专利名称：水稻细胞色素p450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻细胞色素P450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留。
背景技术：
利用生物技术发展生态农药是现代农业研究的一个重要方向，可以缓解农民负 担、减少生态环境污染和降低因大量农药残留造成的人类健康危害。细胞色素P450 酶系是结合在内质网膜上含硫醇血红素的氧化酶。细胞色素P450超基因家族存在很 强的生物多样性，广泛参与动植物的各类生命活动，比如生物分子合成、解毒和药物 代谢途径。利用功能基因组学和生物信息学手段，研究整合生物代谢途径中的细胞色 素P450家族的功能信息，研究预测与降解农药残留相关的水稻P450基因，将有利于 生产我国自主性的生态农药。以信号受体和转录途径组分分析为基础可进行农用化合 物设计，结合化学信息学方法，可鉴定用于杀虫剂和除草剂的潜在化学成分。
发明内容
本发明的目的是提供水稻细胞色素P450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草 剂的残留。
本发明所提供的辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的引物，是由序列表中序列 1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。该引物对是根据水稻细胞色 素P450基因序列设计的，细胞色素P450基因命名为CYP709C9 ，其NCBI定位号为 NP—001059471， NCBI基因号(GENE ID)为0s07g0418500， DBJ号为AK072220， TIGR 号为L0C一0s07g23570，全长cDNA序列长度为1560个核苷酸，定位于第七号染色体从 13， 322， 237bp到13， 324， 707bp，该基因编码的蛋白共有519氨基酸。CYP709C9基因 的表达受除草剂的诱导，所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲 基紫精。
本发明的另一个目的是提供一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法。 本发明所提供的辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法，是将在不含除草剂 的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总RNA反 转录获得的cDNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为 引物，进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线计算待检测的植物培养基质的水稻 的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质的水稻的总 RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于2.0土0.05，待测植物培的候选植物培养基质。
所述的植物培养基质可为任何可培养植物的液体或固体基质，如培养液、土壤、 蛭石等。
当所述待测的植物培养基质为液体时，可将在不含除草剂的植物培养基质中培养 的水稻移栽到所述待测的植物培养基质中6小时-24小时；当所述待测的植物培养基
质为固体时，可将所述待测的植物培养基质用5ral/100ml二甲亚砜水溶液浸泡，收集 浸出液；将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中 6小时-24小时。进行所述移栽的水稻可处于二叶期-四叶期。所述除草剂为二氯喹啉 酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。
通过本发明提供的辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法，可初步鉴定植物 培养基质中是否有除草剂残留，再结合现有的仪器分析方法可确定植物培养基质中是 否有除草剂残留。
为了方便、快速辅助鉴定植物培养基质中中除草剂残留，本发明还提供了一种专 用的荧光定量PCR试剂盒，该荧光定量PCR试剂盒包含一对引物，该引物对由序列表 中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成。
本发明根据一个对多种除草剂具有明显应答特征的水稻细胞色素P450基因的基 因序列设计了一对引物，用该引物对可辅助检测植物培养基质中是否有除草剂残留。 利用本发明的辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法可对植物培养基质进行初 步筛査，将筛出的候选植物培养基质再用现有的仪器分析方法进行确定有无除草剂残 留，可大大降低仪器分析的工作强度，使对植物培养基质中除草剂残留的检测快速简 便。
图1为水稻细胞色素P450基因，CYP709C9，在水稻基因组序列上的位置示意图 及基因结构。
图2为CYP709C9基因在二氯喹啉酸的处理条件下表达变化。 图3为CYP709C9基因在多种除草剂的处理条件下表达变化。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 下述实施例中的水稻品种来自国家种质资源库。 实施例1、 CYP709C9在基因组序列的定位及引物设计
通过Blast分析，将已命名的水稻细胞色素P450基因和TIGR水稻数据库中的基 因位点对应起来，CYP709C9对应LOC—Os07g23570，位于第七号染色体第13， 322， 237bp到13， 324， 707bp，具有三个外显子和两个内含子，该基因的结构如图l所示。根据 CYP709C9的mRNA序列,用primer3工具，在CYP709C9的mRNA序列靠近3'端设计 一对特异引物ChemR4-1和ChemR4-2，引物ChemR4-1和ChemR4-2的序列分别为序列 表中的序列1和序列2。
实施例2、用引物ChemR4-1和ChemR4-2检测CYP709C9在除草剂处理下的表达 以5ml/100ml 二甲亚砜水溶液为溶剂分别配制浓度为1. 65mM 二氯喹啉酸溶液、 浓度为19. 98mM苯达松溶液、浓度为1. 31raM甲磺隆溶液、浓度为1. 75mM异恶草酮溶 液和浓度为10wM甲基紫精溶液。
在正常生长条件下(温度为28。C / 25°C ，相对湿度83%， 12小时昼夜循环)生 长的水稻日本晴的幼苗，在两叶一心期分别用1.65mM二氯喹啉酸溶液、19.98mM苯达 松溶液、1.31mM甲磺隆溶液、1.75mM异恶草酮溶液和10nM甲基紫精溶液喷雾处理， 以用5ml/100ml二甲亚砜水溶液喷雾处理作为对照，实验重复3次，每个重复处理 10-20株水稻。
提取1. 65raM 二氯喹啉酸溶液处理3小时、6小时和24小时及5ml/100ml 二甲亚 砜水溶液处理3小时、6小时和24小时的水稻日本晴幼苗的总RNA，反转录成cDNA; 以反转录后的cDNA为模板，ChemR4-1和ChemR4-2为引物通过实时荧光定量PCR技术 检测CYP709C9的表达水平。
取上述5种除草剂处理6小时的水稻日本晴幼苗和对照幼苗分别提取总RNA，反 转录成cDNA;以反转录后的cDNA为模板，ChemR4-1和ChemR4-2为引物通过实时荧 光定量PCR技术检测CYP709C9的表达水平。
荧光定量PCR反应条件如下
以18S rRNA作为内标，按下列条件进行实时荧光定量PCR反应，反应体系IO u L: 10XPCR Buffer 1 u L， 25mmol/L Mg2+ 1 u L， 10 mmol/L dNTPs 0. 5 u L， 25 14 mol/L 上下游引物各O. 25 uL， cDNA模板l u L， Taq酶(Promega) 0.25 ix L， 20XSYBR Green I 0. 5 u L， ddH20 6. 25 u L。
检测CYP81A6的表达水平实时荧光定量PCR的反应条件95。C变性3 mi n，循环40 次9 5 。C变性4 0 s — 6 1 。C退火2 5 s — 7 2 。C延伸l mi n 20 s，融解95 。C 0 s(20。C/s)—71°C 15 s(20。C/s—95°C0 s(0.rC/s)，冷却40。C 30 s(20°C/s)。 所有荧光定量PCR反应均在LightCycler (Roche)上进行。
实时荧光定量PCR结果表明，1. 65rnM 二氯喹啉酸处理3小时开始CYP709C9的表 达水平就已经高于对照，此时1. 65mM 二氯喹啉酸处理组与对照组的CYP709C9的拷贝 数比值为7. 18; 1. 65mM 二氯喹啉酸处理24小时，CYP709C9的表达水平仍高于对照，
5此时1. 65rnM 二氯喹啉酸处理组与对照组的CYP709C9的拷贝数比值为7. 59。(图2) 图2中"1"代表用5ml/100ml 二甲亚砜水溶液处理3小时，"2"代表二氯喹啉 酸处理3小时，"3"代表用5ml/100ml 二甲亚砜水溶液处理6小时，"4"代表二氯 喹啉酸处理6小时，"5"代表用5ml/100ml 二甲亚砜水溶液处理24小时，"6"代 表二氯喹啉酸处理24小时。
虽然不同除草剂的处理CYP709C9的应答不同，但经6小时的二氯喹啉酸、苯达 松、甲磺隆、异恶草酮和甲基紫精处理后，CYP709C9的表达水平均明显高于对照组。 此时，二氯喹啉酸处理组与对照组的CYP709C9的拷贝数比值为16.37，苯达松处理组 与对照组的CYP709C9的拷贝数比值为75. 24，甲磺隆处理组与对照组的CYP709C9的 拷贝数比值为3. 12，异恶草酮处理组与对照组的CYP709C9的拷贝数比值为53. 44， 甲基紫精处理组与对照组的CYP709C9的拷贝数比值为12.51。其中，异恶草酮和苯达 松的诱导作用最强，二氯喹啉酸和甲基紫精次之，甲磺隆较弱(图3)。图3中"1" 代表用二氯喹啉酸处理6小时，"2"代表用苯达松处理6小时，"3"代表用甲磺隆 处理6小时，"4"代表用异恶草酮处理6小时，"5"代表用甲基紫精处理6小时。序列表
〈110〉 中国农业大学
〈l加〉水稻细胞色素P450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留
<130> CGGNARW81585
<歸 2
<210〉 1 〈211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220> 〈223>
<400〉 1
cctaaggctg tacagccctg 20
〈210〉 2
<211> 20
<212> 腿 <213>人工序列
<220> <223>
<400> 2
3tcgggatcg tc肌tagtgc 20
权利要求
1、一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
2、 根据权利要求l所述的引物，其特征在于所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达 松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。
3、 一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法，是将在不含除草剂的植物 培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总RNA反转录获 得的cDNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物， 进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线计算待测的植物培养基质中的水稻的总RNA 中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质中的水稻的总RNA中特 异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于2.0士0.05，待测植物培养基质为 有除草剂残留的候选植物培养基质。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述待测的植物培养基质为液体， 将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到所述待测的植物培养基质中6小 时-24小时。
5、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述待测的植物培养基质为固体 时，将所述待测的植物培养基质用5ml/100ml的二甲亚砜水溶液浸泡，收集浸出液； 将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中6小时 -24小时。
6、 根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于所述移栽的水稻处于二 叶期-四叶期。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达 松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。
8、 一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒 包括一对引物，其特征在于所述引物对是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2 的核苷酸序列组成。
9、 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。
10、 权利要求1所述的引物在鉴定水稻生长中有无喷施除草剂的应用。
全文摘要
本发明公开了水稻细胞色素P450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留。该引物是由序列表中序列1和序列2组成的。本发明公开的方法，是将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总RNA反转录获得的cDNA为模板，用上述引物进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线计算待检测的植物培养基质中的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质中的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于2.0±0.05，待测植物培养基质为有除草剂残留的候选植物培养基质。本发明的方法使对植物培养基质中除草剂残留的检测快速简便。
文档编号C12Q1/68GK101643775SQ20081011801
公开日2010年2月10日 申请日期2008年8月6日 优先权日2008年8月6日
发明者周少霞, 张盖华, 徐文英, 震 苏, 超 邸 申请人:中国农业大学