专利名称：一种定量检测akap12甲基化水平的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属表观遗传学领域，涉及肿瘤的基因诊断，具体涉及AKAP12基因启动 子区域的甲基化，尤其对人AKAP12基因甲基化程度的检测。
背景技术：
DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶催化S_腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在胞 嘧啶碱基上的第5位碳原子上增加一个甲基，使其转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反 应。发生在肿瘤中的甲基化现象，最主要的特点是全基因组的低甲基化和局部位点的高 甲基化并存，例如启动子区域的CpG岛。这一现象既被认为是肿瘤抑癌基因失活的机制 之一，也是肿瘤良恶性转化的重要判别标志。由于抑癌基因发生改变往往要早于细胞的 恶性增生，因此检测抑癌基因的状态可以用于肿瘤发生的早期预测。以往的一些研究表明在肿瘤组织、外周血(血浆/血清)、肿瘤累及器官相关的 体液(如唾液、痰等)中均可以发现肿瘤相关的甲基化DNA，癌变细胞可以释放DNA到 外周血或者体液中，因而可以检测到肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。一项对肺癌患 者血清中游离循环DNA的检测发现，大多数的肺癌患者血清中都存在一些基因启动子区 高甲基化的现象(文献1)。同样Valenzuela等也发现在膀胱癌患者血清中和基因启动子 异常甲基化高度相关(文献2)。外周血中高水平的游离DNA，特别DNA的高甲基化现 象，常常与肿瘤的发生、发展、对治疗的反应性以及预后等都密切相关，因而可能将高 甲基化作为肿瘤筛查、早期诊断、监测转移，预后复发的标记物，并能有助于早期发现 有癌变倾向的细胞(文献3-5)。检测外周血中抑癌基因甲基化水平，作为肿瘤的标记物具有很大潜力，因为甲 基化分子标记物拥有以下明显的优势1，通常甲基化会以“多发”的形式发生在一种 肿瘤中，因此，挑选一些位点进行检测就能反映全部基因的状态。2，高甲基化通常发生 在相同的基因区域，所以容易锁定目标。3，高甲基化发生在DNA水平，可以避免检测 RNA或者免疫组化带来的其他因素的干扰。4，异常的结果是一个阳性的信号，能减少 正常细胞的污染带来的困扰(文献6)。如Ellinger J等监测了膀胱癌患者血清中APC， DAPK, GSTPl, PTGS2, TIGl 和 Reprimo 的甲基化 DNA，发现三个基因(APC，GSTPl andTIG1)的甲基化有助于膀胱癌的诊断和预后，对膀胱癌具有潜在的诊断价值。A激酶锚定蛋白12(AKAP12/AKAP250/Gravin)位于6q24-q25，主要分布为细 胞质中。最初是从重症肌无力的患者血清中得到的(文献7)，属于细胞特异性的AKAP。 AKAP12主要参与PKA和PKC复合物的形成(文献8)，同时亦是一重要的β 2肾上腺 素受体复合物的调节基因(文献9)，并参与了蛋白定向、信号转导以及G蛋白偶联受体 蛋白信号转导途径。最近的一些研究显示，ΑΚΑΡ12基因除了在多条信号通路中扮演重 要的角色之外，还在多种肿瘤中缺失，例如黑素瘤(文献10)、乳腺癌(文献11)、前列 腺癌(文献12)、胃癌(文献13)以及慢性淋巴细胞性白血病(文献14)等。同时Choi 等人(文献13)在胃癌研究中首先报导了将异常的DNA甲基化与ΑΚΑΡ12表达缺失相对应。提示这可能是一个重要的肿瘤生长的负调节基因，这个基因可能是一个潜在的治疗 基因，也有可能是一个有用的肿瘤生物标志物(文献13)。参考文献l.Pan H，Califano J，Ponte JF，et al.Loss of heterozygosity patternsprovide fingerprints for genetic heterogeneity in multistep cancer progression oftobacco smoke-induced non-small cell lung cancer.Cancer Res 2005 ； 65 1664—9.2.Valenzuela MT，Galisteo R，Zuluaga A，et al.Assessing the use ofpl6 (INK4a) promoter gene methylation in serum for detection of bladder cancer.EurUrol 2002 ； 42 622—8.3.Esteller M，Fraga MF，Paz MF，et al.Cancer epigenetics and methylation.Science 2002 ； 297 1807-8.4.Zhong XY, Ladewig A，Schmid S，et al.Elevated level of cell-freeplasma DNA is associated with breast cancer.Arch Gynecol Obstet 2007 ； 276 327-31. 5.Ellinger J，Haan K，Heukamp LC，et al.CpG island hypermethylation incell-free seram DNA identifies patients with localized prostate cancer.Prostate2008 ； 68 42-9.6.Yates DR，Rehman I，Abbod MF，et al.Promoter hypermethyIationidentifies progression risk in bladder cancer.Clin Cancer Res 2007 ； 13 2046-53.7.Gordon T， Grove B， Loftus JC， et al.Molecular cloning and preliminarycharacterization of a novel cytoplasmic antigen recognized by myasthenia gravis sera. J Clin Invest 1992 ； 90 992-9.8.Nauert JB，Klauck TM，Langeberg LK，Scott JD.Gravin，an autoantigenrecognized by serum from myasthenia gravis patients， is a kinase scaffold protein. CurrBiol 1997 ； 7 52-62.9.Shih M，Lin F，Scott JD，et al.Dynamic complexes of beta2-adrenergicreceptors with protein kinases and phosphatases and the role of gravin.J Biol Cheml999 ； 274 1588-95.10.Millikin D，Meese E，Vogelstein B，et al.Loss of heterozygosity forloci on the long arm of chromosome 6 in human malignant melanoma.Cancer Res 1991 ； 51 5449—53.11.Tibiletti MG, Sessa F， Bernasconi B， et al.A large 6q deletion is acommon cytogenetic alteration in fibroadenomas，pre-malignant lesions，andcarcinomas of the breast. Clin Cancer Res 2000 ； 6 1422-31.12.Xia W，Unger P，Miller L，et al.The Src~suppressed C kinasesubstrate， SSeCKS，is a potential metastasis inhibitor in prostate cancer.Cancer Res2001 ； 61 5644—51.13.ChoiMC，Jong HS, Kim TY，et al.AKAP12/Gravin is inactivatedby epigenetic mechanism in human gastric carcinoma and shows growth suppressoractivity.Oncogene 2004 ； 23 7095-103.14.van ' t Veer MB， Brooijmans AM， Langerak AW， et al.Thepredictive value of lipoprotein lipase for survival in chronic lymphocytic leukemia.Haematologica 2006 ； 91 56-63.
发明内容
本发明的目的是建立一种以甲基化敏感的高分辨融解曲线(MS-HRM)法为基础， 用于检测组织、外周血、其他体液等标本中AKAP12启动子DNA甲基化的定量方法。本发明的另一个目的是将上述方法应用于存在AKAP12基因启动子区高甲基化 的情况(例如肿瘤发生，特别是结直肠癌)中的辅助诊断或预后监测等的用途。研究表明，AKAP12在结直肠癌组织中表达下调比率为68.9%且甲基化比率为 77.8%,并与肿瘤的分级分期具有相关性。在前期研究的基础上，本发明建立一种甲基 化敏感性高分辨融解曲线(MS-HRM)法快速定量检测肿瘤患者外周血中DNA的AKAP12 启动子区域甲基化程度方法，具有较高的灵敏度和重复性，能揭示AKAP12甲基化程度 与肿瘤之间的相关性，分析其与肿瘤发生，发展，转移和复发之间的关系。本方法创伤 小、简便易行，特别是对无法作组织取样的肿瘤患者的实时监控，实现对肿瘤患者早期 诊断、疾病进程的估计、微转移或复发等全方位监控。本发明提供了一种定量检测AKAP12甲基化水平的方法，对样品DNA进行修饰 后，分别以样品和标准品的DNA为模板进行PCR扩增，进行高分辨率熔解曲线分析，然 后根据每个标准品其差异显示的荧光强度建立标准曲线，最后将样品与标准品的曲线比 较获得样品AKAP12甲基化百分比。上述方法中，以甲基化敏感性高分辨融解曲线制作方法制作标准曲线。上述方法中，每一份标准品对应一条标准曲线，相对应的甲基化水平分别为 100%, 80%, 60%, 40%, 20%, 10%, 5%, 或者 0%。上述方法中，对样品DNA进行修饰时，将样品DNA中未甲基化的位点与甲基 化的位点修饰成不同的基团。可以采用与原先甲基化基团不同的基团对样品进行修饰， 也可以使原先未甲基化的位点改变为可以识别的其它基团。例如，非甲基化的胞嘧啶转 化为尿嘧啶，而甲基胞嘧啶仍然以胞嘧啶保留下来。上述方 法中， 进行P C R扩增 的引物 是 5’ -GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3’ 和 5’ -AACACGCCCTACAACAACATCTA-3‘。相应的退火温度设在57-55摄氏度，例如 56摄氏度。上述方法中，进行高分辨率熔解曲线分析的条件可以采取95°C 2min，40°C 2min预处理后，熔解温度76 88°C，每升高0.1°C采集一次数据。本发明中定量检测AKAP12甲基化水平的方法，具体包括标本处理、甲基化修 饰、标准品的制备、PCR扩增、高分辨融解曲线分析及其标准品检测和标准曲线的建立
等步骤。1.标本来源可以是组织、外周血、其他体液等标本，提取基因组DNA。2.甲基化修饰取上述DNA样本1 μ g，进行亚硫氰酸盐修饰。3.标准品的制备以100%甲基化的标准品和100%非甲基化的的标准品混合， 制成0-100%浓度的标准曲线。4.HRM测定方法使用软件methyprimer设计引物如下HRM-F 5' -GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3‘HRM-R 5，-AACACGCCCTACAACAACATCTA—3，
进行PCR扩增，并进行高分辨率熔解曲线分析，条件为95°C 2min， 4(TC2min预处理后，熔解温度76 88°C，每升高0.1°C采集一次数据。获得高分辨率 熔解曲线图，采集相应的荧光信号。5.标准曲线的建立用HRM方法检测0-100%标准品荧光信号强度，减去0% 标准品荧光信号强度，得到差异荧光信号强度，以标准品的百分含量为横坐标，以差异 显示的荧光强度为纵坐标，据此建立双对数标准曲线。6.未知标本的检测用HRM方法检测未知样品得到荧光信号强度，分别减去 0%的标准品荧光信号强度，得到差异显示荧光信号强度，据此根据标准曲线推算出未知 标本的AKAP12甲基化的百分比。7.HRM方法的重复性和敏感度取甲基化标准品重复检测4次，观察检出最低 的百分比含量以及批内和批间的CV。8.统计学分析AKAP12甲基化程度与病理参数的相关性采用Fisher，s检验分 析；P < 0.05为差异有统计学意义。本发明的定量检测AKAP12甲基化水平的方法可用于制备肿瘤诊断试剂。本发明还提供了定量检测AKAP12甲基化水平的方法在制备结直肠癌诊断试剂 中的应用。本发明中，可为临床表现为原因不明的排便习惯改变、原因不明的缺铁性贫 血、消瘦、乏力、或者原因不明的肠梗阻、腹部肿块、腹痛等，疑有结直肠癌的患者检 测AKAP12甲基化水平，协助结直肠癌的诊断或者筛查。本发明中，可采用该方法对有慢性结肠炎、结肠腺瘤性息肉，特别是家族性结 肠息肉病患者，应重点进行癌前普查。本发明中，可采用该方法根据AKAP12基因甲基化的程度，推测病理进程，能 有助于AKAP12启动子区域甲基化升高的情况，特别是肿瘤，尤其是结直肠癌的临床治 疗效果和预后检测等。本发明还提供了一种定量检测AKAP12甲基化水平的试剂盒。该试剂盒含有制 作标准曲线的标准品、阳性质控和阴性质控反应体系。每一份标准品对应一条标准曲线，相对应的甲基化水平分别为100%、80%, 60%, 40%, 20%, 10%, 5%, 或者 0%。上述试剂盒中， 进行P C R扩增 的 引 物 是 5’ -GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3’ 和 5，-AACACGCCCTACAACAACATCTA-3 ‘。阳性质控和阴性质控反应体系包括PCR扩增的阳性对照和阴性对照等。本发明中，按常规方法制备含有上述标准品、阳性质控、阴性质控反应体系的 试剂盒，有望运用到临床。经本研究证实，通过AKAP12甲基化程度发现其与肿瘤之间存在相关性，特别 是肿瘤的病理级别和恶性程度具有相关性。本方法能检测低至的甲基化发生，且创 伤小(外周血等标本)、重复性高，且简便易行，特别是对无法作组织取样的肿瘤患者 的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控。该方法的建立无疑对存在 AKAP12甲基化异常升高的情况，特别是肿瘤，尤其是结直肠癌的诊断、监测和治疗都具有一定的辅助作用。
图1-图4:运用HRM方法制作甲基化标准曲线100%、80%, 60%, 40%, 20%, 10%, 5%, 和0%甲基化标准品的HRM熔解曲线。图1:通过定量PCR检测，显示所有的标准品的起始量均处于同一检测水平。图2:标准品在融解温度从76°C上升到88°C的过程中，显示的荧光信号。图3 每个标准品检测的荧光信号减去0%的未甲基化的标准品的荧光信号(即 差异显示荧光信号)。图4:融解曲线显示PCR产物反应的特异性。图5:标准品所对应的荧光信号的强度取双对数得到的标准曲线。其线性方程 为 y = 0.4759x+0.8708,其中 R2 = 0.9755。图6-8 结直肠癌标本中出现不同程度甲基化(标本1和标本2，如图6和7所 示)，获得各自的差异荧光信号的强度，根据线性方程式，计算出待测标本的甲基化程度 的百分数，待测样本及其不同的病理分级得到的百分比的结果分布(图8)，在这一系列 浓度曲线中的相应位置则代表了其甲基化程度的高低。
具体实施例方式检测结直肠癌患者以及健康者的AKAP12基因甲基化程度1.标本来源在经病理确诊的80例结直肠癌患者以及健康志愿者20例外周血标本，分离血 清，使用 QIAamp DNA Extract Kit (QIAGEN，德国)提取基因组 DNA。2.甲基化修饰取上述 DNA 样本 1 μ g，使用 EZ DNA Methylation-Gold Kit,按 照说明书进行甲基化修饰。3.标准品的建立以 CpGenome Universal Methylated DNA(Chemicon,美国)作为 100% 甲基化的 标准品，以100%非甲基化的健康人外周血DNA作为稀释剂，分别制成100%、80%、 60%, 40%, 20%, 10%, 5%, 和0%系列浓度的标准曲线。4.HRM测定方法的建立使用软件methyprimer设计弓丨物如 下HRM-F 5 ‘ -GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3 ‘，HRM-R 5’ -AACACGCCCTACAACAACATCTA-3‘，引物由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成。扩增条件95°C 5min，94°C 30s> 56°C 30s> 72°C 30s, 40个循环后，72°C 5min 延伸。使用ABI9700扩增后，将样品管转移到ROTOR Gene 6000，进行高分辨率熔解曲 线分析，条件为95°C2min，40°C 2min预处理后，熔解温度76 88°C，每升高0.1°C采 集一次数据。获得高分辨率熔解曲线图，获得的荧光信号。结果显示如图1所示，运用HRM方法制作甲基化标准曲线100%、80%, 60%, 40%, 20%, 10%, 5%, 和0%甲基化标准品的HRM熔解曲线从右往左依次 排列(如图1-4所示)。甲基化修饰的主要原理是亚硫酸氢盐可以将非甲基化的胞嘧 啶转化为尿嘧啶，而甲基胞嘧啶仍然以胞嘧啶保留下来，用它处理样本后，再进行PCR扩增，由于甲基化的序列G C含量比较高，因此，Tm值也比相应的非甲基化序列高， Tm值与甲基化程度成正比。所以在熔解曲线图中，Tm值随着甲基化程度的升高而升 高，曲线从左往右依次分开排列，因此能精确地划分标本甲基化程度。图1表示通过定 量检测的荧光曲线，显示所有的标准品的起始量均处于同一检测水平。图2显示标准曲 线在融解温度从76°C上升到88°C的过程中，显示出荧光信号的差异。图3为每个浓度 的标准品检测的荧光信号减去0%的未甲基化的标准品的荧光信号(即差异显示的荧光信 号)的图。图4为显示了检测反应的特异性。5.标准曲线的建立用HRM方法检测0_100%标准品得到的荧光信号的强度， 减去0%的标准品的荧光信号的强度，得到差异显示的荧光信号强度，据此建立双对数标 准曲线。结果显示根据每个浓度的标准品对应的荧光信号的强度(表1所示)，取双对 数做图，得到标准曲线如图5所示，得到的线性方程为y = 0.4759x+0.8708，其中R2 = 0.9755。本研究探索采用HRM方法，使用商品化的100%甲基化标准品，建立甲基化标 准曲线，以定量检测样本甲基化程度。表IAKAP12基因甲基化程度
权利要求
1.一种定量检测AKAP12甲基化水平的方法，其特征在于，对样品DNA进行修饰 后，分别以样品和标准品的DNA为模板进行PCR扩增，进行高分辨率熔解曲线分析，然 后根据每个标准品差异显示的荧光强度建立标准曲线，最后将样品与标准品的曲线比较 获得样品AKAP12甲基化百分比。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以甲基化敏感性高分辨融解曲线制作方法 制作标准曲线。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对样品DNA进行修饰时，将样品DNA中 未甲基化的位点与甲基化的位点修饰成不同的基团。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行PCR扩 增 的 弓I 物 是 5， -GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3， 禾口 5，-AACACGCCCTACAACAACATCTA-3 ‘。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行高分辨率熔解曲线分析的条件为 950C 2min, 40°C 2min预处理后，熔解温度76 88°C，每升高0.1°C采集一次数据。
6.权利要求1、2、3、4或者5所述的方法用于制备肿瘤诊断试剂。
7.权利要求1、2、3、4或者5所述的方法在制备诊断结直肠癌诊断试剂中的应用。
8.—种定量检测AKAP12甲基化水平的试剂盒，其特征是该试剂盒含有制作标准曲 线的标准品、阳性质控和阴性质控反应体系。
全文摘要
本发明属表观遗传学领域，涉及肿瘤的基因诊断，具体涉及AKAP12基因启动子区域的甲基化，尤其对人AKAP12基因甲基化程度的检测。本发明提供了一种定量检测AKAP12甲基化水平的方法，分别以样品和标准品的DNA为模板进行PCR扩增，进行高分辨率熔解曲线分析，然后根据每个标准品其差异显示的荧光强度建立标准曲线，最后将样品与标准品的曲线比较获得样品AKAP12甲基化百分比。本方法能检测低至1％的甲基化发生，且重复性高、简便易行，特别是对无法作组织取样的肿瘤患者的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控，可以作为肿瘤，尤其是结直肠癌的辅助诊断、监测和治疗。
文档编号G01N21/64GK102021233SQ20091019605
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者关明, 刘春芳, 刘维薇, 吕元, 李敏, 林勇 申请人:复旦大学附属华山医院