专利名称：压电基因诊断芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于基因检测设备，特别是用于基因诊断的电检测器件。
基因诊断是指用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的水平或结构变化而做出的或辅助临床诊断的技术。绝大多数疾病的发生发展都与患者遗传背景或者其改变有关。与疾病相关的遗传背景改变主要有两类，一是遗传物质，即DNA或RNA的水平的变化。例如病毒感染量病毒基因及其转录产物在人体内的从无到有，某些肿瘤中癌基因表达水平的从低到高。二是遗传物质的结构变化，即基因突变，如点突变引起的基因失活，及染色体转位引起的基因激活或灭活等等。
基因诊断的对象主要有首先是病原生物的侵入，直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性和特异性，而且在无法得到商业化抗体时，基因诊断就成为检测病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯一手段；其次是先天遗传性疾患，一些发病原因确定的遗传性疾患和其它病因尚不清楚的疾病都可能与某个或某些基因的持有或改变有关，例如苯丙氨酸羟化酶基因突变可引起苯丙酮尿症；再者是后天基因突变引起的疾病，例如肿瘤的发生可以初步认为是由于个别细胞基因如抑癌基因或癌基因发生突变而引起的细胞无限增殖；其它如DNA指纹、个体识别、亲子关系识别、法医物证等。目前，基因诊断已在病毒性肝炎，艾滋病等传染病的诊断中发挥了不可代替的作用，用基因诊断的方法检测基因突变的发生，不仅对临床诊断，而且对疾病的病因和发病机理的研究都具有重要的意义。
基因芯片技术是基因诊断技术一种重要器件。基因芯片技术是指将大量基因探针分子(基因探针阵列)固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，实现对基因的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片技术解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting和Northern Blotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的基因诊断应用。《生物工程进展》1999,Vol.19,No.4上发表的“基因芯片技术及应用研究进展”文章，综述了国内外对基因芯片技术在加工制备、功能和应用方面的主要研究成果。
在中国专利98120104中公开的“光纤阵列型基因芯片及其制作方法”技术，预先在单根光纤单元的端面生长基因探针并固化后，再将一组带不同基因探针的光纤单元排布成阵列。可在光纤单元两端进行检测，每种光纤单元的基因探针生长可大批量一次性完成，再组合成一定规格的阵列。在中国专利98122060中公开的“通用微方阵”，提供了一种通过在二维空间按既定的地址将具有不同负载特性的光纤或毛细管为基元拼装起来制成的如基因芯片等微方阵的技术。该法首先是将目标物固定在光纤的一个端面上形成载体式光纤。由大量品种的目标分子的载体光纤构成以光纤为载体的目标分子文库。从这种文库中按顺序取出光纤并依次排列成目标分子载体光纤方阵，经加工形成芯片。用与芯片的微方阵和CCD的像素点方阵对准并连接的光纤束形成信号检测的传导系统。
现有基因芯片技术一方面是基因芯片的制备主要是采用固相原位合成结合照相平板印刷的技术在玻璃片等载体上合成、固定探针分子阵列；另一方面基因芯片的检测主要是利用荧光素等标记样品(靶)基因，借助激光共聚焦显微扫描技术或电荷藕合器件(CCD)摄像技术对芯片上杂交靶基因的荧光信号进行检测和分析。因此，现有基因芯片技术对检测条件有极其严格的要求，而且检测设备复杂、成本高，难以小型化与芯片相匹配；另外，使用基因芯片时先需对样品基因进行标记，然后在芯片上进行杂交反应，等反应完成后再洗脱未杂交的标记物，最后进行芯片检测，整个操作冗繁，难以实现自动化。
鉴于此，本发明的目的是针对已有基因芯片技术存在的上述问题，提供一种无须标记、能实时获取芯片上各探针的反应信息，并具有自动、高速、高效，使用简便、相关设备简便、易于小型化、成本低廉的压电基因诊断芯片。
为达上述目的，本发明将由压电谐振片及其上的微型电极阵列形成的压电谐振阵列与一一对应地固定在各微型电极上形成的基因探针阵列相结合来构成压电基因诊断芯片。并进一步依据名种基因诊断的对象采用相应的基因探针阵列分别形成各种靶基因的检测位点，来构成名种压电基因诊断芯片。
本发明的压电基因诊断芯片(参见附图)，压电基因诊断芯片，包含压电材料的压电谐振片(1)及其两侧片面上的电极、电极上的探针，上述压电谐振片的片面是光整表面，电极有分别在压电谐振片的两片面上的共用电极(2)和由至少两个相互隔离的微型电极(3)构成的微型电极阵列，探针是与基因诊断对象相对应的寡核苷酸的基因探针(4)，基因探针成一一对应地固定在微型电极的表面上，构成有至少一种基因探针的基因探针阵列。
上述的基因探针(4)，可以是甲型肝炎的基因探针、或乙型肝炎的基因探针、或丙型肝炎的基因探针、或丁型肝炎的基因探针、或戊型肝炎的基因探针。从而使压电基因诊断芯片成为压电肝炎基因诊断芯片。
上述的基因探针(4)，可以是沙眼衣原体的基因探针、或淋球菌的基因探针、或解脲支原体的基因探针、或梅毒螺旋体的基因探针、或艾滋病病毒的基因探针、或单纯疱疹病毒的基因探针。从而使压电基因诊断芯片成为压电性病基因诊断芯片。
上述的基因探针(4)，可以是肺炎支原体的基因探针、或肺炎衣原体的基因探针、或呼吸道合胞病毒的基因探针、或腮腺炎病毒的基因探针、或结核杆菌的基因探针。从而使压电基因诊断芯片成为压电呼吸道疾病基因诊断芯片。
上述的基因探针(4)，可以是或幽门螺旋杆菌的基因探针、或轮状病毒的基因探针、或腺病毒的基因探针。从而使压电基因诊断芯片成为压电胃肠道疾病基因诊断芯片。
上述的基因探针(4)，可以是风疹病毒的基因探针、或人类巨细胞病毒的基因探针、或单纯疱疹病毒的基因探针、或可萨奇病毒的基因探针、或梅毒螺旋体的基因探针。从而使压电基因诊断芯片成为压电产前基因诊断芯片。
上述的基因探针(4)，也可以是ras的基因探针、或ras的mRNA的基因探针、或C-myc的基因探针、或C-myc的mRNA的基因探针。从而使压电基因诊断芯片成为压电肿瘤基因诊断芯片。
上述的基因探针(4)，还可以是镰状红细胞贫血的基因探针、或α和口地中海贫血的基因探针、或甲型血友病的基因探针、Duchenne肌营养不良症的基因探针、或囊性纤维变性的基因探针、或Huntington氏症的基因探针。从而使压电基因诊断芯片成为压电遗传疾病基因诊断芯片。
上述的基因探针(4)的寡核苷酸的长度为20-70bp，可以在寡核苷酸分子的一端接含硫、或氮、或氧、或卤素原子的化学分子或生物分子，然后再固定于微型电极(3)的表面。
上述的压电谐振片(1)的边缘与周边高中部低的凹形的基座(5)的周边的上部相连接；上述的压电谐振片(1)的材料可以是石英晶体、或压电陶瓷、或压电聚偏氟乙烯薄膜，其片面呈为n边型，且n≥3；上述的微型电极是片状的圆形、或椭圆形、或n边型，且n≥3；上述的基座(5)的材料是陶瓷、或塑料、或玻璃。
本发明所采用的基因探针阵列与压电谐振阵列结合，是将基因探针阵列的各种探针分子一一对应固定在压电谐振阵列的各个微型电极上，形成各种靶基因的检测位点。也可以在探针分子的一端接上含硫、或氮、或氧、或卤素原子的化学分子或生物分子后，与相应的压电谐振微型电极的表面金属原子结合，自组装形成一有序排列的探针分子层，固定在压电谐振微型电极表面，形成一种靶基因的检测位点。各种靶基因的检测位点在压电谐振片上组成靶基因检测阵列，其整体构成压电基因诊断芯片。
本发明的压电基因诊断芯片与检测仪配套使用，配装时将共用微型电极和各微型电极的引脚与检测仪的振荡电路一一对应联接，从而构成压电基因传感器阵列。进行基因诊断时，将靶基因置于各探针上，利用各微型电极形成的检测位点的压电谐振频率与该位点的表面质量成反比，当探针与靶基因杂交时，通过测量各检测位点的谐振频率可实时或在位检测相应各位点杂交反应的动态进程，从而对相应各种靶基因进行定性和定量分析。
本发明与已有技术比较，具有如下的优点和效果。
首先，本发明所采用的基因探针阵列可以是根据临床诊断的对象或需要设计组合而成，即将临床上已知的一类多种或多类多种疾病的基因探针组合成一组基因探针阵列，使本压电基因诊断芯片可同时对一种或多种致病基因或基因突变进行早期基因诊断。具有无须标记、使用简便、高特异性、高检测效率的优点。
其次，本发明所采用的由一个片型的压电材料的压电谐振片、压电谐振片一侧片面上的共用电极和另一侧片面上的阵列形的微型电极构成压电谐振阵列的结构，特别是将压电谐振片的边缘固定在基座上的结构，使芯片上的各电极与基座不相接触，因此由各电极与振荡电路构成的各谐振单元能不受约束地自由谐振，不存在因固定导致的损耗，其谐振性能即灵敏度和稳定性高，优于其它压电谐振器及阵列。
再者，本发明的芯片结构简单易于制造，制作方法简便、易于大批量制备、成本低廉。
另外，本发明与检测仪配套采用频率测量，能对本芯片上各检测位点同时进行高灵敏度、高精度地实时、在位检测；且能使检测设备简化、易于小型化。
本发明的压电基因诊断芯片与检测仪配套使用，适用于各种疾病的早期、高效和快速诊断。
下面，再用实施例及其附图对本发明作进一步地说明。
附图的简要说明。
图1是本发明的一种压电基因诊断芯片的剖视结构示意图。
图2是图1的压电基因诊断芯片的俯视结构示意图。
本发明的压电基因诊断芯片，如附图1、2所示，由压电谐振片、共用电极、微型电极阵列及其引脚、基因探针、基座构成。
上述压电谐振片1选用石英晶体，也可以选用压电陶瓷、或压电聚偏氟乙烯薄膜等压电材料。采用通常方法制成表面光整的平片形，其片面呈为n边型，且n≥3，即可以是三边形、四边形、五边形等多边形。
上述共用电极2、微型电极3阵列分别固连在压电谐振片1两侧的片面上。采用通常的金、银、铝等导电材料。用真空蒸镀法将导电材料镀覆在压电谐振片的两侧片面上形成导电膜，在压电谐振片的一侧片面上的导电膜成为共用电极2；用光刻法、化学病蚀法按设计的阵列图形，将压电谐振片1的另一侧的片面上导电膜制成由多个相互隔离呈均匀分布的阵列形的微型电极3组成的微型电极阵列。共用电极2、微型电极3及其引脚5选用金材料，也可以选银、或铝等导电材料。压电谐振片1、共用电极2、微型电极3的形状为片状的圆形、或椭圆形、或n边型，边数n≥3，即可以是三边形、四边形、五边形等多边形。
上述基因探针4选用序列与致病基因互补的、长为20-70bp的寡核苷酸，一种致病基因可选用一种以上寡核苷酸作为基因探针。基因探针4即寡核苷酸分子的一端接上含硫、或氮、或氧、或卤素原子的化学分子或生物分子后，与相应的压电谐振微型电极的表面金属原子结合，自组装形成一有序排列的探针分子层，固定在压电谐振微型电极表面。
上述基座6选用陶瓷，也可以选用塑料、或玻璃等绝缘材料，制成周边高中部低的凹状的四方体形。压电谐振片1的边缘通过热压或用胶粘剂，固定于基座的周边的上部。基座的作用是支撑压电谐振片，组装时要求微型电极及其上的基因探针不与基座相接触。从而制成本发明的压电基因诊断芯片。在本发明的一块13.6mm×6.0mm的压电基因诊断芯片上，有2×8个0.8mm×0.8mm的微型电极，从而构成有16个压电基因谐振传感器的压电基因诊断芯片。
实施例1本发明的一种压电基因诊断芯片，是一种压电肝炎基因诊断芯片。
本实施例的压电谐振片1为100μm厚的石英晶体片，微型电极膜3及其引脚5为200nm厚的金膜，压电谐振片1与微型电极3形状均为四边形，探针分子4为甲型肝炎的2种基因探针、乙型肝炎的2种基因探针、丙型肝炎的2种基因探针、丁型肝炎的2种基因探针和戊型肝炎的2种基因探针，共5种病毒的10种基因探针，基座6为陶瓷。探针4经含硫基团修饰后固定于微型电极3表面。本实施例可用于甲、乙、丙、丁、戊各型肝炎的快速同时检测，用于肝炎的基因诊断，以及对病毒定量及肝炎病人血清中病毒数量与肝损害的关系等。
实施例2本发明的一种压电基因诊断芯片，是一种压电性病基因诊断芯片。
本实施例的压电谐振片1为120μm厚的石英晶体片，微型电极膜3及其引脚5为500nm厚的银膜，压电谐振片1与微型电极形3状均为圆形，探针阵列4为沙眼衣原体的3种基因探针、淋球菌的3种基因探针、解脲支原体的2种基因探针、梅毒螺旋体的2种基因探针、艾滋病病毒的2种基因探针和单纯疱疹病毒的4种基因探针，共6种病原体的16种基因探针，基座6为塑料。探针4经含氧基团修饰后固定于微型电极3表面。本实施例可用于沙眼衣原体、淋球菌、解脲支原体、梅毒螺旋体、艾滋病病毒和单纯疱疹病毒的快速同时检测，用于性病的基因诊断。
实施例3本发明的一种压电基因诊断芯片，是一种压电呼吸道疾病基因诊断芯片。
本实施例的压电谐振片1为500μm厚的压电陶瓷片，微型电极膜3及其引脚5为200nm厚的铝膜，压电谐振片1和微型电极3形状均为四边型，探针阵列4为肺炎支原体的3种基因探针、肺炎衣原体的3种基因探针、呼吸道合胞病毒的3种基因探针、腮腺炎病毒的3种基因探针、以及结核杆菌的3种基因探针，共5种病毒的15种基因探针，基座6为陶瓷。探针4经含氮基团修饰后固定于微型电极3表面。本实施例可用于肺炎支原体和衣原体、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒以及结核杆菌的快速同时检测，用于常见的呼吸道疾病的基因诊断。
实施例4本发明的一种压电基因诊断芯片，是一种压电胃肠道疾病基因诊断芯片。
本实施例的压电谐振片1为500μm厚的压电陶瓷片，微型电极膜3及其引脚5为200nm厚的银膜，压电谐振片1形状为四边型、微型电极3形状为园型，探针阵列4为幽门螺旋杆菌的3种基因探针、轮状病毒的5种基因探针、腺病毒的4种基因探针，共3种病毒的12种基因探针，基座6为塑料。探针4经含碘基团修饰后固定于微型电极3表面。本实施例可用于常见胃肠道疾病的病原体快速同时检测，如与胃炎、胃溃疡、胃癌密切相关的幽门螺旋杆菌，与婴儿腹泻相关的轮状病毒，腺病毒等，用于胃肠道疾病的基因诊断。
实施例5本发明的一种压电基因诊断芯片，是一种压电产前基因诊断芯片。
本实施例的压电谐振片1为200μm厚的石英晶体片，微型电极膜3及其引脚5为300nm厚的铝膜，压电谐振片1与微型电极3形状均为四边形，探针阵列4为风疹病毒的3种基因探针、人类巨细胞病毒的3种基因探针、单纯疱疹病毒的3种基因探针、可萨奇病毒的3种基因探针和梅毒螺旋体的3种基因探针，共5种病毒的18种基因探针，基座6为塑料。探针4经含硫基团修饰后固定于微型电极3表面。本实施例可用于风疹病毒、人类巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、其他病原体如可萨奇病毒和梅毒螺旋体等的快速同时检测，这些病原体通过孕妇胎盘，经血液循环感染胎儿，可引起小儿畸形，脑积水，先天性心脏病等，这些病原体的基因诊断对孕妇产前检查具有十分重要的意义。
实施例6本发明的一种压电基因诊断芯片，是一种压电肿瘤基因诊断芯片。
本实施例的压电谐振片1为100μm厚的石英晶体片，微型电极膜3及其引脚5为200nm厚的金膜，压电谐振片1形状为四边形、微型电极3形状为圆形，探针阵列4为ras基因及其mRNA的6种基因探针、C-myc基因及其mRNA的6种基因探针，共12种基因探针，基座6为塑料。探针4经含氧基团修饰后固定于微型电极3表面。本实施例可用于ras基因及其mRNA以及C-myc基因及其mRNA的快速同时检测，ras基因表达p21蛋白，C-myc基因表达与肺癌、胃癌、肝癌等有关，表达水平与肿瘤的复发、预后有相关性，检测两者的mRNA表达水平，可用于肿瘤诊断，也可用于无症状肿瘤的筛选。
实施例7
本发明的一种压电基因诊断芯片，是一种压电遗传疾病基因诊断芯片。
本实施例的压电谐振片1为100μm厚的聚偏氟乙烯薄膜，微型电极膜3及其引脚5为200nm厚的金膜，压电谐振片1与微型电极3形状均为四边形，探针阵列4为镰状红细胞贫血的4种基因探针、α和口地中海贫血的8种基因探针、甲型血友病的4种基因探针、Duchenne肌营养不良症的8种基因探针、囊性纤维变性的6种基因探针和Huntington氏症的6种基因探针，共7种遗传病的36种基因探针，基座6为陶瓷。探针4经含硫基团修饰后固定于微型电极3表面。本实施例可用于导致镰状红细胞贫血、α和口地中海贫血、甲型血友病、Duchenne肌营养不良症、囊性纤维变性和Huntington氏症的基因突变的快速同时检测，用于常见遗传疾病的基因诊断。
上述实施例压电基因诊断芯片的最低检出量为1-10 ng/mL，可在10分钟内一次完成对多种靶基因的同时测定。
权利要求
1.压电基因诊断芯片，包含压电材料的压电谐振片(1)及其两侧片面上的电极、电极上的探针，其特征在于压电谐振片的片面是光整表面，电极有分别在压电谐振片的两片面上的共用电极(2)和由至少两个相互隔离的微型电极(3)构成的微型电极阵列，探针是与基因诊断对象相对应的寡核苷酸的基因探针(4)，基因探针成一一对应地固定在微型电极的表面上，构成有至少一种基因探针的基因探针阵列。
2.根据权利要求1所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的基因探针(4)是甲型肝炎的基因探针、或乙型肝炎的基因探针、或丙型肝炎的基因探针、或丁型肝炎的基因探针、或戊型肝炎的基因探针。
3.根据权利要求1所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的基因探针(4)是沙眼衣原体的基因探针、或淋球菌的基因探针、或解脲支原体的基因探针、或梅毒螺旋体的基因探针、或艾滋病病毒的基因探针、或单纯疱疹病毒的基因探针。
4.根据权利要求1所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的基因探针(4)是肺炎支原体的基因探针、或肺炎衣原体的基因探针、或呼吸道合胞病毒的基因探针、或腮腺炎病毒的基因探针、或结核杆菌的基因探针。
5.根据权利要求1所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的基因探针(4)是或幽门螺旋杆菌的基因探针、或轮状病毒的基因探针、或腺病毒的基因探针。
6.根据权利要求1所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的基因探针(4)是风疹病毒的基因探针、或人类巨细胞病毒的基因探针、或单纯疱疹病毒的基因探针、或可萨奇病毒的基因探针、或梅毒螺旋体的基因探针。
7.根据权利要求1所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的基因探针(4)是ras的基因探针、或ras的mRNA的基因探针、或C-myc的基因探针、或C-myc的mRNA的基因探针。
8.根据权利要求1所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的基因探针(4)是镰状红细胞贫血的基因探针、或α和口地中海贫血的基因探针、或甲型血友病的基因探针、Duchenne肌营养不良症的基因探针、或囊性纤维变性的基因探针、或Huntington氏症的基因探针。
9.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的基因探针(4)的寡核苷酸的长度为20-70bp，在寡核苷酸分子的一端接含硫、或氮、或氧、或卤素原子的化学分子或生物分子后再固定于微型电极(3)的表面。
10.根据权利要求9所述的压电基因诊断芯片，其特征在于所说的压电谐振片(1)的边缘与周边高中部低的凹形的基座(5)的周边的上部相连接，所说的压电谐振片(1)的材料是石英晶体、或压电陶瓷、或压电聚偏氟乙烯薄膜，其片面呈为n边型，且n≥3，所说的微型电极是片状的圆形、或椭圆形、或n边型，且n≥3。所说的基座(5)的材料是陶瓷、或塑料、或玻璃。
全文摘要
本发明属于基因诊断的电检测器件。本芯片包含压电材料的压电谐振片1及其两侧片面上的电极、电极上的探针,上述压电谐振片的片面是光整表面,电极有分别在压电谐振片的两片面上的共用电极2和由至少两个相互隔离的微型电极3构成的微型电极阵列,探针是与基因诊断对象相对应的寡核苷酸的基因探针4,基因探针成一一对应地固定在微型电极的表面上,构成有至少一种基因探针的基因探针阵列。适用于各种疾病的早期、高效和快速诊断。
文档编号G01N33/53GK1303013SQ0110714
公开日2001年7月11日 申请日期2001年2月20日 优先权日2001年2月20日
发明者莫志宏, 吴中福, 靳萍, 田学隆, 郭钢 申请人:重庆大学