小ct值的前1-3个循环，软件自动输出各扩增片段的ct值，计算delta ct值，根据不同的delta ct范围来判断21号染色体数目。
2.根据权利要求1所述的检测21染色体数目的方法，其特征是步骤(4)中delta ct值等于21号目标分子标记ct值减去1号内参分子标记ct值，其中ct值是指达到阈值时的循环数。
3.根据权利要求1所述的检测21染色体数目的方法，其特征是步骤(4)中判断21号染色体数目的依据是delta ct在-0.6～0.4范围时为21号染色体数目正常；delta ct在-1.8～-0.7范围时为21三体。
全文摘要
本发明提供检测人21号染色体数目的方法，是应用基因组特异性单拷贝序列作为染色体的分子标记，在21号染色体的唐氏综合征关键区域选择DSCR4基因的部分非多态性片段为目标分子标记，在1号染色体上不易发生缺失或三体的区域选择RABIF基因的部分片段为内参分子标记。设计两对引物及相应的Taqman探针，采用多重实时定量PCR技术同管扩增这两个序列，通过反映相对量的delta ct值来确定21号染色体的数目并由此诊断21三体综合征。本发明将染色体的数目分析转化为分子信号检测，充分利用分子定量的优势，不仅方法简便、高度敏感、稳定和检测率高，而且还具有高通量和自动化的特点，在临床有极好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK1693480SQ20051004960
公开日2005年11月9日 申请日期2005年4月20日 优先权日2005年4月20日
发明者吕时铭, 朱宇宁, 裘俭, 朱波, 尤建飞 申请人:浙江大学医学院附属妇产科医院