水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，属于农业科学技术领域。所述的6号染色体上与稻飞虱耐害性相关的分子标记位于RM439与RM103之间，用分子标记RM439引物或者用分子标记RM103引物扩增水稻稻飞虱耐害性鉴定材料，若分别能够扩增出248bp和340bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在稻飞虱耐害性位点Qsbph6b。采用本发明的分子标记及其引物来检测水稻育种材料的稻飞虱耐害性水平，能极大地提高水稻的稻飞虱耐害性检测速度，提高水稻的产量和育种效率。
【专利说明】
水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物
技术领域
[0001]本发明涉及水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002]水稻(Oryzasativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，产量与播种面积均居世界首位。水稻是世界上约一半人口的主粮，世界上约有7.5亿贫民以稻米为生，而且每年还会增加大约5000万人口的稻米消费者。不仅如此，在亚洲，稻作、稻米还是生活方式、文化传统、风俗习惯、精神信仰等方面一种不可或缺的存在。所以，水稻生产的安全世界瞩目，水稻病虫害是制约水稻高产稳产的重要因素，而稻飞虱则是几十年来水稻生产中日益严重的巨大威胁。
[0003]稻飞虱(Rice planthopper)属同翅目飞虱科，俗名火蠓虫、白蚊、稻虱、稻浮尘子、火蜢子、厌虫、蚰虫、秧猛猛等，是亚洲各国水稻生产上最重要的害虫之一，给水稻生产造成了严重的损害。目前，为害水稻的飞虱主要有褐飞虱(Nilaparvata lugens)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)和白背飞虱(Sogatella furcifera)三种。稻飞虱广泛分布于南亚、东南亚、太平洋岛屿及日本、朝鲜和澳大利亚等地区，在中国各稻区均有分布。稻飞虱有远距离迀飞习性，在我国，稻飞虱为害经历了从局部稻区到整个稻区的演变过程。为害较重的是褐飞虱和白背飞虱，早稻前期以白背飞虱为主，后期以褐飞虱为主；中晚稻以褐飞虱为主;灰飞虱很少直接成灾，但能传播稻、麦、玉米等作物的病毒。由于稻飞虱体型小、迀飞繁殖力强、栖息荫蔽等特性，如遇田间适宜生境，易造成突发和爆发，猖獗发生时，每丛水稻上的虫口达3000余头，是目前影响我国水稻稳产、高产的主要虫害之一。
[0004]稻飞虱长翅型成虫均能长距离迀飞，趋光性强，且喜趋嫩绿。但灰飞虱的趋光性稍弱，成虫和若虫均群集在稻丛下部茎杆上刺吸汁液，遇惊扰即跳落水面或逃离。卵多产在稻丛下部叶鞘内，抽穗后或产卵于穗颈部内。褐飞虱取食时，口针伸至叶鞘韧皮部，先由唾腺分泌物沿口针凝成“ 口针鞘”抽吸汁液。植株嫩绿、荫蔽且积水的稻田虫口密度大。一般是先在田中央密集为害，后逐渐扩大蔓延。水稻孕穗至开花期的植株中水溶性蛋白含量增高，有利短翅型的发生。此型雌虫产卵量大，雌性比高，寿命长，常使褐飞虱虫口激增。在乳熟期后，长翅型比例上升，易引起迀飞。稻飞虱对水稻的为害，除直接刺吸汁液，使生长受阻，严重时稻丛成团枯萎，甚至全田死杆倒伏外，产卵也会刺伤植株，破坏输导组织，妨碍营养物质运输并传播病毒病。
[0005]目前防治稻飞虱主要措施是农业防治，以使用化学药剂为主，导致稻飞虱对多种杀虫剂产生了抗药性，从而使这种单一的防治措施面临严峻的挑战，此外，稻飞虱的迀飞特性及其传毒的瞬时性和持久性，致使防虫治病的效果不佳。生产上通常采用加大化学药剂的施用量来防虫治虫，导致稻飞虱天敌杀伤严重，严重伤害了田间生态平衡，从而使这种单一的防治措施面临严峻的挑战。利用品种自身的抗性一直被认为是防控稻飞虱危害最为经济有效的方法。目前生产上推广种植的粳稻品种大多感虫，因此，挖掘抗稻稻飞虱种质资源，选育高抗稻飞虱新品种，既能有效防止稻飞虱直接取食为害，也可以控制目前大爆发的条纹叶枯病、黑条矮缩病等病害，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对常规水稻育种中稻飞虱耐害性鉴定稳定性、重复性较差及费时费力等缺点，提供了水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，该分子标记及其引物可以预测水稻植株对耐害性的耐害性，简化了选择方法，进而加快了水稻稻飞虱耐害性品种的育种进程。
[0007]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于:用分子标记RM439引物或者用分子标记RM103引物扩增水稻稻飞虱耐害性鉴定材料，如果用分子标记RM439引物能够扩增出248bp的扩增片段，或用分子标记RM103引物能够扩增出340bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在稻飞虱耐害性位点Qsbph6b。
[0008]所述的与稻飞虱耐害性相关的分子标记的定位方法包含以下步骤:
(1)以水稻灰飞虱高感品种武育粳3号为母本，灰飞虱高耐害性品种冷水红为父本，配制杂种Fl，构建了包含214个单株的F2分离群体，通过F2单株自交获得214个F2:3家系；
(2)对F2:3家系采用水稻灰飞虱耐害性鉴定，获得各家系的耐害性测验值；
(3)采用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA;
(4 )用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的821对SSR引物(含128对自行合成引物)，对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增寻找两两之间同时具有稳定多态性的引物，用筛选到的204对多态性分子标记检测F2:3家系；
(5)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离(CM);
(6)米用基于复合区间作图法软件WindowsQTL Cartographer V2.5检测水稻灰飞虱的耐害性QTL，LOD值的阈值定为2.5，在5%的总体显著水平下检测QTL，检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置；
(7)获得水稻灰飞虱高耐害性品种冷水红耐害性位点Qsbph6b，位于第6号染色体分子标记RM439引物与分子标记RM103引物之间，通过检测第6号染色体上该两个引物标记的带型数据，可以预测该植株对稻飞虱的耐害性，大大提高稻飞虱耐害性水稻的选择效率。
[0009]所述的水稻灰飞虱耐害性鉴定的具体方案为:利用苗期集团筛选法对F2:3家系的214个株系进行了灰飞虱抗性鉴定，为确保各家系(品种)生长一致，所有供试材料分别浸种催芽;每个家系(品种)分别播种于一个直径8.0 cm、高9.0 cm、盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，每28钵置于65 cmX44 cmX14 cm的塑料箱内(箱内保持水层2 cm左右)，外加亲本和感虫对照各两钵;每钵播种25粒发芽种子，接虫前4天鉴苗，淘汰病弱苗，每钵保留15棵苗用于接虫;每个材料两钵，环境温度保持在26±2°C，自然光照，通风;待苗长到1.5-2.0叶时，按15头/苗的比例接入2-3龄灰飞虱若虫；当感虫亲本武育粳3号死苗率达70%时，调查亲本和各家系的单株死亡率，以存活率作为抗虫指标。
[0010]所述的用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2: 3定位群体单株的DNA的具体流程为:取
0.3-0.5g新鲜的水稻叶片，于液氮中研成粉;将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入500yLDNA提取缓冲液，置65°C温浴20min ；加入700yL氯仿/异丙醇，轻缓颠倒离心管混匀，12000r/min离心1min;转移上清液至另一离心管中，加入600yL异丙醇，12000r/min离心5min;弃上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min离心5min;弃70%乙醇，风干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存。
[0011 ]所述的对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增的PCR反应体系为:总体积为1yL，1mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2,50μΜ dNTPs，0.2μΜ 引物，0.5U Taq 酶和20ng DNA模板;PCR扩增程序为:94°C预变性5min;94°C变性lmin，55°C退火复性lmin，72°C延伸1.5min，共35个循环;最后72°C保温1min;扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染检测。
[0012]所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体方法为:100ml8%凝胶工作液配方为:ddH2070ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19: l)20ml，TEMED 10ul，10%AP 100ul;其中，10*TBE是将108g Tris碱和55g硼酸先溶解于蒸馈水，加40ml 0.5mol/L EDTACPH 8.0)，再加ddifeO定容到100ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是将38g丙烯酰胺和2g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，过滤后4°C保存。
[0013]所述的扩增稻飞虱耐害性位点Qsbph6b的分子标记引物选自分子标记RM439引物和分子标记RMl 03引物。
[0014]所述的分子标记引物在水稻育种快速筛选稻飞虱耐害性水稻品种或品系中的应用。
[0015]所述的RM439引物的上游引物序列为:5 ’ -TCATAACAGTCCACTCCCCC-3 ’，下游引物序列为:5 ’-TGGTACTCCATCATCCCATG-3 ’ ；所述的RM103引物的上游引物序列为:5 ’-CTTCCAATTCAGGCCGGCTGGC-3，，下游引物序列为:5 ’-CGCCACAGCTGACCATGCATGC-3 ’。
[0016]本发明所提供的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，具有稻飞虱耐害性位点位置明确、鉴定方便等优点。本发明通过检测6号染色体上与水稻稻飞虱耐害性QTL紧密连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的稻飞虱耐害性水平，大大提高了稻飞虱耐害性水稻的选择效率，加快了育种进程。
【附图说明】
[0017]图1所示Qsbph6b在染色体上的位置。
[0018]图2应用Qsbph6b紧密连锁的SSR标记预测水稻植株稻飞虱耐害性的电泳图谱。M:Mark; 1:武育粳3号；2:冷水红;3:Fl; 4_13:感稻飞虱水稻单株；14-23:稻飞虱耐害性水稻单株。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明，实施例中所用方法如无特别说明均为常规技术方法。
[0020]一、耐害性水稻的筛选与武育粳3号/冷水红F2群体构建:
多年的大田育种材料鉴定观察水稻品种冷水红对稻飞虱有较好的耐害性。冷水红，原产于河北省丰南县，是一种极为珍贵的优质米，被专家认定为是康熙皇帝“御田胭脂米”，当地人称它为“三伸腰”，又叫“黑谷子”。为准确鉴定冷水红对稻飞虱的耐害性水平，2012年正季于灰飞虱爆发时期从大田采集灰飞虱进行耐害性实验。耐害性实验方法如下:利用苗期集团筛选法对F2:3家系的214个株系进行了灰飞虱抗性鉴定，为确保各家系(品种)生长一致，所有供试材料分别浸种催芽;每个家系(品种)分别播种于一个直径8.0 cm、高9.0 cm、盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，每28钵置于65 cmX44 cmX 14 cm的塑料箱内(箱内保持水层2 cm左右)，外加亲本和感虫对照各两钵;每钵播种25粒发芽种子，接虫前4天鉴苗，淘汰病弱苗，每钵保留15棵苗用于接虫;每个材料两钵，环境温度保持在26± 2°C，自然光照，通风;待苗长到1.5-2.0叶时，按15头/苗的比例接入2_3龄灰飞虱若虫；当感虫亲本武育粳3号死苗率达70%时，调查亲本和各家系的单株死亡率，以存活率作为抗虫指标。冷水红和感虫水稻品种武育粳3号的耐害性测验值均值分别为72.6%与28.2%，表明冷水红对灰飞虱具有极佳的耐害性。2012年以水稻灰飞虱高感品种武育粳3号为母本，灰飞虱高耐害性品种冷水红为父本，配制杂种Fl，构建了包含214个单株的F2分离群体，2013年秋季通过F2单株自交获得214个F2:3家系。
[0021]二、对F2:3家系采用水稻灰飞虱耐害性鉴定，获得各家系的耐害性测验值；
2014年，采用同步骤一的耐害性方法检测F2:3家系对灰飞虱的耐害性，获得各家系的耐害性测验值。
[0022]三、SSR标记分析:
(I)采用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA;
(2 )用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的821对SSR引物(含128对自行合成引物)，对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增寻找两两之间同时具有稳定多态性的引物，用筛选到的204对多态性分子标记检测F2:3家系；
(3)CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA的具体流程为:取0.3-0.5g新鲜的水稻叶片，于液氮中研成粉;将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入500yL DNA提取缓冲液，置65°C温浴20min;加入700yL氯仿/异丙醇，轻缓颠倒离心管混匀，12000r/min离心1min；转移上清液至另一离心管中，加入600yL异丙醇，12000r/min离心5min；弃上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min离心5min ；弃70%乙醇，风干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存；
(4)对亲本、FI及F2:3定位群体进行PCR扩增的PCR反应体系为:总体积为10μL，1mMTris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，50μΜ dNTPs，0.2μΜ引物，0.5U Taq 酶和 20ngDNA模板;PCR扩增程序为:94 °C预变性5min ； 94 °C变性Imin，55 V退火复性Imin，72 °C延伸1.5min，共35个循环;最后72°C保温1min;扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染检测；
(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体方法为:10ml8%凝胶工作液配方为:ddH20 70ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19:1 )20ml，TEMED 10ul ,10% AP 100ul;其中，10*TBE是将 108gTris碱和55g硼酸先溶解于蒸馏水，加40ml 0.5mol/L EDTA(PH为8.0)，再加ddH20定容到1000ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是将38g丙烯酰胺和2g N，，N亚甲双丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，过滤后4°C保存。
[0023]四、水稻灰飞虱耐害性QTL定位:
(I)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离(CM);
(2)米用基于复合区间作图法软件WindowsQTL Cartographer V2.5检测水稻灰飞虱的耐害性QTL，LOD值的阈值定为2.5，在5%的总体显著水平下检测QTL，检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置；
(3)在6号染色体上检测到I个水稻灰飞虱耐害性QTL，L0D值为3.75，贡献率为32.1%，命名为Qsbph6b，位于第6号染色体分子标记RM439弓I物与分子标记RMl 03引物之间。
[0024]五、Qsbph6b进一步鉴定发现对白背飞虱和褐飞虱亦具有耐害性:
2015年，将武育粳3号/冷水红F2:3家系分别进行白背飞虱和褐飞虱耐害性检验，白背飞虱和褐飞虱耐害性检验方法采用苗期集团筛选法，发现Qsbph6b同时对白背飞虱和褐飞虱具有耐害性，Qsbph6b对白背飞虱耐害性检测LOD值为3.02，贡献率为22.3%，对褐飞虱耐害性检测LOD值为2.77，贡献率为18.3%。
[0025]六、通过检测第6号染色体上该两个引物标记的带型数据，预测植株对稻飞虱耐害性水平:
用分子标记RM439引物或者用分子标记RM103引物扩增水稻稻飞虱抗性鉴定材料，如果用分子标记RM439引物能够扩增出248bp的扩增片段，或用分子标记RM103引物能够扩增出340bp的扩增片段(如图2)，则标志着水稻材料内存在稻飞虱耐害性位点Qsbph6b，通过检测Qsbph6b的存在可以预测该植株对水稻稻飞虱的耐害性水平，大大提高稻飞虱耐害性水稻的选择效率。
[0026]上述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
【主权项】
1.水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于:用分子标记RM439引物或者用分子标记RM103引物扩增水稻稻飞虱耐害性鉴定材料，如果用分子标记RM439引物能够扩增出248bp的扩增片段，或用分子标记RM103引物能够扩增出340bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在稻飞虱耐害性位点Qsbph6b。2.根据权利要求1所述的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于所述的与稻飞虱耐害性相关的分子标记的定位方法包含以下步骤: (1)以水稻灰飞虱高感品种武育粳3号为母本，灰飞虱高耐害性品种冷水红为父本，配制杂种Fl，构建了包含214个单株的F2分离群体，通过F2单株自交获得214个F2:3家系； (2)对F2:3家系采用水稻灰飞虱耐害性鉴定，获得各家系的耐害性测验值； (3)采用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA; (4)用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的821对SSR引物(含128对自行合成引物)，对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增寻找两两之间同时具有稳定多态性的引物，用筛选到的204对多态性分子标记检测F2:3家系； (5)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离(CM); (6)米用基于复合区间作图法软件WindowsQTL Cartographer V2.5检测水稻灰飞虱的耐害性QTL，LOD值的阈值定为2.5，在5%的总体显著水平下检测QTL，检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置； (7)获得水稻灰飞虱高耐害性品种冷水红耐害性位点Qsbph6b，位于第6号染色体分子标记RM439引物与分子标记RM103引物之间，通过检测第6号染色体上该两个引物标记的带型数据，可以预测该植株对稻飞虱的耐害性，大大提高稻飞虱耐害性水稻的选择效率。3.根据权利要求2所述的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于所述的水稻灰飞虱耐害性鉴定的具体方案为:利用苗期集团筛选法对F2:3家系的214个株系进行了灰飞虱抗性鉴定，为确保各家系(品种)生长一致，所有供试材料分别浸种催芽;每个家系(品种)分别播种于一个直径8.0 cm、高9.0 cm、盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，每28钵置于65 cm X 44 cm X 14 cm的塑料箱内(箱内保持水层2 cm左右)，外加亲本和感虫对照各两钵;每钵播种25粒发芽种子，接虫前4天鉴苗，淘汰病弱苗，每钵保留15棵苗用于接虫;每个材料两钵，环境温度保持在26 ± 2°C，自然光照，通风;待苗长到1.5-2.0叶时，按15头/苗的比例接入2-3龄灰飞虱若虫；当感虫亲本武育粳3号死苗率达70%时，调查亲本和各家系的单株死亡率，以存活率作为抗虫指标。4.根据权利要求2所述的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于所述的用CTAB微量法提取亲本、Fl及F2:3定位群体单株的DNA的具体流程为:取0.3-0.5g新鲜的水稻叶片，于液氮中研成粉;将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入500yL DNA提取缓冲液，置65°C温浴20min;加入700yL氯仿/异丙醇，轻缓颠倒离心管混匀，12000r/min离心10min；转移上清液至另一离心管中，加入600yL异丙醇，12000r/min离心5min ；弃上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min离心5min；弃上清液，加入600ul的70%乙醇，12000r/min离心5min；弃70%乙醇，风干；加0.2mLTE，溶解后4 °C保存。5.根据权利要求2所述的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于所述的对亲本、Fl及F2:3定位群体进行PCR扩增的PCR反应体系为:总体积为 10yL，10mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2,50μΜ dNTPs，0.2μΜ引物，0.5UTaq酶和20ng DNA模板；PCR扩增程序为:94°C预变性5min; 94°C变性Imin，55 °C退火复性lmin，72°C延伸1.5min，共35个循环;最后72°C保温1min;扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染检测。6.根据权利要求5所述的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体方法为:100ml 8%凝胶工作液配方为:CldH2O 70ml，10*TBE 1ml，40% 丙烯酰胺(19: l)20ml，TEMED 100ul，10%AP 100ul;其中，10*TBE是将108g Tris碱和55g硼酸先溶解于蒸馏水，加40ml 0.5mol/L EDTACPH 8.0)，再加ddH20定容到1000ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是将38g丙烯酰胺和2g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至10ml，过滤后4°C保存。7.根据权利要求1所述的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于所述的扩增稻飞虱耐害性位点Qsbph6b的分子标记引物选自分子标记RM439引物和分子标记RMl 03引物。8.根据权利要求7所述的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于所述的分子标记引物在水稻育种快速筛选稻飞虱耐害性水稻品种或品系中的应用。9.根据权利要求1、2和7所述的水稻6号染色体上一个与稻飞虱耐害性相关的分子标记及其引物，其特征在于所述的RM439引物的上游引物序列为:5 ’ -TCATAACAGTCCACTCCCCC-.3 ’，下游引物序列为:5 ’-TGGTACTCCATCATCCCATG-3 ’ ；所述的RM103引物的上游引物序列为:.5 ’-CTTCCAATTCAGGCCGGCTGGC-3，，下游引物序列为:5 ’-CGCCACAGCTGACCATGCATGC-3 ’。
【文档编号】C12N15/11GK105861723SQ201610385069
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】不公告发明人
【申请人】陈丁龙