一种人肝脏细胞色素p450基因及其应用的制作方法

专利名称：：一种人肝脏细胞色素p450基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，涉及一种人肝脏细胞色素P450基因及其应用。
背景技术：
：有机磷农药是当今农药中的主要类别，由于其毒性高、作用范围广的特点，一直在国内外大量生产和广泛使用。目前世界上的有机磷农药商品已达上百种，我国使用的有机磷农药有30余种，占我国农药使用量的70%以上。随着国家对高毒有机磷农药(甲胺磷、甲基对硫磷等)的全面禁止生产、销售和使用，毒死蜱等中毒性的有机磷品种被广泛推广和大量使用，现已成为世界生产和销售最大的有机磷农药之一。有机磷农药均具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能，对人存在着程度不同的毒性，急性中毒可引起人肌肉痉挛、瞳孔收縮、呼吸困难直至死亡。残留在蔬菜、水果等食品上的低剂量有机磷农药对人可产生慢性毒性，长期低剂量接触，可引起迟发性神经疾病，严重时可诱发突变和致癌作用。据统计，目前食品中农药检出率高达90%以上，农药污染超标占总产量的17.7%，每年因此而中毒的人数已达10万余人，病死率近20%。毒死蜱(chlorpyrifos)是一种高效、广谱、中等毒性的有机磷农药，又名乐斯本、白蚁清，化学名称为0，0-二乙基-0-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，作为卫生杀虫剂，可以用来防治白蚁、虱子、跳蚤和蟑螂等多种卫生害虫；作为农用杀虫剂，广泛用于治多种作物上的粘虫、介壳虫、蚜虫和螨类等害虫。虽然毒死蜱在卫生和农业中广泛使用，但是其潜在的危害性不容忽视。毒死蜱对人的神经系统和脑发育存在潜在的影响，直接危害到人畜的健康及生命。随着人们生活质量的提高和环保意识的加强，毒死蜱等有机磷农药的毒害问题越来越受到人们的关注，因此迫切需要研究人体参与降解有机磷农药的机制，从而为人们的身体健康提供保证。肝脏是药物和外源毒物代谢的主要组织，人肝脏中的P450是人体内的主要降解酶类之一。细胞色素P450(简称P450)是广泛存在于生物体内的一类具有降解功能的血红素末端氧化酶系，是生物体内参与有毒物质代谢的主要解毒酶系，肝脏中的P450含量最丰富，且具有重叠的底物专一性。P450还参与代谢除草剂、杀虫剂、药物、环境污染物等多种有毒物质。迄今，P450超家族己有480多个成员，分属74个家族，而且不断有新家族、新成员被发现。随着对P450蛋白组成及结构等生化特征的日益全面阐明，目前关于P450的研究更多的集中在它所参与的生物体内代谢途径及催化机制。细胞色素P450在哺乳动物肝、肾等组织中广泛存在，它们可以通过氧化作用参与外来药物的代谢和机体自身激素类化合物的合成。据报道，在人体内90%以上的药物是人肝脏里的11种P450蛋白(CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4)代谢的。同时，许多资料表明肝脏中的P450在有机磷农药降解也中发挥着重要的作用。如人肝脏中P450能通过脱硫反应将毒死蜱代谢为chlorpyrifos-oxon(CPO)，也可以通过脱芳基反应降解毒死蜱。在人淋巴细胞中表达人CYP基因发现，CYP1A2，CYP2B6，CYP2C19，CYP3A4对毒死蜱有降解作用，而且肝脏微粒体中CYP2B6，CYP2C19和CYP3A4的相对含量直接影响到肝脏对毒死蜱的代谢方式。目前己知资料都表明，利用肝脏中的P450进行有机磷农药降解具有良好的前景和独特的优势。
发明内容本发明解决的问题在于提供一种人肝脏细胞色素P450基因，该基因具有降解有机磷农药功能，可用于建立有机磷农药在肝脏中代谢的体外模型以及制备人用有机磷农药解毒制剂。本发明是通过以下技术方案来实现一种人肝脏细胞色素P450基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。所述人肝脏细胞色素P450基因第1781737bp为开放读码框，编码520个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。所述人肝脏细胞色素P450基因应用于有机磷农药解毒制剂的制备。包含人肝脏细胞色素P450基因的表达载体、转化体或者其编码的氨基酸应用于有机磷农药解毒制剂的制备。所述包含人肝脏细胞色素P450基因的表达载体是pET32a-P450-DSP國GZ。所述包含人肝脏细胞色素P450基因的转化体，其宿主细胞是大肠杆菌BL21，转染宿主细胞的包含P450基因的表达载体是pET32a-P450-DSP-GZ。与现有技术相比，本发明公开了一种具有降解有机磷农药功能的新的人肝脏细胞色素P450基因，构建包含该基因的表达载体pET32a-P450-DSP-GZ，转染大肠杆菌BL21后得到具有降解有机磷农药毒死蜱功能的转化体；目前主要采用DNA重组技术，建立cDNA文库直接从人细胞瘤或者哺乳动物肝脏中直接克隆细胞色素P450基因，这种方法存在试验周期长、工作量大等缺点；与之相比，本发明利用体外梯度浓度的毒死蜱诱导人肝脏细胞，经过体外诱导后，具有降解有机磷农药功能的细胞色素P450基因得到特异性的表达，利用mRNA差异显示技术分离克隆到的细胞色素P450基因更具有针对性，而且克服了构建cDNA文库过程中的困难，大大减轻了工作量，实验周期短，所需起始材料少，灵敏度高，操作简便；鉴于P450表达的多样性，为了尽可能多的从被诱导的人肝脏细胞中获得P450片段，本发明联合使用mRNA差异显示方法和RACE技术获得一系列的P450靶基因，并根据P450保守的特征序列设计上游特异性引物代替随机引物，采用该方法可以筛选到几乎所有表达的P450基因，并且有利于扩增到新的细胞色素P450基因；本发明公开的人肝脏细胞P450基因应用于有机磷农药解毒制剂的制备:1)构建包含人肝脏细胞P450基因的重组表达载体，转化宿主细胞，表达人肝脏细胞P450基因，用于体外研究有机磷农药代谢特性及毒理作用；2)对转染人肝脏细胞P450基因的转化体所表达的P450-DSP-GZ蛋白进行纯化，并以其为抗原进一步制备其特异性抗体，用于该基因的表达量测定，为制备人用有机磷农药解毒制剂奠定基础；3)检测人肝脏细胞P450基因的mRNA的表达水平，以评估其他药物对人肝脏P450基因表达的诱导或抑制作用；4)利用该P450基因制备转基因植物，获得具有降解有机磷农药功能的转基因植物，进一步用于农药污染地区的土壤净化。5)用于建立有机磷农药在肝脏中代谢的体外模型以及制备人用有机磷农药解毒制剂，为研究人肝脏中有机磷农药的代谢特性及药物相互作用提供了试验依据和技术平台。图1是经毒死蜱诱导后人肝脏细胞总RNA样品甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果图；图2是P450cDNA基因3'RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图3是P450cDNA基因5'RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图4是P450基因最大读码框扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图5是P450-DSP-GZ转化大肠杆菌BL21SDS-PAGE分析结果图；图6是P450-DSP-GZ转化大肠杆菌BL21的Western-blot分析结果图；图7是转化pET32a-P450-DSP-GZ的大肠杆菌对毒死蜱的降解效率曲线具体实施方式本发明利用体外浓度梯度的毒死蜱诱导人肝脏细胞，经过体外诱导后，具有降解有机磷农药的细胞色素P450基因得到特异性的表达，利用mRNA差异显示技术克隆到的细胞色素P450基因更具有针对性。mRNA差异显示方法是近几年来发展起来的用于研究基因诱导后表达变化的有效方法。mRNA差异显示的基本原理为利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成双链cDNA,再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。其技术一般包括下列步骤1)从目时组织中提取总RNA，在这个步骤中注意不能有DNA污染；2)在逆转录酶作用下，以01igoTllMN为引物(M为G、A、C中的任一种，N为A、C、G、T任一种)，进行逆转录；3)PCR反应，扩增cDNA的第一条链；4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开；5)找出差异显示的条带，从胶上切割下来并回收，进行第二次扩增；6)对目的片段进行测序；7)以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。鉴于P450表达的多样性，为了尽可能多的从被诱导的人肝脏细胞中获得P450片段，本发明使用RACE技术结合mRNA差异显示方法获得一系列的P450耙基因，并根据P450保守的特征序列设计特异性引物代替随机引物。RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3，端和5，端的方法。一7般分5，和3，RACE两种。3，RACE是首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。目前有几种5'RACE，其一为加接头，根据接头引物和设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环再PCR。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定1、有机磷农药毒死蜱诱导培养人肝脏细胞人肝脏细胞培养按照Liddle法[LiddleC,ModeA,LegravendC,efa/.ConstitutiveexpressionandhormonalregulationofmalesexuallydifferentiatedcytochromeP450inprimaryculturerathepatocytes[J].1992,198(2):159-166]，每孔lxl0"2xl(^个细胞培养于新鲜的6孔培养板中，在培养基中分别加入lml含有毒死蜱(2、4、6、8、10pmol/L)进行诱导，置二氧化碳培养箱中37"C培养，定时观察细胞的存活率；取10pmol/L毒死蜱诱导36h，且生长旺盛的肝脏细胞用于RNA提取。2、毒死蜱诱导的人肝细胞总RNA提取使用Trizol试剂盒从10pmol/L毒死蜱诱导的人肝脏细胞中提取总RNA，利用RNA样品甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确定所获得RNA的浓度和完整性，结果如图l所示，从电泳结果可以看出，总RNA的28S和18S条带均很清晰、完整。经紫外分光光度计测定，总RNA的纯度(A260/A280)约为1.95，其质量能够保证进行下面的mRNA差异显示和cDNA全长的获得。3、从毒死蜱诱导培养人肝脏细胞中克隆P450基因1)人肝脏细胞P450基因的3'cDNA基因的克隆①cDNA第一链的合成取1lpL经DNaseI处理过的总RNA，力BlpiLlOpmol/LRACE试剂盒中的接头引物(AdapterPrime,AP)，70'C温育10min，冰上冷却至少lmin。轻微离心后依次加入2pL10XPCRBuffer、2pL25mmol/LMgCl2、ljiL10mmol/LdNTPs和2jiLO.lmol/LDTT混匀，稍离心。于42。C温育5min后，加入1jliLSuperscriptIIRT混匀，于42。C温育50min。于70。C温育15min终止反应，置于冰上。稍离心收集反应液，力nipLRNaseH，37。C温育20min，4"C贮存备用。②mRNA差异RT-PCR显示分析设计引物在P450基因的结构中，最保守的部分是跨膜信号序列和血红素结合区，也是判断P450的标志。根据GenBank中P450氨基酸保守序列[PFG]设计引物上游引物为针对P450血红素结合区保守的碱基序列设计合成特异性引物P:CgCCtttCgg10;下游引物T1为ClonTech试剂盒中的锚定引物，Tl为cattatgctgagtgatatctttttttttgc30;以总RNA的转录产物cDNA第一链为模板，以特异性引物P和锚定引物Tl为引物对毒死蜱诱导的肝脏细胞中P450基因表达情况进行分析；PCR参数94。C变性5min,前5个循环94°C，30s;40°C，2min;75°C，30s;后35个循环94°C，30s;48°C，2min;75°C，30s，72°C5min。PCR扩增后，经变性凝胶电泳和银染。由于PFG位于终止密码子上游100-200bp处，3'-非翻译区核苷酸长度一般在100-300bp间，因此PCR产物长度在200-500bp范围内。选取200-500bp之间的条带，用干净的刀片将目标条带放入0.5mLEP管中，用吸头捣碎，加入40pL无菌蒸馏水，12000g离心2min，取2pL上清液进行50pLPCR反应，PCR反应体系同上。PCR产物经电泳后，用干净的刀片将目标条带切下，利用胶回收试剂盒回收片段。如图2所示的3'RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:为DL20009Marker,从上到下依次为2000，1000,750,500，250,謂bp;泳道2-6:为不同的目的片段经PCR扩增后，胶回收的电泳结果。③P450基因片段的筛选参照pGEM-TEasy载体说明书，将回收片段克隆入pGEM-TEasy载体中，转化五."//感受态细胞丁010,进行蓝白斑筛选，从平板上挑取白色菌落培养后提取质粒DNA，进行PCR鉴定，PCR反应体系同上。对阳性克隆测序，测序结果用DNAMAN软件翻译成氨基酸。氨基酸序列中含有P450保守序列[PFG]的基因即为P450基因的3'RACE，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，该片段长298bp,编码区长163bp，非编码区135bp。在poly(A)上有加尾信号，说明该P450cDNA的3'非编码区是完整的。2)人肝脏细胞P450基因5'cDNA基因的克隆①反转录产生cDNA模板并给cDNA加接头引物以毒死蜱诱导的肝脏细胞中总RNA为模板，以AP为引物反转录产生cDNA,纯化反转录的cDNA。参照5，RACE试剂盒中的加尾反应建立体系，给cDNA加接头引物。具体操作如下DEPC处理过的双蒸水6.5pL，5x加尾缓冲液5pL，2mMdCTP2.5pL，纯化的cDNA10piL。94。C温育3min，冰上放置lmin，收集产物置于冰上。加入lpLTdT，轻轻混合，37。C温育10min。65。C温育10min，离心收集产物，置于4t贮存。②P450基因的5'cDNA基因的克隆及序列测定根据P450基因的3'RACE的测序结果，用DNAMAN软件设计用于扩增P450基因的5，RACE的特异性引物(GeneSpecificPrime,GSP)，其核苷酸序列为-tccaatgcaattcctaggtcca肪cccgaaagg33，同时结合RACE剂盒中的通用引物(AbridgedUniversialAmplificationPrime,AUAP)对加接头引物的cDNA模板进行PCR扩增；其中，10AUAP的核苷酸序列为ggccacgcgtcgactagtac20。PCR扩增体系组成为5pL10xPCRBuffer、lpL1Ommol/LdNTPs、3pL25mmol/LMgCl2、引物10jimol/L的GSP和AUAP分别为lpL、5pL，加接头引物的cDNA模板、2.5UTaq酶，双蒸水补足50pL。PCR扩增程序如下94。C变性5min后，94°Clmin，50°Clmin，72°C15min，完成35个扩增循环，最后于72。C延伸5min,冷却至4'C保存备用。按照3'RACE克隆方法，将PCR扩增后的片段进行回收。如图3所示的，RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，泳道l:为DL2000Marker,从上到下依次为2000，1000，750，500，250，100bp;泳道2-3:为不同的目的片段经PCR扩增后，胶回收的电泳结果。同样参照pGEM-TEasy载体说明书，将回收片段克隆入pGEM-TEasy载体中，转化￡.^//感受态细胞丁010，进行蓝白斑筛选，从平板上挑取白色菌落培养后提取质粒DNA，进行PCR鉴定。经鉴定确认后，对此阳性克隆进行序列测定，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，该P4505'RACE片段长1609bp，5'非编码区长177bp。测序结果用DNAMAN软件翻译成氨基酸，其序列中包含P450的特征序列[PFG]与3'RACE序列中的[PFG]完全相同，说明SEQIDNO，4就是3，RACE片段的5'端序列。3)P450全序列cDNA的拼接最后根据3'RACE和5'RACE片段的序列就可拼接出完整的全序列的P450cDNA,其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。4)从cDNA中直接克隆P450基因进行验证基于拼接的P450cDNA全序列信息,采用DNAMAN软件查找分析SEQIDNO.l的最大开放阅读框，发现1781737bp为其最大开放阅读框，编码细胞色素P450的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。重新设计代表该cDNA读码框的5'末端的上游引物和3'末端的下游引物，RT-PCR直接从反转录的cDNA的模板中体外扩增SEQIDNO.l的编码区cDNA。利用来自cDNA全长的序列信息，结合DNAMAN软件设计合成代表cDNA编码区5'最末端的上游引物GSP-5(斜线为XholI酶切位点)和3'末端的下游引物GSP-3(斜线为EcoRl酶切位点)，其中，GSP-5:ctcgagatgatcaattcaagcgaacaa27;GSP國3:gaattctcagtctaaatctgcaagtcttc29;取反转录的cDNA的模板2pL，加入5juL10XPCRBuffer、lpL1Ommo/LdNTPs、3pL25mmol/LMgC12、引物1Ojamol/LGSP-5和GSP-3各lpL以及2.5UTaq酶，最后用双蒸水补足至50pL。扩增程序94。C变性5min后，94°Clmin，40。Clmin，75。Clmin，完成30个扩增循环，最后于75。C延伸5min,冷却至4'C保存备用。胶回收PCR扩增产物。电泳结果如图4，泳道l:为DL2000Marker,从上到下依次为2000,1000，750，500，250，100bp;泳道2:为PCR扩增的SEQIDNO.l的编码区cDNA片段。将胶回收的PCR扩增产物并与pGEMT-easy载体连接，转化E.coli感受态细胞TOPIO，并进行蓝白斑筛选，从平板上挑取白色菌落培养后提取质粒进行PCR鉴定，初步确认为阳性克隆后将其测序，测序结果利用DNAMAN软件进行翻译，并将其与全长拼接序列的编码区的核苷酸和氨基酸序列进行比较。结果所得到的序列与SEQIDNO.l序列的1781737bp完全相同。说明前面获得的3，RACE和5，RACE片段都来源于SEQIDNO.l序列，并且确认获得了SEQIDNO.l序列编码区的cDNA信息。4、P450基因原核表达载体的构建及其诱导表达1)P450-DSP-GZ原核表达载体的构建用EcoRI、XholI双酶切测序正确的pGEMT-P450载体，将目的片段连12接到同样EcoRI、XholI双酶切的pET32a载体上，并转化E.coliBL21感受态细胞，转化后酶切鉴定正确的阳性质粒命名为pET32a-P450-DSP-GZ。2)P450-DSP-GZ蛋白的诱导表达将重组质粒pET32a-P450-DSP-GZ转化五.co//BL21，并以pET32a空载体为对照同时转化。从被转化的BL21板上挑取单菌落于5mlLB中，37"C振荡培养过夜，次日以l:100接种新鲜的LB，培养至OD6QQ约0.4-0.6时，以终浓度lmmol/L的IPTG诱导5h后取样，离心收集菌体，超声裂解菌体后，SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达情况；电泳结果如图5所示，其中泳道1为IPTG诱导的pET32a-P450-DSP-GZ转化菌经超声离心后沉淀；泳道2为IPTG诱导的pET32a-P450-DSP-GZ转化菌经超声离心后上清；泳道3为IPTG诱导的pET32a-P450-DSP-GZ转化菌；泳道4为IPTG诱导的不包含P450-DSP-GZ的空载体转化菌；泳道5为蛋白Marker;泳道1、3与泳道4对比，在约70kDa处有一特异的条带，和P450基因编码区翻译的蛋白大小一致。而且在转化pET32a-P450-DSP-GZ的BL21中，P450基因编码的目的蛋白P450-DSP-GZ以非可溶的形式得以表达。3)Western-blot检测目的蛋白的表达对表达产物进行SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜上之后，用5°/。的脱脂奶室温封闭lh，用鼠源性抗His标签单抗作为一抗(表达载体pET32a是一种融合表达质粒，能在外源蛋白的N端编码6XHis标签)，4C孵育过夜。次日，再以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育lh，充分漂洗后，DAB显色；Western-blot结果如图6所示，泳道1:IPTG诱导的不包含P450-DSP-GZ的空载体转化菌；泳道2:IPTG诱导的pET32a-P450-DSP-GZ转化菌；泳道3:IPTG诱导的pET32a-DSP-P450-GZ转化菌经超声离心后沉淀；泳道4:IPTG诱导的pET32a-DSP-P450-GZ转化菌经超声离心后上清；泳道5:蛋白分子量标准；DAB显色后，可见泳道2、3在P450-DSP-GZ蛋白大小处有一单一条带，其分子量约70kDa，证实目的蛋白以非可溶的形式表达。5、转化pET32a-P450-DSP-GZ的大肠杆菌对毒死蜱的降解效率将转化pET32a-P450-DSP-GZ的大肠杆菌阳性克隆，接种于10mLLB培养基中，37。C培养过夜；次日以l:IOO的比例接种于ILLB中，37。C培养至菌液OD6oo约0.5时，加入IPTG至终浓度lmM，37。C继续培养4小时，然后将100^ig/L的毒死蜱加入到培养液中，37°C160r/min摇床振荡培养，定时(6h，12h，24h)取样，气相色谱检测毒死蜱残留量。包含P450基因的转化体对毒死蜱的生物降解率计算公式X=(Cck-Cx)/CckxlOO%;其中，X为毒死蜱的生物降解率；Cck为接种空载体转化菌株培养液中毒死蜱的浓度Oig/L);Cx为接种转化体培养液中毒死蜱的浓度Oig/L)。培养基中毒死蜱的提取2ml培养液至相应的刻度试管中，加入4ml氯仿，振荡器剧烈振荡2min，吸出上层水相，将氯仿用氮气吹干后，用正己烷定容，加入无水硫酸钠，吸净残水后检测。毒死蜱的气相色谱检测方法岛津GC214B气相色谱仪，ECD检测器，色谱柱SPB25石英毛细管柱(30mx0.53mmx0.1pm)，温度条件检测器温度28(TC，进样口温度26(TC，采取程序升温，起始温度100'C，保持lmin，20。C/min升至210。C，保持2min;载气为氮气(纯度99.99%)，恒压160kPa，不分流进样，进样量0.4pL。转化pET32a-P450-DSP-GZ大肠杆菌对毒死蜱的降解曲线如图7所示，具体降解率如表1所示空载体转化菌株对毒死蜱的生物降解率在24h之内从2.1%到3.9%之间，基本上对毒死蜱没有降解作用，转化pET32a-P450-DSP-GZ的大肠杆菌对毒死蜱的降解率在6h时为27.9%，12h为74.3%，24h的降解效率最高，达到85.5%，降解效率在一定范围内随着时14间延长而增加；与作为对照的空载体转化菌株相比，转化pET32a-P450-DSP-GZ的大肠杆菌对毒死蜱的降解能力具有显著的提高，说明P450-DSP-GZ蛋白的表达具有明显的生物活性，证明本发明提供的人肝脏细胞色素P450因具有降解有机磷农药毒死蜱的功能。表1包含P450基因的转化体降解毒死蜱的降解效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>核苷酸序列表<110>中国人民解放军第四军医大学<120>—种人肝脏细胞色素P450基因及其应用<160>4<210>1<211>1872<212>DNA<213>humanhepatiticcell<400>1ggccacgcgtcgactagtacggggggggggg鹏gg犯tcagaaaeggettaaccgcgtt60cgaattcaagccagagaatgacaaat*tcattttcagtgtctcacagctaatgtacagcag120accaaaatttgaaactccgcttattcaaacactgatgettg8ga犯tttatcagcacatg180已tc犯ttcaagcg犯caatccaacetcaaaaactaacatc240agatggctctggtgtgggtggcggtgc也tcgccgtggcggtgctgtacctccgccagg300tctggag犯cagtccataca360gtttggccaggatcctcctcacttcgttaacgatscactgggatattata420acagctctacgttcagttccagtgactctttcttttctag6L犯cttattctctttgg犯g■gtcgcgacattgagctggtgg卿卿tcgctttgaacactttctcgatc540acccattacaatcaatcccaaagatcctcagagaccatcagtacgcttgc600ggca,atgg犯agacatgcgttcgactttcagcccagctttcacaagttccaagatgc660gtaccaacgacgttcaagcctcctgcgcctteggtegtaaggtggactct720ctgcc犯cgacgtatgagcctcctgcgccttcggttcgaaggtggeictct780ctgtgttcttctttattgca3atgcaccta>cagttgeteagstccttc犯ctggatttcc840tttaca3cgagttctacacc3tgggC卿Ctgtcttccaccttcaacttccgtcagatgc900tatgg犯ccaCCtg3t3tC3ttcatttgettatgg犯gctC犯3朋ggtC960aaccggaagcggcgaag犯gtttttcaggaacttcgtccttgataccatcaag肪ccgtg1020agcccgccgtgggacagaaggaaa/ttactagagtgtggactatggaagacctcatcgctc108016aggtcactcatg3gg犯a^tacgtctatatggagaactgctggctttgcgacagttgaag1140aatacgagctggctgtcgaacctgacgtccaggagcgcctggcgcaggagatcaaggaga1200acgcagtattattcttcatcgctggtttcgagaccgtgtcttctggcatgtcgttcctgc1260tgttggttgtgtctgaactgctgcgcctgtggcctcctggggcagcactggacaggatct1320gcaatgcc朋ga^cggcggc3agttcg3cttcaactccatccagaatttgcagtacatgg1380at犯aggcacsggtatcagcataccagcttttgccttccaccgagacccccagttcttcc1440cgactaaggactacaatttgggaaaacctaacgacaaggccaaacatgattttattgtcc1500gcaacccagaaaagttgtaccctgaacggttctccgaggaaaacaagcacaacatccaga1560gctgttgcctacatgcctttcgggtttggacctaggaattgcattggattcctgctcaac1620ttgctactgac肌cagt犯ctgtagatcaaagggaggacactggcttaagggtattacgt1680accagatcctacggcatatggaactgtctccctgtgagaagacttgcagatttagactga1740ggatgt卿ttaag3tgtg3aaatataacttgatgagttggattatttagatttgtataa1800ttttgtaatcaaataaaaatt肪朋ga^tagcttctttc21t3gca犯aagiaaagstatca1860ctcagcataatg1872<210>2<211>520<212>PRT<213>humanhepatiticcell<400〉2MetlieAsnSerSerGluGinSerAsnLeuLysTyrSerArgArgLysGlulieThrAsn15101520lieArgTrpLeuTrpCysGlyTrpArgCysLeuSerProTrpArgCysCysThrSerAla2125303540ArgSerGlyGluLeuAsnLyslieArgProLysSerProTyrLysArgSerlieLysPro4145505560ArgValTrpProGlySerSerSerAsnLyslieThrSerLeuThrlieHisTrpAsplie616570758017lieThrAlaLeuArgSerValProValThrLeuSerPheLeuGluThrTyrSerLeuTrp81859095100LysValAlaThrLeuSerTrpTrpArgArgSerProSerLysThrLeuAsnThrPheSer101105110115120lieThrHisTyrAsnGinSerHislieCysGinLyslieLeuArgAspHisGinTyrAla121125130135140CysGlyLysAsnGlyLysThrCysValArgLeuSerAlaGinLeuSerGinValProArg141145150155160CysValProThrThrPheLysProProAlaProSerValValArgTrpThrLeuThrThr161165170175180LysLeuProThrThrTyrGluProProAlaProSerValArgArgTrpThrLeuThrThr181185190195200LysLeuCysSerSerLeuLeuGinMetHisLeuGinLeuLeuArgSerPheAsnTrplie201205210215220SerPheThrThrSerSerThrProTrpAlaSerCysLeuProProSerThrSerValArg221225230235240CysTyrGlyThrlieSerLeuAspLeulieSerPhelieCysLeuTrpLysLeuLysLys241245250255260ValAsnArgLysArgArgArgSerPheSerGlyThrSerSerLeulieProSerArgThr261265270275280ValSerProProTrpAspArgArgLysLeuLeuGluCysGlyLeuTrpLysThrSerSer281285290295300LeuArgSerLeuMetArgLysLeuArgLeuTyrGlyGluLeuLeuAlaLeuArgGinLeu301305310315320LysAsnThrSerTrpLeuSerAsnLeuThrSerArgSerAlaTrpArgArgArgSerArg321325330335340ArgThrGinTyrTyrSerSerSerLeuValSerArgProCysLeuLeuAlaCysArgSer34134535035536018CysCysTrpLeuCysLeuAsnCysCysAlaCysGlyLeuLeuGlyGinHisTrpThrGly361365370375380SerAlaMetProArgThrAlaAlaSerSerThrSerThrProSerArglieCysSerThr381385390395400TrplieLysAlaGinValSerAlaTyrGinLeuLeuProSerThrGluThrProSerSer401405410415420SerArgLeuArgThrThrlieTrpGluAsnLeuThrThrArgProAsnMetlieLeuLeu421425430435440SerAlaThrGinLysSerCysThrLeuAsnGlySerProArgLysThrSerThrThrSer441445450455柳ArgAlaValAlaTyrMetProPheGlyPheGlyProArgAsnCyslieGlyPheLeuLeu461465470475480AsnLeuLeuLeuThrThrValThrValAspGinArgGluAspThrGlyLeuArgValLeu481485490495500ArgThrArgSerTyrGlylieTrpAsnCysLeuProValArgArgLeuAlaAspLeuAsp501505510515520<210>3<211>298<212>DNA<213>humanhepatiticcell<400>3gcctttcgggtttggacctaggaattgcattggattcctgctcaacttgctactgacaac60agtaactgtagatcaaagggaggacactggcttaagggtattacgtaccagatcctacgg120catatggaactgtctccctgtgagaagacttgcagatttagactgaggatgtagattaag180atgtgaaaatataacttgatgagttggattatttagatttgteitaattttgtaatcaaat240aaaaattaaaagaatagcttctttcatagcaaaaaaaaagatatcsctcagcat3atg298<210>4<211>1609<212>DNA<213>humanhepatiticcell<400>4ggccacgcgtcgactagtacggggggggggggggggaatcag犯acggcttaaccgcgtt60cg^ttc^gacaaatteattttc已gtgtctcacagctastgtacsgc3g120accaaaat11gaaactccgcttattcaaacactgatgcttgaga犯tttatcagcacatg180atcaattcaagcgaacaatccaacctcaaat3tagca^ag^aag犯3taactaacatc240agatggctctggtgtgggtggcggtgcttatcgccgtggcggtgctgtacctccgccagg300tCtggag33Cagtccataca360gtttggccaggatcctcctcacttcgttaacgatacactgggatattata420acagctctacgttcagttccagtgactctttcttttctag犯actt3ttctctttggaag480gtcgcgacattgagctggtgg卿卿tcgccgtc犯agactttgaacactttctcgatc540acccattaca3tC犯tCCC3cataa^gcaaaagatcctcag3g3CC3tC3gtacgcttgc600ggca卿atggaaagacatgcgttcgactttcagcccagctttcac犯gttecaagatge660cgttcaagcctcctgcgcctteggtegtaaggtggactctC8c肪cgaaa720ctgccaacgacgtatgagcctcctgcgccttcggttcgaaggtggactctc3caacgaB3780ctgtgttcttctttattgcacagttgeteagatccttc犯ctggatttcc840tttac犯cgagttctacaccatgggc鄉ctgtcttccaccttcaacttccgtcagatgc900teitgg^cc3t3tca^t3gacctgatatcattcatttgettatggaagctcaaaaaggtc960aaccggaagcggcga卿3gtttttcaggaacttcgtccttgataccatcaagaaccgtg1020agcccgccgtggg3C卿3ggaaattactagsgtgtggacctcatcgctc1080aggtcactcatgaggaaattacgtctatatgg卿actgctggctttgcgacagttgaag1140aatacgagctggctgtcg犯cctgacgtccaggagegectggcgcaggagatcaaggaga1200acgcagtattattcttcatcgctggtttcgagaccgtgtcttctggcatgtcgttcctgc1260tgttggttgtgtctgaactgctgcgcctgtggcctcctggggcagcactggacaggatct132020gcaatgccaagaacggcggcaagttcgacttcaactccatccagaatttgcagtacatgg1380ataaaggcacaggtatcagcataccagcttttgccttccaccgagacccccagttcttcc1440cgactaaggactac犯tttggga犯acctaacgacaaggcc犯acatgattttattgtcc1500gcaacccagaaaagttgtaccctgaacggttctccgaggaaaacaagcacaacatccaga1560gctgttgcctacatgcctttcgggtttggacctaggaattgcattggat16092权利要求1、一种人肝脏细胞色素P450基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2、如权利要求1所述的人肝脏细胞色素P450基因，其特征在于，人肝脏细胞色素P450基因第1781737bp为开放读码框，编码520个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3、权利要求1所述的人肝脏细胞色素P450基因应用于有机磷农药解毒剂的制备。4、如权利要求3所述的应用，其特征在于，用于制备包含人肝脏细胞色素P450基因的表达载体或者转化体。5、如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述包含人肝脏细胞色素P450基因的表达载体是pET32a-P450-DSP-GZ。6、如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述包含人肝脏细胞色素P450基因的转化体，其宿主细胞是大肠杆菌BL21，转染宿主细胞的包含P450基因的表达载体是pET32a-P450-DSP-GZ。7、如权利要求3所述的应用，其特征在于，用于制备包含人肝脏细胞色素P450基因编码的氨基酸的有机磷农药解毒剂。全文摘要本发明公开了一种人肝脏细胞色素P450基因，该基因具有降解有机磷农药功能，可用于建立有机磷农药在肝脏中代谢的体外模型以及制备人用有机磷农药解毒制剂；该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明还构建了包含该基因的表达载体pET32a-P450-DSP-GZ，转化大肠杆菌BL21后得到具有降解有机磷农药毒死蜱的转化体，该基因用于建立有机磷农药在肝脏中代谢的体外模型以及制备人用有机磷农药解毒制剂，为研究人肝脏中有机磷农药的代谢特性及药物相互作用提供了试验依据和技术平台。文档编号C12N15/53GK101659955SQ20091002410公开日2010年3月3日申请日期2009年9月28日优先权日2009年9月28日发明者欣吕,敏姚,文尹,健康,敬杨,雷迎峰申请人:中国人民解放军第四军医大学