专利名称：靶向沉默MyoⅩ的序列制备及其载体的构建的制作方法
靶向沉默Myo X的序列制备及其载体的构建技术领域
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性沉默靶标蛋Myo X 的序列设计合成及其表达载体构建。
技术背景肌球蛋白X (Myosin X，Myo X)是1994年于牛蛙的内耳中首次发现的，属于非传统型肌球蛋白家族，是细胞内重要的分子马达，在神经系统发育中调节神经突起的生长。Myo X分子由头部、颈部和尾部三部分组成。头部区是马达结构域，具有磷酸水解酶活性；颈部区具有三个IQ结构域，是Myo X与类钙调蛋白(CLP)相互作用的部位；尾部区包括一个能使两分子Myo X形成二聚体的铰链结构域、三个能切割钙蛋白酶的PEST结构域、三个能与 PIP3结合的PH结构域、一个能与微管结合的MyTH4和一个能结合β整合素(β-integrin) 的FERM结构域。
自发现以来，Myo X被广泛的研究，近年来的研究表明，Myo X参与丝足的形成、 延伸和稳定，对丝足内物质的运输起着非常重要的作用，在乳腺癌的发生发展过程中，Myo X的高表达预示着肿瘤具有强的转移潜能，所以特异性的沉默Myo X至关重要。发明内容
本发明的目的是合成特定的能够靶向沉默Myo X的特异碱基序列，为更加深入的研究Myo X以及Myo X在选择、制备治疗肿瘤药物中的作用提供了有效的手段。
本发明中所需要构建的主要是Myo X的沉默表达载体。核心沉默表达载体构建分为两个大的步骤，首先是根据人源的Myo X序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pEN-h-siRNA载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定。鉴定正确后，用pEN-h-siRNA-Myo X和pDSL_hpGIP进行LR重组反应，这两个载体重组后形成核心的沉默表达载体，转化，挑取阳性克隆鉴定，阳性克隆酶切鉴定测序正确，进行沉默效率的检测。
本发明中设计合成了能够靶向人源Myo X的19bp的目的片段，片段序列为 cctcctagcc cttatcaat能够特异性沉默Myo X的表达载体的构建包括以下步骤第一步，序列设计根据人源Myo X基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别Myo X的序列。
第二步，表达载体pEN_hHl-Myo X的构建将表达载体pEN_hHl双酶切后，利用回收试剂盒回收线性化载体。经连接、转化、 提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。
第三步，LR重组构建Myo X -shRNA质粒抽提试剂盒抽提pDSL_hpUGIP和pEN_hHl_Myo X质粒,经重组、转化、提取等步骤获得重组的载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。
第四步，沉默靶蛋白效率的检测经转染细胞后提取蛋白，利用western blot等试验手段检测沉默效率。
图I为特异性沉默靶蛋白My0 X的序列的合成凝胶电泳图；图2为pEN_hHl表达载体BamH I和Xhol双酶切电泳图；图3为pEN_hHl表达载体BamH I和Xhol双酶切回收电泳图；图4为LR重组构建Myo X -shRNA测序结果；图5为利用RT-PCR检测，转入Myo X-shRNA后Myo X表达量明显降低，GAPDH为内参； 图6为图5结果的统计图，对5次独立实验结果分析，沉默效率为51. 5%，进行t检验 p〈0. 01差异极显著；图7为Western blot免疫印迹分析，转入Myo X siRNA沉默载体后Myo X表达量降低 70%ο
本发明中设计合成的19bp的目的片段，能够特异性的沉默Myo X，同时也为构建Myo X-shRNA提供关键的序列片段。Myo X是一种非传统的肌球蛋白，经研究表明，Myo X在肿瘤的形成和转移过程中发挥一定的作用，构建成功的载体，能够用来特异性的沉默Myo X，沉默Myo X能够降低肿瘤的转移潜能，所以能够为选择、制备治疗肿瘤药物提供了理论基础。
具体实施例方式实施例一特异性沉默祀标蛋白Myo X的表达载体构建I、特异性沉默靶蛋白Myo X的序列设计(I)根据人源Myo X基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计，设计的原则19bp的特异性结合Myo X的序列的GC含量为45%_55%，退火温度45°C _65°C，同时避免起始端有两个以上的A，尾端不能有两个以上的T。将选取的片段进行BLAST人基因组比对，选择特异性序列。
(2)以 BamH I - N19-TT_loop- N’ 19-Xhol 形式合成一段 60bp 序列，N’ 19 为 N19的反向互补，5’端为BamH I酶切位点，3’端为Xhol酶切位点。设计合成的片段分别靶向 Myo X 的 cDNA 序列 1971- 1989 (Myo XshRNA I)和 3299 -3317 (Myo XshRNA 2)， Scramble shRNA 非特异靶向片段为 GTGAGATCGTAGTGCGTGA。
2、特异性沉默靶蛋白Myo X的序列的合成与储存图I(I)将合成的两段olig溶解至50 μΜ，各取ΙΟΟμΙ混合。
(2)95 °C变性5min，快速转移至70 1水浴锅中，孵育lOmin，关闭水浴锅电源，过夜。
(3)次日取出混匀，放在冰上备用，或者-20 °C长期保存。
3、表达载体pEN_hHl_Myo X的构建(I)取Mg pEN_hHl载体，BamH I和Xhol双酶切，电泳，回收线性pEN_hHl大片段图 2图3。
(2)连接和转化。将线性pEN_hHl浓度稀释至160ng/>，连接反应(NEB公司的T4 DNA连接酶)权利要求
1.能够靶向沉默MyoX的特异碱基序列，其特征是其序列为cctcctagcc cttatcaat。
2.按照权利要求I所述的能够靶向沉默MyoX的特异碱基序列在选择、制备治疗肿瘤药物中的作用。
全文摘要
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域,具体涉及特异性沉默靶标蛋MyoⅩ的序列设计合成、表达载体构建及其应用。本发明通过根据人源的MyoⅩ序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pEN-h-siRNA载体上，连接转化，挑取鉴定，重组反应等形成核心的沉默表达载体，能够特异性的沉默MyoⅩ，同时也为构建MyoⅩ-shRNA提供关键的序列片段，从而为选择、制备治疗肿瘤药物提供了基础。
文档编号C12N15/113GK102925443SQ20121043024
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者朱筱娟, 曹让娟, 陈晶滢, 卿旭, 翟艳华, 俞华莉 申请人:东北师范大学