专利名称：一种检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的质谱试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳腺癌淋巴结转移蛋白的检测试剂，特别是用质谱检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的试剂。
背景技术：
乳腺癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化的过程。基因组学研究由于自身的限制难以完全阐明基因与蛋白质参与过程及其具体作用，而近年来蛋白质组学的发展为人们从整体上了解恶性肿瘤的发生、发展提供了较为理想的技术平台。目前临床上对恶性肿瘤预后评估主要依赖于临床表现、病理学及传统肿瘤标志(tumormarker)，但肿瘤早期复发或转移时常常无明显临床表现，而病理学证据很难得到且重复性差。乳腺癌在世界范围内其发病率都比较高，在美国每年的新发乳腺癌病人占女性各种恶 性肿瘤的1/3。在我国乳腺癌发病率也已居女性各种恶性肿瘤前列。虽然对于乳腺癌的治疗已经取得了实质性的进展，预防和早期发现仍是降低乳腺癌死亡率的有效途径和提高患者成活率的关键。但目前的检测方法敏感性和特异性均较低，已成为乳腺癌早期检测的一个瓶颈。乳腺癌的高发病率和高死亡率使得人们不断地寻求一种有效的早期检测方法，临床上仅以CA153 —种蛋白作为血清学检测指标在敏感性和特异性上是远远不足的，而影象学检测一旦发现占位病变则已经不是很早期了。能够使疾病在发生的极早期就能够得已发现，并得到控制和治疗，进而大大提高治愈率或明显改善病人的预后和生活质量。近年来随着临床蛋白质组学的开展，使得乳腺癌的早期发现成为可能。蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一、通过将蛋白质的混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物；第二、通过标记的方法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)、高效液相层析(high-performanceliquid chromatography, HPLC)> 毛细管电泳(capillaryelectrophoresis, CE)、亲和层析(affinity choromatography)、蛋白芯片(proteinmicroarray)、磁性微球(magneticbeads,简称磁珠)和免疫组等。特别是蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术克服了以往技术的缺点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好、可机械化操作和方法灵活等特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织液等；检测快速，一般一例标本的检测时间仅需约5分钟，从标本制备到出结果全过程仅约I小时。蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术有可能在体液中潜在生物标志(biomarker)检测方面创造革命性突破(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展，基础医学与临床，2007，27 :134-142 ;Wang QT, etal.Constructionof a multiple myeloma diagnostic model by magnetic bead-basedMALDI-T0F massspectrometry of serum and pattern recognition software.AnatRec (Hoboken). 2009 :292 :604-610)。二维电泳2_DE最先被用于临床蛋白组学研究，但其对疏水性、强酸性和强硷性蛋白的分辩率不够，而且不能检测低丰度蛋白，故实用价值受限。近来，蛋白芯片与质谱技术的结合，已被成功地用于肿瘤研究；但由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007,27 :193-197)。磁珠具有优于二维电泳、蛋白芯片和其他质谱方法的特点，已被广泛地用于肿瘤等生物标志的筛查等研究(屠世良等，癌胚抗原阴性结直肠癌的检测和结直肠癌预后相关生物标志，基础医学与临床，2007 ;颜怀军等，应用蛋白质组学技术对脂肪肝患者血清标志物的筛选.世界华人消化杂志2008，16 =3904-3909)。该技术具有操作简便、无需离心样品、可直接分析原始生物样本(如血清、尿液等)、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组学方法互补，目前已被广泛地用于肿瘤标志的筛查和临床检测，并均已获得很好的结果。但国内迄今尚无采用磁珠与液相色谱质谱联用仪(liquid chromatographymassspectrometry, LC-MS)获得检测乳腺癌淋巴结转移血清特征蛋白的报道。液相色谱质谱联用仪的优势为测定蛋白的质荷比m/z的精确度要比激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)高，质荷比 m/z 误差< 0. 001%。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的检测乳腺癌淋巴结转移的方法和试剂，通过建立检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的优化质谱模型，提供用质谱法检测乳腺癌淋巴结转移特征蛋白的试剂。本发明通过能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测乳腺癌淋巴结转移生物标志。本发明建立了一种检测乳腺癌淋巴结转移的血清蛋白质谱模型，其特征在于包括选自51个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白；所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值 K 分别为 m/z = 5643, K ^ 5. 84 ；m/z = 4651, K ^ 11. 28 ；m/z = 2377, K > 6. 19 ；m/z =2240，K > 9. 35 ；m/z误差< 0. 001 %，临界峰值均值K的变异系数CV < 5 10%。从血清中筛选出51蛋白作为特征蛋白；选取上述51个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值K，建立了乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型。上述质谱模型是采用以下步骤制备而得的1)4°C条件下2小时内收集乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者的血清两组血清标本，在-80°C低温冷冻备用；2)采用WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述两组血清标本的蛋白进行吸附；3)用电喷雾电离已洗脱的血清蛋白后用液相色谱质谱联用仪对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，由此获得两组蛋白质谱图谱；4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控0型血清校正仪器，使蛋白质分子量误差< 0. 001%和临界峰值均值K的变异系数CV < 5 10%，并精确地、定量地收集乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者优化的血清质谱图谱数据；5)对所得数据进行统计学处理，根据乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者血清之间蛋白峰的差异，检测出2组血清蛋白质谱图谱之间有51个稳定的差异蛋白及其临界峰值；将所述51个差异蛋白作为乳腺癌淋巴结转移蛋白质谱模型的特征蛋白；6)选取所述51个特征蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值K构成用于检测乳腺癌淋巴结转移血清特征蛋白质谱模型；其中所述的特异蛋白质所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值K分别为m/z =5643，K ^ 5. 84 ；m/z = 4651，K ( 11. 28 ；m/z = 2377，K > 6. 19 ；m/z = 2240，K > 9. 35 ；m/z误差< 0. 001 %，临界峰值均值K的变异系数CV < 5 10%。具体操作步骤如下
1)4°C条件下2小时内收集经病理明确诊断的乳腺癌无淋巴结转移患者血清及经病理确定为乳腺癌有淋巴结转移的血清作为两组血清标本，进行_80°C低温冷冻备用；病人血清样本随后被分成两组一组为训练集，另一组为盲测组；2)采用阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者的两组血清标本的蛋白进行吸附；3)用电喷雾电离已洗脱的生物标志后，用液相色谱质谱联用仪对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为30kDa，优化分子量范围1000 17000Da，最佳聚集中心9000Da，数据采集参数范围20 80，激光强度150 180，检测敏感度为7 8，收集总数为100次，由此获得两组蛋白质谱图谱；4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控0型血清校正仪器，用2746±lDa、5909±lDa、6634±lDa标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使m/z误差< 0. 001%，从而获得的精确的蛋白质谱图谱；5)定量性质谱调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634. ODa等强度调至50%信号强度的最大值，使临界峰值均值K的变异系数CV < 5 10%，并收集精确的质谱图谱数据；6)对所得数据进行Mann-Whitney U检验统计学处理，根据乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者血清之间蛋白峰值的差异(认定P值小于0.05时具有统计学意义)，检测出2组血清蛋白指纹质谱图谱之间有51个稳定的差异蛋白，见表I :表I乳腺癌淋巴结转移和对照组的51个差异峰
权利要求
1.一种用液相色谱质谱联用仪的方法检测人体血清样品中特异蛋白的试剂，其特征在干特异蛋白是乳腺癌淋巴结转移的蛋白，含有能与特异蛋白质结合的磁珠基质，所述磁珠是可吸附样品中蛋白质的WCX阴尚子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠。
2.一种检测试剂盒，其特征在于含有试剂盒操作方法的说明书； 含有阳性对照与阴性对照，所述对照可用液相色谱质谱联用仪进行分析； 将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与所述选自51个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白逐一进行对比分析，所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值 K 分别为 m/z = 5643，K ≤ 5. 84 ；m/z = 4651，K ^ 11. 28 ；m/z = 2377，K > 6. 19 ；m/z = 2240，K > 9. 35 ;质荷比m/z误差< O. 001 %，临界峰值均值K的变异系数CV < 5 10%。
3.人体血清样品中特异蛋白的试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)4°C条件下2小时内收集乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者的两组血清祥品，在-80°C低温冷冻备用； 2)采用WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述两组血清样品的蛋白进行吸附； 3)用液相色谱质谱联用仪对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，由此获得两组蛋白质谱图谱； 4)在毎次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清样品校正仪器，使质荷比m/z误差< O. 001%和临界峰值均值K的变异系数CV < 5 10%，并精确地、定量地收集乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者优化的血清质谱图谱数据； 5)对所得数据进行统计学处理，根据乳腺癌无淋巴结转移和乳腺癌有淋巴结转移患者两组血清样品之间蛋白峰的差异，检测出两组血清蛋白质谱图谱之间有51个稳定的差异蛋白及其临界峰值； 6)将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与所述选自51个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白逐一进行对比分析，所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值 K 分别为 m/z = 5643，K 彡 5. 84 ；m/z = 4651，K ^ 11. 28 ；m/z = 2377，K > 6. 19 ；m/z = 2240，K > 9. 35 ;质荷比m/z误差< O. 001%，临界峰值均值K的变异系数CV < 5 10%。
4.权利要求3所述的人体血清样品中特异蛋白的试剂的制备方法，其特征在于将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值K与所述选自51个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白逐一进行对比分析。
5.权利要求4所述的人体血清样品中特异蛋白的试剂的制备方法，其特征在于所述待检样品中相应蛋白是质荷比为5643、4651、2377、2240的特征蛋白。
全文摘要
本发明建立了一种检测乳腺癌淋巴结转移的血清蛋白质谱模型，本发明发现了乳腺癌淋巴结转移的血清蛋白中具有51个特征蛋白，选取其中任意两个或两个以上蛋白，并用质谱分析，可检测乳腺癌淋巴结转移。本发明根据所述质谱模型，开发了用质谱方法检测血清中特异蛋白的试剂和试剂盒。
文档编号G01N30/72GK102692471SQ201110068949
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者徐建华, 毛伟敏, 许洋 申请人:许洋