专利名称：水稻细胞色素p450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻细胞色素P450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留。
背景技术：
利用生物技术发展生态农药是现代农业研究的一个重要方向，可以缓解农民负 担、减少生态环境污染和降低因大量农药残留造成的人类健康危害。细胞色素P450 酶系是结合在内质网膜上含硫醇血红素的氧化酶。细胞色素P450超基因家族存在 很强的生物多样性，广泛参与动植物的各类生命活动，比如生物分子合成、解毒和 药物代谢途径。利用功能基因组学和生物信息学手段，研究整合生物代谢途径中的 细胞色素P450家族的功能信息，研究预测与降解农药残留相关的水稻P450基因， 将有利于生产我国自主性的生态农药。以信号受体和转录途径组分分析为基础可进 行农用化合物设计，结合化学信息学方法，可鉴定用于杀虫剂和除草剂的潜在化学 成分。
发明内容
本发明的目的是提供水稻细胞色素P450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除 草剂残留。
本发明所提供的辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的引物，是由序列表中序 列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。该引物对是根据水稻细 胞色素P450基因序列设计的，细胞色素P450基因命名为CYP72A18 ，其NCBI定位 号为NP—001043632， NCBI基因号(GENE ID)为0s01g0627500， DBJ号为AB237165， TIGR号为L0C_0s01g43710，全长cDNA序列长度为1572个核苷酸，定位于第一号 染色体从25, 372， 759bp到25， 376， 122bp;该基因编码的蛋白共有523氮基酸。 CYP72A18基因的表达受除草剂的诱导，所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、 异恶草酮或甲基紫精。
本发明的另一个目的是提供一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法。 本发明所提供的辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法，是将在不含除草 剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总 RNA反转录获得的cDNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线计算待检测的植物培养基 质的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质的 水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于2. 0±0. 05， 待测植物培养基质为有除草剂残留的候选植物培养基质。所述的植物培养基质可为任何可培养植物的液体或固体基质，如培养液、土壤、 蛭石等。当所述待测的植物培养基质为液体时，可将在不含除草剂的植物培养基质中培 养的水稻移栽到所述待检测的植物培养基质中6小时-24小时；当所述待测的植物 培养基质为固体时，可将所述待检测的植物培养基质用5ml/100ral 二甲亚砜水溶液 浸泡，收集浸出液；将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植 物培养基质中6小时-24小时。进行所述移栽的水稻可处于二叶期-四叶期。所述除 草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。通过本发明提供的辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法，可初步鉴定植 物培养基质中是否有除草剂残留，再结合现有的仪器分析方法可确定植物培养基质 中是否有除草剂残留。为了方便、快速辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留，本发明还提供了一种专 用的荧光定量PCR试剂盒，该荧光定量PCR试剂盒包含一对引物，该引物对由序列 表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成。本发明根据一个对多种除草剂具有明显应答特征的水稻细胞色素P450基因的 基因序列设计了一对引物，用该引物对可辅助检测植物培养基质中是否有除草剂残 留。利用本发明的辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法可对植物培养基质进 行初步筛査，将筛出的候选植物培养基质再用现有的仪器分析方法进行确定有无除 草剂残留，可大大降低仪器分析的工作强度，使对植物培养基质中除草剂残留的检 测快速简便。
图1为水稻细胞色素P450基因，CYP72A18，在水稻基因组序列上的位置示意 图及基因结构。图2为CYP72A18基因在二氯喹啉酸的处理条件下表达变化。 图3为CYP72A18基因在多种除草剂的处理条件下表达变化。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 下述实施例中的水稻品种来自国家种质资源库。实施例1、 CYP72A18在基因组序列的定位及引物设计通过Blast分析，将已命名的水稻细胞色素P450基因和TIGR水稻数据库中的 基因位点对应起来，CYP72A18对应LOC一Os01g43710，位于第一号染色体第 25，372，759bp到25,376，122bp，具有五个外显子和四个内含子，该基因的结构如图 1所示。根据CYP72A18的m醒序列，用primer3工具，在CYP72A18的mRNA序列 靠近3'端设计一对特异引物ChemR2-l和ChemR2-2，引物ChemR2-1和ChemR2-2 的序列分别为序列表中的序列1和序列2。实施例2、用引物ChemR2-1和ChemR2-2检测CYP72A18在除草剂处理下的表达以5ml/100ml 二甲亚砜水溶液为溶剂分别配制浓度为1. 65mM 二氯喹啉酸溶液、 浓度为19. 98mM苯达松溶液、浓度为1. 31mM甲磺隆溶液、浓度为1. 75mM异恶草酮 溶液和浓度为10uM甲基紫精溶液。在正常生长条件下(温度为28。C / 25°C ，相对湿度83%， 12小时昼夜循环) 生长的水稻日本晴的幼苗，在两叶一心期分别用1.65mM二氯喹啉酸溶液、19.98mM 苯达松溶液、1. 31mM甲磺隆溶液、1. 75mM异恶草酮溶液和10 u M甲基紫精溶液喷 雾处理，以用5ml/100ml 二甲亚砜水溶液喷雾处理作为对照，实验重复3次，每个 重复处理10-20株水稻。提取1. 65mM 二氯喹啉酸溶液处理3小时、6小时和24小时及二甲亚砜处理3 小时、6小时和24小时的水稻日本晴幼苗的总RNA，反转录成cDNA;以反转录后的 cDNA为模板，ChemR2-1和ChemR2-2为引物通过实时荧光定量PCR技术检测 CYP72A18的表达水平。取上述5种除草剂处理6小时的水稻日本晴幼苗和对照幼苗分别提取总RNA， 反转录成cDNA;以反转录后的cDNA为模板，ChemR2-1和ChemR2-2为引物通过实 时荧光定量PCR技术检测CYP72A18的表达水平。荧光定量PCR反应条件如下以18S rRNA作为内标，按下列条件进行实时荧光定量PCR反应，反应体系IO W L:10XPCR Buffer 1 u L， 25mmol/L Mg2+ 1 u L， 10 mmol/L dNTPs 0.5 u L， 25umol/L上下游引物各0. 25 y L， cDNA模板l u L， Taq酶(Promega) 0.25 u L， 20XSYBR Green I 0. 5 ti L， ddH20 6.25 u L。检测CYP81A6的表达水平实时荧光定量PCR的反应条件95"C变性3 mi n，循环 40次9 5 。C变性4 0 s — 6 1 。C退火2 5 s — 7 2 。C延伸l rai n 20 s，融 解95。C 0 s(20。C/s)—71°C 15 s(20°C/s —95°C0 s(O. l°C/s)，冷却40。C 30 s(20 °C/s)。
所有荧光定量PCR反应均在LightCycler (Roche)上进行。实时荧光定量PCR结果表明，1. 65mM 二氯喹啉酸处理3小时开始CYP72A18的 表达水平就已经高于对照，此时1. 65mM 二氯喹啉酸处理组与对照组的CYP72Ai8的 拷贝数比值为2.69; 1.65raM二氯喹啉酸处理24小时，CYP72A18的表达水平仍高于 对照，此时1. 65mM 二氯喹啉酸处理组与对照组的CYP72A18的拷贝数比值为4. 35 (图2)。图2中"1"代表用5ml/100ml 二甲亚砜水溶液处理3小时，"2"代表二氯喹 啉酸处理3小时，"3"代表用5ml/100ml 二甲亚砜水溶液处理6小时，"4"代表 二氯喹啉酸处理6小时，"5"代表用5ral/100ml二甲亚砜水溶液处理24小时，"6" 代表二氯喹啉酸处理24小时。虽然不同除草剂的处理CYP72A18的应答不同，但经6小时的二氯喹啉酸、苯 达松、甲磺隆、异恶草酮和甲基紫精处理后，CYP72A18的表达水平均明显高于对照 组，此时，二氯喹啉酸处理组与对照组的CYP72A18的拷贝数比值为3.76，苯达松 处理组与对照组的CYP72A18的拷贝数比值为4. 30，甲磺隆处理组与对照组的 CYP72A18的拷贝数比值为1. 97，异恶草酮处理组与对照组的CYP72A18的拷贝数比 值为4.2S，甲基紫精处理组与对照组的CYP72A18的拷贝数比值为1.92。其中，二 氯喹啉酸，异恶草酮和苯达松的诱导作用较强，甲基紫精和甲磺隆次之(图3)。图3中"1"代表用二氯喹啉酸处理6小时，"2"代表用苯达松处理6小时， "3"代表用甲磺隆处理6小时，"4"代表用异恶草酮处理6小时，"5"代表用 甲基紫精处理6小时。6<110>中国农业大学<120〉水稻细胞色素P450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留<130> CGGNARW81587<160〉 2〈210〉 1<211> 20<212> DNA <213〉人工序列〈220〉 <223><400〉 1tacatccacg caccattcac 20<210> 2<211> 20<212> DNA 〈213〉人工序列<220> <223><400〉 2gcaagtgagc agcatggtta 20
权利要求
1、一种辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
2、 根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达 松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。
3、 一种辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法，是将在不含除草剂的植物 培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总RNA反转录获 得的cDNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物， 进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线计算待测的植物培养基质中的水稻的总RNA 中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质中的水稻的总RNA中特 异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于2.0士0.05，待测植物培养基质中 为有除草剂残留的候选植物培养基质。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述待测的植物培养基质为液体， 将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到所述待检测的植物培养基质中6 小时-24小时。
5、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述待测的植物培养基质为固体 时，将所述待检测的植物培养基质用5ral/100ml 二甲亚砜水溶液浸泡，收集浸出液; 将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中6小时 -24小时。
6、 根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于所述移栽的水稻处于二 叶期-四叶期。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达 松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。
8、 一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒 包括一对引物，其特征在于所述引物对是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2 的核苷酸序列组成。
9、 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。
10、 权利要求1所述的引物在鉴定水稻生长中有无喷施除草剂的应用。
全文摘要
本发明公开了水稻细胞色素P450基因引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留。该引物是由序列表中序列1和序列2组成的。本发明公开的方法，是将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总RNA反转录获得的cDNA为模板，用上述引物进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线计算待检测的植物培养基质中的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质中的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于2.0±0.05，待测植物培养基质为有除草剂残留的候选植物培养基质。本发明的方法使对植物培养基质中除草剂残留的检测快速简便。
文档编号C12Q1/68GK101643776SQ20081011801
公开日2010年2月10日 申请日期2008年8月6日 优先权日2008年8月6日
发明者周少霞, 张盖华, 徐文英, 震 苏, 超 邸 申请人:中国农业大学