专利名称：：一种检测黄牛prdm16基因单核苷酸多态性的方法
技术领域：
：本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛户/DAfM基因第212237位单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
：单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3,其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的"含义"相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs:即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。动物体内存在棕色和白色两种脂肪。白色脂肪堆积在皮下，负责储存多余热量；棕色脂肪负责分解引发肥胖的白色脂肪，将后者消耗，加快新陈代谢。锌指蛋白PRDM16(PRdomain-containing16)是一种重要的转录调节因子，可强有力地调控肌肉与棕色脂肪之间的双向转换。通过与PPAR-y及其共激活因子la和lp结合，PRDM16促进表达Myf5的前体细胞分化为棕色脂肪细胞，进而增加了热量产生减少了体内脂肪堆积。*因此，研究哺乳动物尸iDM/6基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。目前，对于尸^DM76基因的研究多在小鼠和人类上，主要在中枢神经的生成、分化、口面部的形成以及急性髓性白血病等方面做了大量研究。国内外未见关于动物i^DM76基因遗传变异的研究。中国黄牛i^DMM基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如初生重、日增重、体重等性状)关联的研究仍是空白。由于/>^)71//6基因功能涉及初生重、日增重、体重生长性状，本发明提供的检测方法为户iDM/6基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
发明内容本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛/^D^f76基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明是通过以下技术方案来实现一种检测黄牛户iZ)MM基因单核苷酸多态性的方法，以包含户/Z)MM基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛尸iDMM基因；用限制性内切酶M^/消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛户7DAf76基因第212237位的单核苷酸多态性；所述的引物对P为上游弓l物cctaccactccgtgttccc19;下游弓l物tcggctgccaatgctc16。所述的PCR扩增反应程序为94。C预变性5min;30~35个循环，94。C变性30s，65.5°(3退火30s，72°C延伸30s;72。C延伸10min。所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛尸7D7l/M基因第212237位的单核苷酸多态性为TT基因型表现为116bp、109bp和47bp条带；TC基因型表现为U6bp、109bp、85bp、47bp和24bp条带；CC基因型表现为116bp、85bp、47bp和24bp条带。本发明根据户^^T76基因的序列设计引物，分别以3种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后在得到黄牛的户/JD^T76基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较发现在第212237位存在SNP多态性。与现有技术相比，本发明公开的黄牛WDMM基因的第212237位的SNP多态性，是一个与黄牛部分生长性状密切相关的单核苷酸多态性位点，本发明对3个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛部分生长性状(初生重、体重和日增重)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛体重的分子标记；针对上述第212237位的SNP多态性，本发明公开的其筛査和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性；能够从分子遗传学上快速的对种质资源分型，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS),快速建立遗传资源优良的黄牛种群。图1为黄牛PiDM76基因PCR产物电泳图2为黄牛基因包含第212237位的多态位点的279bpPCR产物的M^/酶切电泳结果；图3为黄牛PiDMM基因SNP的不同基因型测序图。具体实施方式本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛PiDA/76基因第212237位点错义密码子突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，并对该SNP与性状关联分析表明，该位点的多态性能够成为分子育种标记。下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。a、黄牛尸I2Z)7W76基因含第九外显子区域PCR引物的设计以NCBI所公布的牛(NC—007314.3)序列为参考，利用Primer5.0设计能够扩增包含黄牛户/DJl^6基因第九外显子区域的PCR引物，其引物序列如下上游引物cctaccactccgtgttccc19;下游弓l物tcggctgccaatgctc16;以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛i^DM76基因(NC—007314.3序列)第九外显子区域第212036bp212307bp的272bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图l所示，其中，泳道110为检测片段，泳道M为Marker;对扩增的片段进行测序鉴定后，其中，第212201bp212260bp的序列为如下所示tcaccaccaaacccaaagaggccaagcccatcctg)^gcgcccaaggtgcccccagcccj经过分析，发现MwlPCR-RFLP检测的SNP的位置为第212237bp(即尸iDMM基因CDS区第2315位)，当该位点由T突变为C时，导致编码第772位的密码子由CTG(如框线所示序列)突变为CCG，从而形成错义密码子突变，即由772Leu突变为772Pro。当212237bp由T突变为C时，PCR扩增户7DM/6基因产物的第212236bp212239bp序列为ccgg，形成了限制性内切酶M^/的酶切位点，当在212237位点没有突变时，PCR扩增P/JDMM基因产物的第212236bp212239bp序列为ctgg，限制性内切酶M^/不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。当用限制性内切酶^fep/对引物P对应扩增的基因片段酶切消化时，由于212151bp212154bp，212260bp212263bp,还有两处识别位点，因此，能够被切成4段或5段片段。b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的i^ZMii6基因片段1、黄牛样本的采集本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1:河南南阳牛(269)，陕西秦川牛(236)，河南平顶山市郏县红<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500mL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4°C)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500^L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37"C水浴lh;3)加蛋白酶K至3]iL(20mg/mL)并混匀，55。C过夜至澄清，尚未澄4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500pL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4°C，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；5)加氯仿500pL，充分混匀20min，4。C，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；6)加氯仿、异戊醇混合液(24:1)500&，充分混匀20min，4°C，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-201^保存30601^11;8)4°C，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70°/。冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；9)4°C，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；10)干燥后的DNA溶于80100jiL的TE液，4'C保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-s(rc保存。11)500^iL的DNA溶液中加入10。/。SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50pg/mL;12)5。C保温10h左右；13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次；14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA;16)倒掉液体，70%乙醇洗涤后晾干，加入60pL灭菌超纯水溶解，4°C待检测。3、PCR扩增PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA,再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表2:表2PCR反应体系体系成分体积(pL)灭菌超纯水(H20)10.82xbuffer(内含Mg2+、dNTPs等)12.5引物P上游引物(10pmol/L)0.5引物P下游引物(10pmol/L)0.5TaqDNA聚合酶(2.5U/^iL)0.25DNA模板(50ng/pL)0.45总体积2525pL反应体系包括0.625UTaqDNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2xBuffer12.5i丄L(内含Mg2+、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng4iL含尸^DMM基因的黄牛基因组DNA0.45pL，10pmol/ML上、下游引物各0.5^L;PCR反应程序94。C预变性5min;94。C变性30s，，66.5。C退火30s，一30-35个循环；72°C延伸30s，-72。C延伸10min;对3个黄牛品种的940个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得940个个体的黄牛PiDM/(5基因中包含该SNP位点的272bp的DNA片段。c、M^J酶切消化PCR扩增的/^iW^6基因片段1、Afc/;/酶切反应消化体系(25~30pL):10-15|止PCR产物，10x缓冲液(含BSA)2.5~3.0^iL，Msp/(10U/pL)为1.0-1.5|iL，灭菌纯水(H20)ll.5~16.5pL;2、酶切消化条件37"C恒温培养箱中消化510h。d、M印/消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析1)制作10。/。的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，点样后180V电压电泳50min，电泳结束后EB染色；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统成像；3)根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性用BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性尸/DMM基因的第212237bp由T突变为C时，PCR扩增的尸/DMM基因产物的第212236bp212239bp序列为ccgg，限制性内切酶Msp/识别后在c/cgg对扩增片段酶切，将扩增片段切为4段；而i^DMM基因的第212237bp没有发生突变，限制性内切酶M^/不能识别，将扩增片段切为3段；由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组的P/①MM基因的第212237位的SNP的多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为TT基因型表现为116bp，109bp和47bp三条条带；TC基因型表现为116bp，109bp，85bp，47bp和24bp五条条带；CC基因型表现为116bp,85bp，47bp和24bp四条条带;由于47bp和27bp较小，在聚丙烯酰胺电泳分析中不太清楚，但通过109bp和85bp这两条条带还是能够准确的鉴别TT基因型、TC基因型和CC基因型不包含109bp条带的为CC基因型个ii体；不包含85bp条带为TT基因型个体；同时包含109bp和85bp条带为TC基因型个体。如图2所示，其中，泳道2、泳道3包含109bp和85bp条带，其为TC基因型个体，泳道4、泳道5不包含85bp条带，为TT基因型个体，泳道6、泳道7不包含109bp条带，为CC基因型个体，泳道M为MarkerI(600bp，500bp，楊bp，300bp，200bp，100bp)。4)不同基因型个体PCR产物的测序验证对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含109bp和85bp条带的杂合子TC基因型个体其212237位的测序图的确表示为T或C，如图3a所示，自左向右第4个峰为两个峰，而CC基因型、TT基因型分别为C、T，如图3b、c所示。e、黄牛户iZM^6基因SNP位点的频率统计分析1)基因和基因型频率基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。Paa二Naa/N，其中Paa代表某一位点的AA基因型频率；Naa表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成PA=(2NAA+NAal+Naa2+NAa3+NAa4+......+NAan)/2N式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，al—an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。本研究所涉及的等位基因为T和C，所以具体的基因频率计算公式为Pc=(2NCC+NTC)/2NPT=(2NTT+NTC)/2N式中，PT,Pc分别表示等位基因T和C等位基因的频率，NTT、Ntc和Ncc;分别表示TT、TC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。在不同黄牛品种i^D7lW6基因SNP中的T等位基因频率变化幅度在35.3%~42.7%，C等位基因频率变化幅度在57.3。/。64.7。/。之间，如表3所示。表3黄牛尸/①M76基因第212237位SNP基因频率分布表基因型的观测数目总计等位基因频率黄牛品种TTTCCC940CT秦川牛12129952360.5730.427南阳牛54147682690.6470.353郏县红牛922351184350.6320.368f、黄牛月DM76基因SNP位点基因效应的关联分析基因型数据^fepl识别的基因型(TT、TC和CC)生产数据南阳牛初生重，以及6月、12月、18月和24月的体重和日增重数据。关联分析模型先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SAS(9.1)软件的GLM过程分析基因型和瓶中对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型y辨/=A+斷+M一+其中为性状观察值，^为总体均值，^F,为第z'个品种和农场的固定效，她—.为第/个月观测的固定效应，(^为第A:个单SNP标记基因型的固定效应，为随机误差。结果表明(见表4):在第212237位点，在6月龄和24月龄TT基因型的个体体重均高于TC和CC基因型个体且差异显著(尸<0.05);而在出生重和12、18月龄三种基因型的个体在体重和日增重性状上差异不显著200910024139.9CP>0.05)。以上分析说明第212237位点的TT基因型可以做为一个提高黄牛体重和日增重的候选分子遗传标记。表4i^Dil^6基因第212237位多态位点与南阳牛各月龄体重和日增重之间的方差分析年龄生长性状第212237位SNP基因型CC(Mean士SE)CT(Mean士SE)TT(Mean士SE)出生体重(kg)29.679±0.48929.921±0.32630.478±0.3126月龄体重(kg)150.571±5.075b161.094±2.608ab161.667±2.110a日增重(kg)0.668±0.027b0.729±0.014a0.729±0.011a12月龄体重(kg)210.000±18.871220.672±22.791231.120±24.994日增重(kg)0.344±0.1210.350±0.1250.364±0.13618月龄体重(kg)300.786±5.415300.429±3.610291.478±3.450日增重(kg)0.40U0.0400.429±0.0270.391±0.02524月龄体重(kg)372.857±10.363^359.981±5.326B383.963±4.308A日增重(kg)0.424±0.073^0.332±0.037B0.508±0.030A注具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(PO.05)。权利要求1、一种检测黄牛PRDM16基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含PRDM16基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PRDM16基因；用限制性内切酶MspI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PRDM16基因第212237位的单核苷酸多态性；所述的引物对P为上游引物cctaccactccgtgttccc19；下游引物tcggctgccaatgctc16。2、如权利要求1所述的检测黄牛/^DM76基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为94。C预变性5min;3035个循环94。C变性30s，65.5。C退火30s，72°C延伸30s;72。C延伸10min。3、如权利要求1所述的检测黄牛i^Dil^6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。4、如权利要求1所述的检测黄牛户7D7l^6基因单核苷酸多态性的方法,其特征在于,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛/^Dil^6基因第212237位的单核苷酸多态性为TT基因型表现为116bp、109bp和47bp条带；TC基因型表现为116bp、109bp、85bp、47bp和24bp条带；CC基因型表现为116bp、85bp、47bp和24bp条带。全文摘要本发明公开了一种检测黄牛PRDM16基因单核苦酸多态性的方法，以包含PRDM16基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PRDM16基因；用限制性内切酶Mspl消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酸胺凝胶电泳；根据聚丙烯酸胺凝胶电泳结果鉴定黄牛PRDM16基因第212237位的单核苷酸多态性；由于PRDM16基因功能涉及初生重、日增重、体重生长性状，本发明提供的检测方法为PRDM16基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。文档编号C12Q1/68GK101671726SQ200910024139公开日2010年3月17日申请日期2009年9月29日优先权日2009年9月29日发明者淮永涛,璟王,胡沈荣,蓝贤勇,赖新生,宏陈,雷初朝,亮马申请人:西北农林科技大学