专利名称：Dna序列、重组载体、单和双营养缺陷型多形汉逊酵母菌、及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种DNA序列、含有该DNA序列的重组载体、单营养缺陷型多形汉逊酵母菌、尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌及其制备方法。
背景技术：
酵母菌作为一种低等单细胞真核生物，其既具有原核生物生长快、遗传操作简单的优点，又具有高等真核生物的基因表达调控机制和蛋白翻译后修饰机制的优点。目前利用酵母菌作为表达系统已经得到了广泛的应用和认可。酿酒酵母菌作为第一个能够表达真核基因的表达系统，已有大量的蛋白得到成功表达，然而这一表达系统在应用过程中存在着许多不足之处，比如缺乏强有力的启动子、蛋白的过度糖基化、分泌效率差、外源基因的表达水平低、菌株不够稳定等缺点。因此，人们又寻找了第二代酵母菌表达系统-甲醇营养型酵母菌，其能以甲醇作为唯一的碳源和能源，主要包括假丝酵母菌(Candida)、球拟酵母菌(Torulopsis)、汉逊酵母菌(Hanseaula)和毕赤酵母菌(Pichia)四个属。其中多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)被公认为是一种模式生物，其是近20年发展起来的能够高效表达外源基因的真核表达系统，具有如下优势1)多形汉逊酵母菌可以利用强有力的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子，从而高效地启动外源目的基因的表达，同时利用甲醇可严格地调控外源基因的表达；幻过氧化物酶体可作为外源蛋白贮存的场所，使其免受菌体内蛋白酶的降解；幻外源蛋白既可在胞内表达，又可进行分泌型表达，因此表达水平较高；4)发酵工艺比较成熟，易放大力)培养成本低，产物易分离； 6)外源蛋白基因遗传稳定，不易丢失；7)作为真核表达系统，汉逊酵母菌具有真核生物的亚细胞结构，因此具有糖基化、脂酰化、磷酸化等翻译后加工修饰功能。多形汉逊酵母菌是一种优于大肠杆菌和其它酵母菌(如巴斯德毕赤酵母菌和酿酒酵母菌等)的外源基因表达系统，其现已成为当前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统之一，近年来已有大量外源蛋白(包括在其他表达系统中难以高效表达的蛋白)在多形汉逊酵母菌表达系统中成功地得到表达。多形汉逊酵母菌表达系统主要包括两种元件含有特殊筛选标记的宿主菌和能够高效表达外源蛋白的载体系统。汉逊酵母菌作为多种外源基因表达的宿主菌，需要较多不同种类的筛选标记，所述标记主要包括两类一类为营养缺陷型选择标记，如URA3、LEU2、TRP3、HIS4、ADEll、LYS等标志基因，相应的基因发生缺失的宿主菌只能在完全培养基中生长，而不能在缺乏相应营养素的基础培养基中生长， 带有筛选标记的载体DNA与宿主染色体发生整合后，使宿主菌能在选择培养基中生长；另一类为显性选择标记，如抗G418、抗腐草酸素或抗kocin的基因等，这类选择标记虽然使用简单方便，但是其存在(例如)价格昂贵、易产生耐药性及假阳性比例较高等许多明显的缺点。目前获得营养缺陷型汉逊酵母菌的方法大部分都是通过诱变、杂交或者原生脂体融合等传统方法来获得相应的选择标记，然而这些方法存在着许多突出的缺点，比如遗传稳定性较低、存在多重突变效应、突变位点不明确、难以获得较为理想的转化子等。
发明内容
本发明的目的是要提供一种尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌。本发明的目的还在于提供该双营养缺陷型多形汉逊酵母菌的制备方法。本发明的目的还在于提供用于制备该双营养缺陷型多形汉逊酵母菌的DNA序列和重组载体。本发明的目的还在于提供用于制备该双营养缺陷型多形汉逊酵母菌的单营养缺陷型多形汉逊酵母菌。为了实现本发明的目的，本发明提供一种双营养缺陷型酵母菌，所述酵母菌为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)，该多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(URA3)和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)都被阻断。在本发明中，可以从多形汉逊酵母菌开始进行上述URA3基因和LEU2基因的灭活。 本发明中使用的多形汉逊酵母菌可以从多种途径获得，例如其可以为多形汉逊酵母菌ATCC 沈012。此处仅仅是示例性描述，并不代表本发明中使用的多形汉逊酵母菌受限于此途径获得。上述URA3基因和LEU2基因的灭活可以通过基因的突变、缺失等手段来实现灭活该基因或该基因编码的蛋白质。在本发明中，优选地，上述URA3基因的灭活通过将所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的DNA序列中的第35位由A突变为G来实现；上述LEU2基因的灭活通过将LEU2基因从第603位到第1912位共1310个碱基发生了大片段的核苷酸缺失来实现。本发明还提供一种双营养缺陷型酵母菌的制备方法，该方法包括下列步骤1)将具有如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6中一者所示的核苷酸序列的DNA序列转化到多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)中，以使所转入DNA序列与酵母菌的相应同源序列进行同源重组，从而形成单营养缺陷型多形汉逊酵母菌；以及2)将具有如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6中另一者所示的核苷酸序列的DNA序列转化到所述单营养缺陷型多形汉逊酵母菌中，以使所转入DNA序列与酵母菌的相应同源序列进行同源重组，从而形成双营养缺陷型酵母菌。在本文中，可以先转化如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列、再转化如SEQ ID NO 6 所示的核苷酸序列，也可以先转化如SEQ IDNO :6所示的核苷酸序列、再转化如SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列。例如，在先转化如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列、再转化如SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列的情况下，本发明提供一种单营养缺陷型酵母菌(尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌)，所述酵母菌为多形汉逊酵母菌，该多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断，优选地，所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的DNA序列中第35位由A突变为G。所述单营养缺陷型酵母菌的制备方法如下将具有如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列的DNA序列转化到多形汉逊酵母菌中，以使所转入DNA序列与酵母菌的相应同源序列进行同源重组，从而形成尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌。下面将对本发明的双营养缺陷型酵母菌的制备进行详细地描述。
在本文中，术语“分离”或“分离的”是指用来描述将目标物质(例如，DNA序列) 从其天然环境中分离，使得所述目标物质处于不同于化合物天然所存在的环境中。一方面，本发明提供一种分离的DNA序列，其具有如SEQ IDNO :5所示的核苷酸序列；以及一种重组载体，其含有具有如SEQ IDNO :6所示的核苷酸序列的DNA序列。在本发明中，所述重组载体(pl8T-KURA3)是载体(例如pMD18T载体)中插入了突变后的URA3基因而获得的，该重组载体可以使多形汉逊酵母菌中的URA3基因灭活。另一方面，本发明提供一种分离的DNA序列，其具有如SEQID NO :6所示的核苷酸序列；以及一种重组载体，其含有具有如SEQID NO :6所示的核苷酸序列的DNA序列。在本发明中，所述重组载体(pl8T_KLEU》可以在载体(例如pMD18T载体)上按照一定顺序插入LEU2基因的一段上游基因片段和一段下游基因片段来获得。例如， P18T-KLEU2上游同源整合区为如下A)的DNA片段，其下游同源整合区为如下B)的DNA片段A)大小为至少500bp的DNA片段，该DNA片段选自LEU2基因自起始密码子开始的一段DNA序列；B)大小为至少500bp的DNA片段，该DNA片段选自LEU2基因的终止密码子终止以前的一段DNA序列。优选地，pl8T-KLEU2上游同源整合区为如下C)的DNA片段，其下游同源整合区为如下D)的DNA片段C) SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的第98-602位脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；D) SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列的第19134464位脱氧核糖核苷酸组成的DNA 分子。本发明所提供的双营养缺陷型多形汉逊酵母菌，在基因工程疫苗的研发过程中具有重要作用，其可以作为制备两种或两种以上外源蛋白的宿主菌。所述外源蛋白可以为HPV 16型Ll和58型L2蛋白、EV71 Pl和3⑶蛋白、以及HBV S抗原与preS抗原等，它们都可以在本发明所述的双营养缺陷型多形汉逊酵母菌中自行组装成VLP (病毒样颗粒)。表达的外源蛋白可进行一定的翻译后修饰，如糖基化、脂酰化、磷酸化等，这大大提高了表达蛋白的活性，促进其折叠成最天然的结构。相对于常规的多形汉逊酵母菌，本发明所述的双营养缺陷型多形汉逊酵母菌具有下列优点1)菌种来源方便，适于后续的研究和生产；2)所述双缺陷型汉逊酵母菌仅在URA3和LEU2基因处发生了突变，突变位点明确， 突变机制清楚，染色体其他部位未发生改变，因此并未改变汉逊酵母菌的其他代谢通路，保证了基因工程疫苗研发过程中的安全性；3)所述双营养缺陷型汉逊酵母菌的遗传稳定性高，回复突变率低，生物量高，用于表达外源蛋白的基因遗传稳定，不易丢失；4)在所述双营养缺陷型汉逊酵母菌株内可以进行两种或两种以上的蛋白共表达， 尤其适用于研发多组分的VLP疫苗；5)所述双缺陷型汉逊酵母菌可以和构建的尿嘧啶单营养缺陷型汉逊酵母菌配合使用，为基因工程表达多种蛋白带来很多新思路，方便各种不同蛋白表达的需要；6)可以利用强诱导型的启动子(如甲醇氧化酶(MOX)启动子、甲醛脱氢酶(FMD) 启动子等)进行高效地启动外源蛋白的表达；7)对于所述双缺陷型汉逊酵母菌能以甲醇或甘油作为唯一的碳源和能源；8)利用所述双缺陷型汉逊酵母菌表达的蛋白贮存在过氧化酶体内，可使其免受菌体内蛋白酶的降解；9)外源蛋白的表达量比在酿酒酵母菌中表达的情况下高很多倍，且无过度糖基化；同时，能利用廉价的培养基进行高密度发酵，生长速率快，发酵时间短，降低成本。
图1为尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母基因工程宿主菌的构建示意图。图2为尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母基因工程宿主菌的构建示意图。图3为营养缺陷型多形汉逊酵母菌的互补试验结果，其中，A 多形汉逊酵母菌ATCC 26012的对照互补试验；B 尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌互补URA3基因的互补试验；C 尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌互补LEU2基因的互补试验；D 尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌互补URA3和LEU2基因的互补试验；和E 尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌互补URA3基因的互补试验；I =YPD 液体培养基；II =SM-Ura-Leu 培养基；III =SM-Ura 培养基；IV =SM-Leu 培养基；和V :MD培养基。图4为尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌PCR鉴定的电泳结果图，其中，Lane 1 分子量标准:DL_2000DNA Marker (单位bp)，自上而下分别为:2000、 1000、750、500、250、100 ；Lane 2 分子量标准λ-Hind III消化片段(单位bp)，自上而下分别为 23130、9416、6557、4361、2322、2027、564、125 ；Lane 3 尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌PCR鉴定结果；Lane 4 多形汉逊酵母菌ATCC ^012PCR对照。图5为营养缺陷型多形汉逊酵母菌的遗传稳定性结果图，其中A:多形汉逊酵母菌ATCC 26012对照；B 尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌；和C 尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌；I =YPD 液体培养基；II =SM-Ura-Leu 培养基；III =SM-Leu 培养基；IV =SM-Ura 培养基；和V :MD培养基。图6为利用PCR方法筛选人乳头瘤病毒16型Ll结构蛋白在尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌中表达的阳性株，其中，Lane I-Lane 5、Lane 9—Lane 16、Lane 18—Lane 25 :人乳头瘤病毒 16 型 Ll 结构蛋白基因PCR反应产物；
Lane 6 为以酵母菌重组载体作为模板进行的PCR反应扩增作为阳性对照；Lane 7:阴性对照；Lane 8、Lane 17 分子量标准DL-2000DNA Marker。图7为Western-Blot方法鉴定在营养缺陷型多形汉逊酵母菌中表达的人乳头瘤病毒16型Ll结构蛋白；Lane 1 分子量标准(单位kDa)，自上而下为:225、150、102、76、52、38、31、24、 17,12,8.5,3. 5 ；Lane 2 尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌中表达的人乳头瘤病毒16型Ll结构蛋白。图8为尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌PCR鉴定电泳结果图，其中，Lane 1 以重组质粒pl8T_KLEU2作为模板的扩增产物作为对照；Lane 2 以尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌总DNA作为模板的扩增产物；Lane 3 分子量标准DL_2000DNA Marker ；Lane 4 分子量标准λ -Hind III消化片段；Lane 5 以多形汉逊酵母菌ATCC 26012的总DNA作为模板的扩增产物作为对照。图9为各种类型的多形汉逊酵母菌的生长曲线图，1 多形汉逊酵母菌ATCC 26012生长曲线；2 尿嘧啶单营养缺陷型多形汉逊酵母菌生长曲线；3 尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型多形汉逊酵母菌生长曲线。图10为酵母表达载体。图11为外源蛋白表达盒。图12为Western-Blot方法鉴定在双营养缺陷型多形汉逊酵母菌中表达的人乳头瘤病毒16型Ll结构蛋白和58型L2结构蛋白。图13为VLP电镜检测结果。
具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。下述实施方案中的百分比均为质量体积百分比。下述实施方案中所用的PCR反应试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、pMDIST载体购自TAKARA公司。下述实施方案中所用的5-氟乳清酸、制霉菌素购自SIGMA公司。下述实施方案中所用的培养基的配置如下完全培养基(YPD液体培养基)酵母提取物(1%)、胰化蛋白胨0%)、D-葡萄糖 0%)，用水配制；无氨基酸基础培养基(MD液体培养基)无氨基酸酵母氮源(YNB(1.34%))、生物素)、D-葡萄糖)，用水配制；
补充尿嘧啶的基础培养基(SM-Ura液体培养基)MD培养基、尿嘧啶(105mg/l)；补充亮氨酸的基础培养基(SM-Leu培养基)MD培养基、亮氨酸(110mg/l)；补充尿嘧啶和亮氨酸的基础培养基(SM-Ura-Ieu培养基)=SMIra培养基、亮氨酸 (110mg/l)；补充5-氟乳清酸的含尿嘧啶的基础培养基(SM-Ura_5F0A培养基)SM_Ura培养基、5-F0A(lg/l)；补充尿嘧啶和亮氨酸的限制性基础培养基(LM-Ura-Leu培养基)SM_Ura培养基、 亮氨酸(55mg/ml)；固体培养基为以上相应的液体培养基内加入1. 5%琼脂，其中LM-Ura-Leu固体培养基中加入1.2%琼脂。以上培养基经高温高压消毒灭菌(0. 12MPa, 115°C，20分钟)后，4°C保存备用。下述实施方案中所用的试剂配方如下50mM 的磷酸钾缓冲液(pH7. 5) =K2PHO4 · 3H20 (42mM)、KH2PO4 (8mM)。STM 水溶液蔗糖(270mM)、pH 7. 5 的 Tris · HCl (100ml)、CaCl2 (ImM)。以上溶液经0. 22 μ m滤器过滤除菌，4°C保存备用。实施例1灭活URA3基因的重组质粒pl8T_KURA3的构建如图1所示，重组质粒pl8T-KURA3的构建过程如下。根据已报道(GenBank)的多形汉逊酵母菌的URA3的核苷酸序列设计引物见表1。表 1
引物名称序列(5’-3’)扩增片段(bp)URA3-FCCGCTCGAGCACAGACTTAGATTGG (Xho /)UR A3-BGGAATTCTTAAGGATTCCCGGGTAATAACTG(A///7)1003UR A3-MFGTAGTGTTGAAGAAACATGURA3-MBATATCGGTATATATACCAATC 提取多形汉逊酵母菌ATCC 26012的总DNA作为模板，以URA3-F和URA3-B为引物， 按照如下PCR反应体系来扩增URA3基因序列模板 DNA2μ 1URA3-F1 μ 1URA3-B1 μ 1dNTP5μ 110*PCR ExTaq buffer5μ 1ExTaq 酶1 μ 1去离子水35 μ 1_总体积50 μ 1 其中，在PCR仪上进行PCR反应的反应条件如下
94°C，5 分钟；然后进行 94 V，40 秒、54°C，40 秒、72°C，1 分钟循环 30 次；72 °C，10分钟。将以上PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并凝胶回收1. Okb的PCR产物， 然后用T4DNA连接酶(购自TAKARA公司)将回收的PCR产物与pMD18T载体连接，从而形成pl8T-URA3质粒。按照下列过程将重组质粒P18T-URA3的第35位碱基进行定点突变，使得A突变为G，并最终构建成P18T-KURA3重组载体以pl8T-URA3质粒为模板，以URA3_MF(导入变异位点)和URA3-MB为引物，进行如下PCR反应
0115]模板P18T-URA3质粒2μ 10116]URA3-F1 μ 10117]URA3-B1 μ 10118]dNTP4μ 10119]10*PCR Pyrobest 缓冲液 II5 μ 10120]Pyrobest DNA 聚合酶1 μ 10121]去离子水36 μ 1 _总体积50 μ 1其中，在PCR仪上进行PCR反应的反应条件如下94°C，5 分钟；然后进行 94 V，30 秒、55 °C，30 秒、72°C，5 分钟循环 30 次；72 °C，10分钟。将以上PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并凝胶回收3. 81Λ的PCR产物，将PCR反应产物进行Blunting kination反应，具体反应体系和条件如下PCR 反应产物10 μ 110*Blunting kination 缓冲液2μ 1Blunting kination Enzyme Mix1 μ 1去离子水7μ1_总体积20 μ 1Blunting kination反应条件在37°C反应10分钟，然后在70°C反应10分钟。取 5 μ 1 的 Blunting kination 反应液，加入 5 μ 1 的 LigationSolution I，混合于 16°C条件下连接1小时后转化至大肠杆菌DH 5α中，挑取阳性克隆并送至TaKaRa公司进行序列的测定，重组质粒P18T-URA3的第35位碱基进行发生突变的质粒为pl8T_KURA3质粒。实施例2含灭活LEU2基因的重组质粒pl8T_KLEU2的构建如图2所示，重组质粒P18T-KLEU2的构建过程如下。根据已报道(GenBank)的多形汉逊酵母菌的LEU2的核苷酸序列设计引物，见表2。表权利要求
1.一种双营养缺陷型酵母菌，其特征在于，所述酵母菌为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)，该多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和β -异丙基苹果酸脱氢酶基因都被阻断。
2.根据权利要求1所述的双营养缺陷型酵母菌，其特征在于，所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的DNA序列中第35位由A突变为G。
3.根据权利要求1所述的双营养缺陷型酵母菌，其特征在于，所述异丙基苹果酸脱氢酶基因的DNA序列中第603位到第1912位核苷酸缺失。
4.一种双营养缺陷型酵母菌的制备方法，该方法包括下列步骤1)将具有如SEQID NO 5和SEQ ID NO 6中一者所示的核苷酸序列的DNA序列转化到多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)中，以使所转入DNA序列与酵母菌的相应同源序列进行同源重组，从而形成单营养缺陷型多形汉逊酵母菌；以及2)将具有如SEQID NO :5和SEQ ID NO :6中另一者所示的核苷酸序列的DNA序列转化到所述单营养缺陷型多形汉逊酵母菌中，以使所转入DNA序列与酵母菌的相应同源序列进行同源重组，从而形成双营养缺陷型酵母菌。
5.一种分离的DNA序列，其特征在于，具有如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列。
6.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求5所述的DNA序列。
7.一种单营养缺陷型酵母菌，其特征在于，所述酵母菌为多形汉逊酵母菌，该多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断。
8.根据权利要求7所述的单营养缺陷型酵母菌，其特征在于，所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的DNA序列中第35位由A突变为G。
9.一种分离的DNA序列，其特征在于，具有如SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列。
10.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求9所述的DNA序列。
全文摘要
本发明涉及一种双营养缺陷型酵母菌，所述酵母菌为多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)，该多形汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因都被阻断。本发明还涉及该双营养缺陷型酵母菌的制备方法。此外，本发明还提供用于制备该双营养缺陷型酵母菌的DNA序列和重组载体。本发明所述的双营养缺陷型酵母菌具有回复突变率低、遗传稳定性高、生物量高等优点，并且可在基因工程疫苗生产中发挥重要作用，如HPV16型的L1和58L2蛋白可在该酵母菌内进行高效地双表达。
文档编号C12R1/78GK102234620SQ20101015785
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者于洁, 卫江波, 张学峰, 张靖, 李启明, 梁宇, 沈心亮, 陈实, 靳玉琴, 马智静 申请人:北京生物制品研究所