专利名称：筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种筛选基因调控相关机制和分子的研究方法，尤其涉及一种筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法。
背景技术：
真核基因调控，是一种将蕴藏在DNA序列中的遗传信息，显现为有功能的蛋白质或核酸，进而参与各项生命活动的过程。这一过程要求基因组内各基因按特定的次序在特定的时间，空间，以适当的形式和数量进行表达。基因表达调控是生命得以维持和延续的前提。虽然人们对原核基因的表达调控已经有了比较深入的了解，但由于真核基因本身结构 和功能极为复杂，又缺乏有效的研究手段和技术，虽经多年巨大的努力，但相关研究的进展仍极为缓慢。时至今日，人们对真核基因的表达调控，依然所知甚少。真核基因是断裂基因，包括能够编码蛋白质序列的外显子和非编码的内含子序列以及非编码的调控序列。外显子能够经过翻译过程生成蛋白质，调控序列则结合相关的调控因子。在人类基因组内，编码外显子的序列仅占全序列的1%左右，非编码序列中，内含子占24%，剩余的75%为非编码的各种调控序列和大量重复序列。基因的平均长度为27kb，85%的基因长度小于lOOkb。就基因表达调控而言，每一特定基因的表达调控都可以单独进行。基因调控过程中，转录调控是最关键的环节。特定基因的转录调控是通过不同的转录因子与参与该基因调控的相关序列相结合来实现的。这些调控序列被称为顺式作用元件，与其结合的转录分子称为反式作用因子。顺式作用元件包括启动子，增强子，沉默子等。除启动子一般位于紧邻基因的上游之外，其他作用元件可以位于基因的上下游，位置无法预测。同特定基因启动子相结合的是RNA聚合酶和相关蛋白，这些因子决定该基因转录的起始。同特定基因增强子相结合的是组织特异性转录因子，决定该基因在某类组织和细胞内的表达水平。某一特定基因的表达都是多种转录因子和不同调控序列相结合结果。在人类基因组内，能够参与基因表达调控，拥有DNA结合区段的蛋白编码基因有2600多种。这些转录因子之间可以发生复杂的相互作用，转录因子连同与它们相结合的调控序列共同构成了一个庞大基因调控网络。核酸内切酶是一类能够识别双链DNA上某段特定核酸序列的核酸酶。这些特定的核酸序列被称之为该核酸内切酶的酶切位点。不同的核酸内切酶拥有各自不同的特异性的酶切位点。当某一核酸内切酶同DNA上其特异性酶切位点结合后，在适当的条件下，可以在该识别位点切断双链DNA。不同核酸内切酶的酶切位点长度和序列不同。当酶切位点的长度增加时，其在基因组内的识别位点的数量会变得稀少。当识别位点长度超过一定限度后，其识别位点的数量可以稀少到一套完整的基因组内也没有一个的程度。例如，当酶切位点长度为18bp时，随机出现一个识别位点的DNA长度为418bp，这是人类基因组的20倍。极稀少位点核酸酶是一类特殊的核酸内切酶，它们的酶切识别位点序列长度一般在IObp以上。其中，兆位核酸酶(meganuclease)是一类识别位点长度在12_40bp的极稀少位点核酸酶。目前已经从多种生物体内发现了数百种兆位核酸内切酶,并且新的兆位核酸酶数量还在不断增加。由于兆位核酸酶在每种生物的基因组内的识别位点极为稀少，这就为高特异性，高选择性的定向基因操作(包括基因治疗，遗传育种)等研究领域提供了广阔的应用前景。通过分析这些兆位核酸酶的结构特点，研究者们已经成功制备出经人工改造过的兆位核酸酶。这些人工兆位酶几乎能够识别任意特定的核酸序列。同时，已经有商品化的纯化兆位核酸酶在市场出售。由于基因组内绝大多数基因的长度都小于lOOkb，当包含某一基因的基因组片段足够长时，该片段的长度就可以包含该基因的完整编码序列和参与调控该基因表达的所有调控元件。在基因组计划中发展起来的大容量基因组载体库已经能够提供包含绝大多数基因完整序列的特定克隆，其中，Pl人工染色体(PAC)和细菌人工染色体(BAC)能够容纳长达100-300kb的基因组片段，酵母人工染色体(YAC)可容纳500kb-lMb的基因组片段。利用这 些载体构建的基因组文库已经实现了商品化，任何一段基因组序列，几乎都能够检索到相应的载体克隆。目前，对这些大容量基因组载体内的基因组大片段进行定点突变，插入，删除等多项操作的分子生物学技术已经成熟，改建好的载体能够在体外大量扩增，从而可以方便的获得修饰后的基因组片段，与此相关的技术服务已经实现商品化运作。近年来，生物合成技术的进步已经使得人们能够对多个DNA片段进行有序的拼接，这些片段可以是PCR的产物，整个拼接过程均可以在体外完成，效率极高。利用这些拼接技术，能够很容易的向合成的DNA片段内加入特定的序列，从而避免了繁琐的克隆筛选过程。应用这一技术，已经能够生成500kb以上的基因组片段，进行DNA拼接的生物合成相关试剂目前也已经实现了商品化。转基因技术的发展已经能够利用多种技术向细胞内导入大容量基因组载体，制备出含有基因组大片段的转基因细胞系或动物。同传统的小片段转基因相比，利用基因组大片段进行的转基因研究，能够向细胞内转入特定基因表达调控所需要的全部调控元件，这使得转入基因的表达能够同内源性基因一样受到同步调控，其表达状态直接反映出内源性基因的调控状态，同时其表达水平不受插入位点的影响，仅同转入基因的数量同关。在基因组内，由于不同基因的表达是细胞内外多种因素作用的结果，因此反式作用因子同顺式调控元件的结合多是暂时性的，这使得基因表达的调控具有灵活性，但同时也增加了分析的难度。在基因调控研究中，为了能够捕捉到这些短暂的转录因子同DNA的相互作用，通常要采用交联剂将蛋白和核酸固定在一起，再进行分离分析的手段。交联剂可以是物理上的电离辐射，紫外光照射，也可以是化学试剂，种类很多。交联剂将DNA和与其结合的转录因子交联在一起，经分离后，可以运用多种蛋白组，生化和分子生物手段分析参与基因调控的蛋白种类和相关调控元件的序列。由于体外研究的许多结果无法真实的反应体内的情况，人们迫切需要一种能够对体内基因调节进行研究的手段。当前能够直接检测体内同DNA相结合的蛋白的研究方法主要是染色质免疫沉淀法(CHIP)。这种方法首先用交联剂将DNA和与其结合的蛋白质交联固定，再用核酸酶消化法或超声粉碎法将染色质随机断成小片段，再采用能够特异性识别DNA结合蛋白的抗体，捕捉交联后的相应的片段。通过分析获得片段的序列，并与基因组序列进行比对，就能够确定在整个基因组内，与某类蛋白相结合所有调控序列所在的位置，提示其可能参与基因调控的种类和数量。这种方法只能应用在对全基因组的分析上，无法给出参与特定基因调控的相关蛋白情况。另一种分离染色质片段的蛋白组(PICH)方法，通过设计出与特定基因序列相结合的DNA探针，再利用探针对交联后的全基因组片段进行多轮反复的杂交，通过特异性的探针结合相应的基因组片段，分离出能够同特定基因片段相结合的所有蛋白。由于每一个基因在单一细胞内仅有两个等位基因，为了能够从复杂的基因组片段内成功的提取出所需的基因片段，PICH方法要求的材料数量很大，一次实验的细胞数高达IO9以上，培养细胞可达上百升，这对绝大多数细胞实验而言都很困难，因此这一方法仅在端粒结合蛋白中进行了验证。CHIP和PICH这两种方法代表了不同的研究策略，但在分析的过程中，都要将细胞匀浆，使得基因组断成小片段，再运用抗体或核酸探针进行特异性分离。参与这一过程的因素十分复杂，通常会会导致很高的背景，这使得抗体选用，探针设计，分离纯化和杂交条件的优化等非常困难。由于操作步骤繁琐，技术复杂，信号丢失严重，难以在组织细胞层面得到实施。
发明内容
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为了解决当前基因调控研究技术中存在的上述问题，本发明提供了一种能够高效筛选参与指定基因或遗传位点表达调控相关蛋白及其结合位点的高特异性，高灵敏性研究方法。特别是，本方法能够对真核细胞基因组内参与特定基因调控相关的蛋白种类和数量进行分析，包括组织和细胞。本发明的技术解决方案是本发明提供了一种筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法。本发明的特殊之处在于所述筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法包括以下步骤I)通过查找基因组数据库和相关载体库，找到包含有目的基因或基因组位点的完整基因组序列，并根据以往对该基因或基因位点的相关研究，确定研究所需基因组片段长度。通常研究所需的基因组片段长度的范围在100kb-300kb之间；2)对步骤I)所选定的基因组片段进行修饰，得到修饰后的基因组片段；3)将步骤2)所得到的修饰后的基因组片段进行大量扩增纯化，并运用转基因手段将修饰后的基因组片段导入目标细胞或目标动物内，分别形成转基因细胞或转基因动物4)对步骤3)所得到的转基因细胞或转基因动物施以特定刺激，这些刺激因素能够影响转基因表达调控机制，使得特定基因的表达发生变化；5)从步骤4)所得到的刺激后的转基因细胞或转基因动物中获取基因片段以及结合在这些基因片段上的调控蛋白；6)分离分析与核酸结合的蛋白和相应的核酸序列；上述步骤2)中的修饰的内容包括向选定的基因组片段内的特定位点插入选择和显示标记以及向选定的基因组片段内的特定位点导入极稀少位点核酸酶的酶切位点；所述向选定的基因组片段内的特定位点插入选择和显示标记是将抗药性基因和/或荧光蛋白等序列加入基因编码区内，利用这些遗传标记的表达变化观察和分析内源基因的表达情况，进行定向筛选，得到成功的转基因细胞；所述向基因组片段内导入的极稀少核酸酶的酶切位点是一段能够为极稀少核酸酶所特异性识别的核酸序列。极稀少核酸酶能够识别这些位点并与之结合，并能够在相应的酶切位点处切断双链DNA，制备出有双链断端的DNA序列；所述极稀少位点核酸酶包括但不限于兆位核酸酶类、重组酶以及能够在特定序列处切断DNA的酶类；所述兆位核酸酶类包括内含子核酸内切酶以及归巢子核酸内切酶；所述极稀少核酸酶识别的位点长度在IObp以上；所述修饰的实现方式是基因组载体重组工程法和/或生物合成法。上述步骤3)的具体实现方式是 3. I)通过载体在特定宿主菌内扩增或通过吉布森拼接大量合成修饰后的基因组片段；3. 2)通过常规的分子克隆方法对步骤3. I)所得到的大量的修饰后的基因组片段进行分离和纯化；3. 3)运用转基因方法将步骤3. 2)所得到的修饰后的基因组大片段导入目标细胞或目标动物内；若导入目标细胞时，所述转基因方法包括但不限于脂质体转染或电穿孔转染等方法，利用选择性培养基或标记基因筛选转染阳性细胞，若需要，可以建立稳定的转基因细胞或进行瞬时表达分析；若导入目标动物时，所述转基因方法包括但不限于原核微注射，并据此制备包含修饰后基因组大片段的转基因动物；3. 4)利用southern杂交、定量PCR、荧光原位杂交等分子生物学方法确定在转基因细胞或转基因动物体内转入的基因片段的数量；3. 5)运用蛋白电泳、特异性抗体以及组织染色等分子生物学方法分析目标基因的表达情况。上述步骤4)的具体实现方式是4. I)对转基因细胞或转基因动物施加特定刺激，所述刺激为研究所设定的刺激，包括各种物理化学或其他类刺激，可以包括但不限于药物、损伤、激素以及生长因子等；4. 2)观察转入基因的显示标记的变化，确定转入的基因表达发生了所需变化；使用交联剂将核酸和核酸结合蛋白交联固定；所述交联剂包括但不限于质量百分比浓度是O. 5-1%的多聚甲醛，例如可包括紫外线照射。上述步骤5)的具体实现方式是5. I)收集步骤4)所得到的刺激后的转基因细胞或转基因动物的组织；5. 2)获取转基因细胞的细胞核或转基因动物组织的细胞核，并将细胞核包埋在成形剂中；所述成形剂包括但不限于低熔点琼脂糖；5. 3)破损核膜，加入极稀少核酸内切酶以及适当的缓冲系进行消化；加入适合所述极稀少核酸内切酶发挥作用的特定条件(特定的离子和缓冲体系)；极稀少核酸酶将在转入的基因片段上的特定酶切位点处将DNA切断；5. 4)去除成形剂，释放消化后生成的基因片段以及结合在这些基因片段上的调控蛋白；
5. 5)将步骤5. 4)所得到的基因片段以及结合在这些基因片段上的调控蛋白进行分离纯化；所述分离纯化片段包括但不限于蔗糖密度梯度离心、超速离心、抗体磁珠捕捉以及片段末端标记杂交纯化。上述步骤6)的具体实现方式是6. I)对蛋白进行分离及蛋白种类的确定所述蛋白分离包括核酸外切酶降解核酸片断、蛋白电泳、酶解蛋白以及质谱分析蛋白谱，所述蛋白分离是确定结合蛋白的种类；6. 2)对核酸片段进行分析；所述核酸片段分析包括蛋白酶降解蛋白、通过常规酚氯仿抽提、DNA电泳、PCR分析、用核酸内切酶和外切酶结合，切除片段内未结合蛋白的核酸 到与蛋白结合处，向DNA末端接入接头，用蛋白酶消化掉结合的蛋白，用接头连接各蛋白结合片段，扩增测序，获得与蛋白结合的位点序列；6. 3)通过比对转入的基因组片段核酸序列，确定各结合位点在基因调控序列中的位置。本发明的优点是本发明涉及一种筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的新方法。该方法是一种能够分析体内参与特定基因表达调控相关蛋白的方法。本发明的原理是基于利用同源重组或生物合成的方法，在含有特定基因或遗传位点的基因组大片段内定向定位地导入极稀少核酸酶识别序列(酶切位点)，再用转基因方法将修饰后的含特定基因的基因组大片段转入真核细胞内制备成转基因细胞或动物。当给与转基因细胞或动物以特定刺激后，可调节转入基因的表达变化。通过交联剂将转入特定基因的基因组大片段上参与基因表达调控的相关蛋白与核酸位点相交联固定，用极稀少核酸酶特异性剪切转入的含特定基因的基因组大片段，生成多个结合有调控因子的含转入基因基因组片段的子片段。通过分析释放的子片段的核酸序列和同其结合的蛋白质谱，即可获得在某一生物过程中，参与对特定基因的表达进行调控的蛋白种类，数量和相应的结合位点。本发明是目前唯一能够对真核基因内特定基因表达调控进行系统筛选的方法，能够应用到各类真核基因或特定遗传位点的表达分析研究，特别是对参与重要生理病理过程相关基因的在体调控的分子机制的分析，将有助于为疾病防治寻找新的潜在靶点，将有着广泛的应用前景。
具体实施例方式本发明提供了一种筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，该方法包括以下步骤I)选定所要研究的基因或基因组位点，通过查找基因组数据库和相关载体库，找到包含有目的基因或基因组位点的完整基因组序列，并根据以往对该基因位点的相关研究，确定研究所需基因组片段长度(一般为尽量保持该基因位点的所有调控元件，并考虑到简化后续操作，选择的基因组片段长度在100kb-300kb之间，具体的情况视实验要求而定)。目前有多种开放的免费基因组数据库，并且每种数据库都能够提供多种检索工具，适合各种相关数据的检索和分析，例如NIH的基因组网站可以提供多种动物，植物，微生物，病毒和细胞器等多种基因组序列(http: //www. ncbi. nlm. nih. rov/sites/Renome)0其中，有关哺乳动物已经完成和正在进行的测序种类就达到125种。含有目的基因的大片段基因组载体库，可以在专业网站查询到，并可以订购(http://bacpac. chori. org/)0此夕卜，也可以通过正在实施的大规模转基因动物计划，如NIH的Gensat计划(http://www.gensat. otr/index, html)查到相关的已经实现了转基因表达的细菌性人工染色体载体，并可以订购。如果需要，可以自行构建所需的基因组载体库。2)向选定的基因组片段内的特定位点插入选择和显示标记(通常使用抗药性基因和/或荧光蛋白等基因加入基因编码区内，利用这些遗传标记观察基因表达情况，进行定向筛选，得到成功的转基因细胞)。向选定的基因组片段内的特定位置导入极稀少位点核酸酶的酶切位点(这些酶切位点的种类，数量和具体位置，视实验需要而定)。导入标记和位点的方法为同源重组工程法或生物合成法。向基因组片段内导入方法特定序列的方法包括以下几大类 a)基因组载体重组工程法(Recombineering),通过设计导入载体(包含有两侧与目标位点相同的同源序列和中间的导入位点序列)，在相关重组酶(recombinase)的作用下，以导入载体所含序列替代基因组内的目标序列。这一过程不依赖特定的酶切位点，能够随意对任何基因组片段内的特定位点进行操作。b)合成生物法(Synthetic Biology),主要采用吉布森拼接法(GibsonAssembly)。这包括以基因组片段的不同部位为模板进行多片段PCR扩增，通过设计PCR引物，将特定的序列导入PCR产物中。扩增后的各个PCR片段的末端含有相互重叠序列。再将这些PCR片段通过吉布森拼接反应，连接成含有导入位点的基因组大片段。c)也可以将上述两种方法相结合，通过重组将特定序列导入载体内的基因组片段中，再将各个片段分离提纯后，进行吉布森拼接反应。有关吉布森拼接反应的详细过程参见相关网站(http://www. synbio. org. uk/dna-assembly/guidetogibsonassembly. html)。向基因组片段内导入的极稀少酶切位点能够为该类核酸酶所特异性识别，并能够在相应的酶切位点处切断双链DNA，制备出双链断端。此类核酸酶包括自然生成和人工改造过的，其中包括a)兆位核酸酶类(meganuclease),包括内含子核酸内切酶(intronendonucleases)和归巢子核酸内切酶(intein endonucleases)。这类核酸酶的识别位点长度为12-40bp，不同的酶识别的位点不同，部分酶类已经有了商品化产品出售。b)重组酶(recombinase)和其他能够在特定序列处切断DNA的酶类,例如整合酶(integrase)。这类酶识别的位点长度在30_200bp之间,这些酶类可以通过转基因技术在体内表达,并有商品化产品出售。c)其他种类的核酸酶类，如人工改造或人工合成过的极稀少核酸酶。3)大量扩增修饰后的基因组大片段。通过上述方法的到的修饰后基因组大片段可以通过载体在特定宿主菌内扩增，或通过吉布森拼接大量合成。这些大片段可以通过常规的分子克隆技术进行分离和纯化。注意由于基因组片段比较大，操作时避免剪切力的损伤。运用转基因手段(脂质体转染或电穿孔转染)将修饰后的基因组大片段导入目标细胞内，利用选择性培养基或标记基因筛选转染阳性细胞，建立稳定的转染的细胞系。通过转基因技术(原核微注射等)，制备包含修饰后基因组大片段的转基因动物。利用southern杂交，定量PCR，荧光原位杂交等技术，确定转基因细胞或转基因动物体内转入基因片段的数量。运用蛋白电泳，特异性抗体和组织染色等技术，分析目标基因的表达情况。
4)根据实验目的，给与转基因细胞或动物施加适当刺激，使得转基因表达调控发生变化。这些刺激包括药物，损伤，激素，生长因子等等，通过观察转入基因的显示标记的变化，如细胞的目标蛋白含量，荧光强度等等，确定转入的基因表达发生了所需变化。使用适当的交联剂将核酸和核酸结合蛋白交联固定，通常采用多聚甲醛(O. 5-1%)，紫外线照射法，还可以根据实验要求选择其他类交联固定剂，注意所用交联剂不应导致转入基因组片段断裂。同时，也可以使用非固定的细胞作为正常背底对照。5)收集所需数量的转基因细胞或组织，破碎细胞，收集细胞核，清洗，将细胞核包埋在成形剂(如低熔点琼脂糖)中(避免剪切力对转入的基因组大片段的损伤)。破损核膜，加入当缓冲系，加入极稀少核酸内切酶进行消化。这些酶类将在转入的基因片段上的特定酶切位点处将DNA切断。去除成形剂，释放消化后生成的基因片段(包括结合在这些片段上的调控蛋白)，分离纯化片段(蔗糖密度梯度离心，超速离心，抗体磁珠捕捉，片段末端标记杂交纯化等多种方法)。6)分离分析与核酸结合的蛋白和相应的核酸序列。蛋白分离包括核酸外切酶降解核酸片断，蛋白电泳，酶解蛋白，质谱分析蛋白谱，确定结合蛋白的种类。核酸片段分析包括·蛋白酶降解蛋白，通过常规酚氯仿抽提，DNA电泳或PCR分析片段的种类位置。还可以用核酸内切酶和外切酶结合，切除片段内未结合蛋白的核酸到与蛋白结合处，向DNA末端接入接头，用蛋白酶消化掉结合的蛋白，用接头连接各蛋白结合片段，扩增测序，获得与蛋白结合的位点序列。再通过比对转入的基因组片段核酸序列，确定各结合位点在基因调控序列中的位置。本发明基于在真核细胞内，含特定基因的基因组大片段内含有调节该基因表达调控的所有序列，采用基因重组和生物合成等技术，在体外将极稀少核酸酶的特异性酶切位点定向插入含特定基因的基因组大片段内的特定位点。扩增纯化这些含特定基因的修饰后基因组大片段后，将其导入细胞或动物内，制成含有多个修饰后基因组大片段的转基因细胞或动物，从而使得内源性基因的相关调控因子能够通过结合转入基因所含有的基因调控元件，与内源性基因同步调节转入的特定基因的表达。利用交联剂将调控因子与相应的核酸序列交联固定，并通过极稀少位点核酸酶具有的极高特异性消化转入的修饰基因组片段，并保持原有细胞基因组不变，使得转入的基因组片段在特定的酶切位点断裂，生成交联有调控因子的该基因的基因组小片段。再通过对这些生成的含该基因的基因组小片段进行蛋白分析和核酸序列分析，从而获得同该基因在基因组内的调控机制相关的调节蛋白和调控序列的知识。与现有技术相比，本发明具有以下特点I、利用基因组大片段的大容量能够包含所有特定基因体内表达调控元件的特点；
2、向这个含特定基因的基因组大片段内定向导入极稀少位点核酸酶的酶切位点；3、将修饰后的含有极稀少位点核酸酶酶切位点的基因组大片段导入细胞内，导入的修饰后基因组片段可达上百个，利用细胞内源基因的调控分子对导入基因的表达进行调控；4、用交联剂将结合在含极稀少位点核酸酶酶切位点的导入基因组片段上的调控因子和核酸进行交联；5、用极稀少位点核酸酶消化含有修饰后特定基因组片段，由于原有基因组内不含有特异性极稀少位点核酸酶的酶切位点，极稀少位点核酸酶将只切断导入的修饰后基因组大片段，生成交联有调控因子的小片段；6、分析这些产生自导入基因组大片段的小片段及交联的调控分子，就可以得到调控该基因 表达的调控因子和相关调控序列。
权利要求
1.一种筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤 1)通过查找基因组数据库和相关载体库，找到包含有目的基因或基因组位点的完整基因组序列，并根据以往对该基因或基因位点的相关研究，确定所需基因组片段长度，所述所需基因组片段长度的范围在100kb-300kb之间； 2)对步骤I)所选定的基因组片段进行修饰，得到修饰后的基因组片段； 3)将步骤2)所得到的修饰后的基因组片段进行大量扩增纯化，并运用转基因手段将修饰后的基因组片段导入目标细胞或目标动物内，并分别形成转基因细胞或转基因动物 4)对步骤3)所得到的转基因细胞或转基因动物施加特定刺激，所述特定刺激能够影响转基因表达调控机制，使转基因表达发生变化； 5)从步骤4)所得到的刺激后的转基因细胞或转基因动物中获取基因片段以及结合在这些基因片段上的调控蛋白； 6)分离分析与核酸结合的蛋白和相应的核酸序列。
2.根据权利要求I所述的筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于所述步骤2)中的修饰的内容包括向选定的基因组片段内的特定位点插入选择和显示标记以及向选定的基因组片段内的特定位点导入极稀少位点核酸酶的酶切位占. 所述向选定的基因组片段内的特定位点插入选择和显示标记是将抗药性基因和/或荧光蛋白等序列加入基因编码区内，利用这些遗传标记观察转入基因的表达情况，并进行定向筛选，获得成功的转基因细胞和/或动物； 所述向基因组片段内导入的极稀少核酸酶的酶切位点是一段能够为极稀少核酸酶所特异性识别的核酸序列；所述极稀少核酸酶能够识别并结合这些位点并与这些位点结合，并能够在相应的酶切位点处切断双链DNA，制备出有双链断端的DNA ;所述极稀少核酸酶包括但不限于兆位核酸酶类、重组酶以及能够在特定序列处切断DNA的酶类；所述兆位核酸酶类包括内含子核酸内切酶以及归巢子核酸内切酶；所述极稀少核酸酶识别的位点长度在IObp以上； 所述修饰的实现方式是基因组载体重组工程法和/或生物合成法。
3.根据权利要求2所述的筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于所述步骤3)的具体实现方式是 3.I)通过载体在特定宿主菌内扩增或通过吉布森拼接大量合成修饰后的基因组片段； 3.2)通过常规的分子克隆方法对步骤3. I)所得到的大量的修饰后的基因组片段进行分离和纯化； 3.3)运用转基因方法将步骤3. 2)所得到的修饰后的基因组大片段导入目标细胞或目标动物内； 若导入目标细胞时，所述转基因方法包括但不限于脂质体转染或电穿孔转染，利用选择性培养基或标记基因筛选转染阳性细胞，建立稳定的转基因细胞； 若导入目标动物时，所述转基因方法包括但不限于原核微注射，并据此制备包含修饰后基因组大片段的转基因动物；.3. 4)利用southern杂交、定量PCR、荧光原位杂交等分子生物学方法确定在转基因细胞或转基因动物体内转入的基因片段的数量； .3.5)运用蛋白电泳、特异性抗体以及组织染色等分子生物学方法分析目标基因的表达情况。
4.根据权利要求3所述的筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于所述步骤4)的具体实现方式是 4.I)对转基因细胞或转基因动物施加特定刺激，所述特定刺激是为研究所设定的刺激，包括各种物理、化学以及其他分子生物学上可接受的刺激；所述特定刺激包括但不限于药物、损伤、激素以及生长因子； 4.2)观察转入基因的显示标记的变化，确定转入的基因表达发生了所需变化；使用交联剂将核酸和核酸结合蛋白交联固定；所述交联剂包括但不限于质量百分比浓度是O. 5-1%的多聚甲醛。
5.根据权利要求4所述的筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于所述步骤5)的具体实现方式是 5. I)收集步骤4)所得到的刺激后的转基因细胞或转基因动物的组织；使用交联剂将核酸和同核酸结合的蛋白交联在一起； 5. 2)获取转基因细胞的细胞核或转基因动物组织的细胞核，并将细胞核包埋在成形剂中；所述成形剂包括但不限于低熔点琼脂糖； 5. 3)破损核膜，加入极稀少核酸内切酶以及适当的缓冲系进行消化；所述极稀少核酸内切酶将在转入的基因片段上的特定酶切位点处将DNA切断； 5. 4)去除成形剂，释放消化后生成的基因片段以及结合在这些基因片段上的调控蛋白； 5.5)将步骤5. 4)所得到的基因片段以及结合在这些基因片段上的调控蛋白进行分离纯化；所述分离纯化片段包括但不限于蔗糖密度梯度离心、超速离心、抗体磁珠捕捉以及片段末端标记杂交纯化。
6.根据权利要求5所述的筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于所述步骤6)的具体实现方式是 6.I)对蛋白进行分离及蛋白种类的确定所述蛋白分离包括核酸外切酶降解核酸片断、蛋白电泳、酶解蛋白以及质谱分析蛋白谱，所述蛋白分离是确定结合蛋白的种类； 6.2)对核酸片段进行分析；所述核酸片段分析包括蛋白酶降解蛋白、通过常规酚氯仿抽提、DNA电泳、PCR分析、用核酸内切酶和外切酶结合，切除片段内未结合蛋白的核酸到与蛋白结合处，向DNA末端接入接头，用蛋白酶消化掉结合的蛋白，用接头连接各蛋白结合片段，扩增测序，获得与蛋白结合的位点序列； 6.3)通过比对转入的基因组片段核酸序列，确定各结合位点在基因调控序列中的位置，并确定与这些位点相结合的蛋白种类，确定参与特定基因表达调控的相关蛋白及其结合位点。
全文摘要
本发明涉及一种筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，1)确定研究所需基因组片段长度；2)对选定的基因组片段进行修饰；3)将修饰后的基因组片段进行大量扩增纯化，并运用转基因手段将修饰后的基因组片段导入目标细胞或目标动物内，分别形成转基因细胞或转基因动物4)对转基因细胞或转基因动物施以特定刺激；5)从刺激后的转基因细胞或转基因动物中获取基因片段以及结合在这些基因片段上的调控蛋白；6)分离分析与核酸结合的蛋白和相应的核酸序列；本发明提供了一种能够高效筛选参与指定基因或遗传位点表达调控相关蛋白及其结合位点的高特异性，高灵敏性研究方法。
文档编号G01N33/68GK102839214SQ20121032638
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月6日 优先权日2012年9月6日
发明者许汉鹏 申请人:许汉鹏