专利名称：一种捕获分泌序列的载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种捕获分泌 序列的载体及其构建方法和应用。 冊粉
蛋白质为所有生命体系赖以存在的基本支撑之一。在各种细胞蛋白中， 分泌型蛋白(包括细胞膜导向性蛋白和周质腔蛋白)为一重要类别。这些 蛋白通常在其一级结构中含有能够被细胞分泌因子识别的信号，例如经典
的I型分泌蛋白，尤其是经由Sec途径而分泌的蛋白，通常在其N端含有 一个由20 - 35个氨基酸组成的信号肽，该信号肽对于其所率引的蛋白的成 功跨膜运输以及功能性构像的形成具有决定性作用。基于其独特的结构与 作用特点，在原核生物中分泌型蛋白通常具有重要生物学功能，例如对环 境信号的感知与传导，与宿主细胞相互作用，群体密度感应等，这些独特 功能使得分泌型蛋白在病原微生物疾病防治中常作为药物和疫苗靶点，因 而分泌蛋白的系统性筛选对于研究细菌的生命机制、致病机理、病害防治 等具有重要意义。
琼胶酶是一种天然糖苷水解酶，多由海洋微生物产生，其作用底物为 琼胶，能够裂解琼胶中的1，3 p-D-或1,4 oc-L-galacto-pyranose连接。 虽然近年来各种新型产琼胶酶菌株不断被发现，琼胶酶基因及蛋白的研究 也曰渐深入，然而真正成功应用于工业或科研领域的琼胶酶却极少。目前 琼胶酶的实际性应用主要限于从琼胶包埋剂中回收DNA或其它分子，其潜 在性应用包括用于制备琼胶衍生寡聚糖等，但将琼胶酶基因作为一种分子 生物学工具进行应用的研究尚未见报道。
琼胶酶agaV为保守性I类分泌蛋白，具有典型的Sec-translocon依
赖型分泌蛋白结构特征以及高效的胞间质折叠能力，并且其胞外活性检测 简单直接，然而，迄今为止国际上尚未有利用琼胶酶基因捕获分泌信号的 报道。
发明内容
本发明目的在于一种简单高效的捕获分泌蛋白基因序列的载体及其构 建方法和应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为载体为具有序列表SEQ ID No:2中碱基序列，含有去信号序列的琼胶酶基因agaK，外源基因插入位点 以及篩选标记。 构建方法1 )设计质粒pBK:
a. 以质粒pACYC177为模板，用分别含有BamHI位点和HincII位点的卡 那霉素基因引物，PCR扩增卡那霉素基因，PCR产物纯化后用限制性内切 酶BamHI和Hindi双酶切；
其中PCR条件为94°C60s预变性模板DNA，然后94°C 40s， 45°C 60s, 72。C 60s， 5个循环后改为94°C 40s, 58°C 60s， 72°C 60s, 25个循环后再 在72°C延伸反应lOmin;
b. 将质粒pBR322用BamHI和Seal酶切，电泳回收3471 bp DNA片段， 将该片段与a步骤中得到酶切处理过的PCR产物连接，连接液转化大肠杆 菌DH5oc,在含有卡那霉素LB培养基中过夜培养，筛选出抗卡那霉素的转 化子，从转化子中提取重组质粒，即为PBK;
2) 设计质粒pUALS:
a.将agaV的操纵子克隆到质粒pUC19,构成重组质粒pBUAl,而后以 质粒pBUAl为模板，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物，进行PCR 扩增，得到去信号序列的agaV的PCR产物，将PCR产物纯化，而后与载体 PBS - T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5 cx ，在含有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG的LB固体培养基上培养筛选白色转化子；
其中PCR条件:94。C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s， 46。C 60s, 72。C 60s, 5个循环后改为94。C 40s， 59。C 60s， 72。C 60s, 25个循环后再 在72°C延伸反应lOmin;
b.从挑取的白色转化子中提取重组质粒，即为PUALS;
3) 设计分泌序列捕获载体
a. 将步骤l)中得到的质粒pBK用限制性内切酶BamHI和BsaBI酶切， 得到3. 2kbDM片段;将步骤2 )中的质粒pUALS用限制性内切酶BamHI和 Smal双酶切，得到1. 3kb DM片段，将其与前3. 2kb DNA片段相连接，连 接液转化入大肠杆菌DH5oc后在含有Kn的LB固体培养基上筛选抗卡那霉 素的转化子；
b. 从抗卡那霉素的转化子中提取重组质粒，即为分泌序列捕获载体PBU。 所述步骤1 ) a中的引物为KnF2 5' - ATGGATCCACGGTTGATGAGAGC -3，，
KnR3 5， - GCCGTCGACCAATTAACCAATTC -3，。
所述步骤2 ) a中的引物为UAF5 5， -ATGGATCCGAAGACTGGCGAGAAATC-3， UAR3 5， -CACTCGAGTTGTATAAATTTCAATCGC- 3，。
所述步骤2)得到去信号序列的agaV的PCR产物纯化后，与载体pBS -T于室温连接2-4小时。
所述载体可捕获原核生物中分泌蛋白基因。 本发明具有如下优点
l.适用范围广。本发明可用于原核生物信号序列的筛选，尤其是基因 组序列尚未知的微生物。
2. 功能多样性。本发明不仅可以从未知基因组中筛选分泌蛋白基因，
而且还可以对假定(putative)分泌信号的验证、启动子以及SD (Shine Dalgarno)序列的功能检测、人工强力信号肽的大规模筛选等。
3. 简单高效性。本发明操作简单，只需常规的连接、转化以及颜色筛 选；所捕获的基因无假阳性，100%具有典型的分泌蛋白基因特征。
图1为本发明构建捕获分泌蛋白基因序列载体的流程图。
图2本发明筛选出的代表性S. f/iiae(G26)蛋白信号肽预测图。
图3本发明筛选出的代表性K. iiarveja' ( T4 )蛋白信号肽预测图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明 进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
本发明是利用aga^结构基因作为报告基因，与质粒pBR322衍生质粒 构建成一种分泌信号捕获载体；在该捕获载体中，外源DNA可以经由一个 BamHI位点而插入到aga7基因的上游；由于缺失信号序列以及启动子，该 捕获载体中的agaK基因无法表达，但是如果插入的外源DNA片段中含有一 个在编码区断裂(truncated)的功能基因，并且该断裂基因的5'编码区 与agaK基因连接形成in-frame融合，那么aga7基因便可以融合基因的方 式表达；如果插入的断裂基因含有分泌信号序列，并且该信号序列能够为 大肠杆菌的分泌系统所识别，同时融合的异源肽为agaV所容忍，不影响其 关键结构域的形成以及功能活性，那么表达后的agaV则可以融合蛋白的形 式被运输至胞外并具有与野生型类似的、可检测到的活性。所插入的断裂 基因序列可经由对aga7上游区测序获知，随后运用染色体步移、分子杂交 等方法即可很容易地克隆得到完整的分泌基因。由于Sec分泌系统的保守 性以及I类膜导向蛋白在原核生物中的广泛存在性，该捕获载体可以应用 于所有原核生物(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)分泌信号的筛选， 由此获得的分泌蛋白可以用于多种目的。
在本发明实施例中所涉及到的实验方法均采用如下方法
1. 质粒提取、PCR产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA 提取皆使用美国Omega Bio-Tek公司的相应试剂盒(Plasmid Mini Kit I, Cycle-pure Kit , Gel Extraction Kit, Bacterial DNA Kit)
2. 质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 ) ，
3. 所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"， 北京。
实施例1
分泌信号捕获载体pBU的构建过程(参见图l)
步骤l)载体pBK的构建。
a. 以质粒pACYC177 (来自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京)为模 板，用下列引物PCR卡那霉素(Kn )基因KnF2 (5 '-ATGGATCCACGGTTGATGAGAGC -3，，划线碱基为BamHI位点)，KnR3 (5，— GCCGTCGACCAATTAACCAATTC -3，， 划线碱基为HincII位点)，PCR条件为 94。C 60s预变性模板腿,然后94。C 40s， 45"C 60s, 72。C 60s, 5个循环 后改为94"C40s， 58"C60s, 72"C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应10min。 PCR产物用Omega Cycle-pure试剂盒纯化后用限制性内切酶BamHI和 HincII双酶切，然后用用Omega Cycle - pure试剂盒纯化。
b. 将质粒pBR322 (购自于"上海生工生物工程技术服务有限公司"，上海) 用BamHI和Seal酶切，电泳回收3471 bp DNA片段，将该片段与前 BamHI/HincII酶切处理过的PCR产物连接，连接液用Hanahan方法转化大 肠杆菌DH5cc，在含Kn ( 50ug/ml )的Luria-Bertani (LB)培养基平板上筛 选转化子，用Omega Plasmid Mini Kit提取转化子的质粒，即为质粒pBK， 该质粒经限制性内切酶BamHI和Smal酶切后于0. 8%琼脂糖凝胶中电泳，电
泳结果表明酶切产物为两条带， 一条大小约为ssobp,另一条为牧b,说明
该质粒为正确重组质粒。
所述LB组成成分按重量百分比计1. 0%蛋白胨，0. 5%酵母粉，1.0%
氯化钠。
步骤2)载体pUALS的构建。
a.将鳗弧菌中的琼胶酶agaV的操纵子克隆到质粒pUC19 (巿购)，构 成重组质粒pBUAl,而后以质粒pBUAl为模板，用引物UAF5(5，-ATGGATCCGAAGACTGGCGAGAAATC -3，，划线碱基为BamHI位点)和UAR3(5' -CACTCGAGTTGTATAAATTTCAATCGC-3，, 划线碱基为Xhol位点)进行PCR扩 增，得到去信号序列的agaV的PCR产物。PCR产物用Omega Cycle-pure 试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T ("天根生化科技有限公司"，北京) 于室温连接2小时，连接混合液用Hanahan方法转化大肠杆菌DHScx后在含 有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG的LB固体培养基上培 养18小时，筛选出白色转化子。
PCR条件94°C 60s预变性模板DNA，然后94。C40s， 46。C 60s, 72°C 60s， 5个循环后改为94。C 40s, 59°C 60s, 72('C 60s， 25个循环后再在72flC延伸 反应lOmin。
其中琼胶酶agaV序列表如下
atgaaatcca taattaaaac tctgacattg ctaccaatat ttttaactag cacgaegtta atggctgaag actggegaga犯tccccatt ccagcaccgt tagaagatgg gcagagctgg gagttacaag aggcatactc cgattcgttt aattataegg gtaagggega ctctttccgt agtaagtgga atgataccta etttcaeggt tggacaggac ctggtttaac ctattggcaa agtgatgagt catgggtaga tgatggcaac ttgataatca gtgcctctcg tegtcaggga acagagatgg tgaatgcggg cgttgtgacg tctaagacaa aggtgaaata tcctattttt
ctagaggcca atataaaggt gagtggctta gagctatcat caaatttttg gcttcttagt gaaaatgatc aacgagaaat cgatgtattg gaagtgtatg gtggcgctga agacgaatgg tttgccaaaa atatgtcaac aaacttccat gta臓cc gcaatgaaga caactcaatt cgtagcgatt tcaacgatca gacccacaat gagccgcaat ggggtactta ttggcgtgat gggttccatc gctttgcggt atattggaaa agcccaactg aagtgacttt ttatatcaat ggcatagaga caccgaaagg ttcttgggaa gacgtcgtaa tgaaagataa agattacacg ggagccatcc tagataaatc aacctacaac atggatcaag agatgttcat tattattgat actgaagacc attcgtggcg ttctgaggct ggaataatcg caaaagatga agacctagct gatgatagta agaacaaaat gtatgtggat tggatacgtg tttataagcc agttggcgga gatgacaatg gtaatgtgac cgtaccgtca gggtatacaa acacacaatt tgtgcatagt gacttgtgtt tggatgtcaa agatggagcg acttggaacg gcagtactta tcagcaatgg gtgtgtaata cgggcaacct gaaccaacga tttgggtttg aagaagtcgc gacgggagag tatttaatta aatccaaacg tagtcagctg tgcttagagc tcaagcccgg tagtaatcaa tggcaggacg gtgcgatcat tcagcaatat gtgtgtaatt cagctgaaga gaatcaacgt tggacgctat ttgataaagg cagccagacg tttgagattc gaagcaaggc aacaggtaag
tgtttagagc ttgctgacaa tcagggaagc aacggcggga cagtgcagca atggtcatgt gatggtggta ataaccagcg attgaaattt atacaataa
b.釆用Omega Plasmid Mini Kit提取白色转化子中质粒，即为质粒 pUALS，该质粒用限制性内切酶BamHI/XhoI双酶切后于0. 8%琼脂糖凝胶中 电泳，电泳结果表明酶切产物为两条带， 一条大小约为1.3kb (agaV插入 片段)，另一条为3kb (pBS-T载体)，说明该质粒为正确重组质粒。
步骤3 )分泌序列捕获载体pBU的构建。 将步骤1 )的质粒pBK用限制性内切酶BamHI和BsaBI酶切，在0. 8%琼脂 糖凝胶中电泳，回收3.2kbDNA片段；将步骤2 )的质粒pUALS用限制性内 切酶BamHI和Smal酶切，在0. 8%琼脂糖凝胶中电泳，回收1. 3kb DNA片段， 将其与3. 2kb pBK/BamHI/BsaBI片段连接，连接液用Hanahan方法转化入 大肠杆菌DH5oc后在含有Kn (50ug/ml)的LB固体培养基上筛选转化子。挑 取2个转化子，用Omega Plasmid Mini Kit提取质粒，即为质粒pBU (参 见序列表2)，该质粒用限制性内切酶BamHI/XhoI双酶切后于Q. 8%琼脂糖 凝胶中电泳，电泳结果表明酶切产物为两条带， 一条大小约为1.3kb,另一 条为3. 2kb，说明该质粒为正确重组质粒，pBU全长4577 bp,为双链DNA, pBU特点(主要元件)agaV: l- 1302,KrT: 4577 - 3480, Origin: 2773 -2185。
实施例2
采用捕获载体pBU从革兰氏阳性菌海豚链球菌(Stre^ococcus iniae) (G26)中筛选分泌序列和分泌蛋白基因。在5ml TSAYE培养基(其成分为 peptone 1. 7%， polyp印tone 0.3%, yeast extract 0. 6%，NaCl 1. 5%， K2HP04 0.327%, glucose 0. 25%，agar 1.5%)中过夜培养^iae菌株G26,用 Omega Bacterial DNA试剂盒提取基因组DNA，将5ug基因组DNA用限制性 内切酶Sau3AI部分酶切后在0. 8%的琼脂凝胶中电泳，用Omega Gel Extraction试剂盒回收4 - 6kb DNA片段，将4Q0ng回收的DNA与200ng BamHI线性化并经小牛碱性磷酸酶(CIP)处理过的质粒pBU连接，连接混 合液用Hanahan方法转化大肠杆菌DH5a后在含Kn ( 50ug/m"的LB琼脂
培养基上筛选转化子。从转化平板上随机挑取6个周边培养基凹陷的转化 子，将挑取的转化子在含Kn(50ug/ml)的LB培养基中过夜培养，用Omega PlasmidMini Kit试剂盒提取质粒并对其所含插入DNA片段用引物UAR6( 5， -CTCATCACTTTGCCAATAGG-3，)进行测序。测序结果经生物信息学分析后发 现所有6个重组质粒中都含有一个具信号肽序列的断裂功能基因如下，其 中信号肽通常由约15 — 35个氨基酸所组成，位于分泌蛋白的N端或C端， 其组成氨基酸多为疏水性和非极性氨基酸，但其N端附近的几个氨基酸通 常为碱性氨基酸，括号内划线氨基酸为信号肽特征性强碱性氨基酸。
BUG1
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(MGRKKRKRSYOLKKTSSKGFKLTVLSFVLLTLLVSVWSLKKA) RQ YNFFGVKGDYKGKSAVLPTLEDDGQGNLYTVDAKFRSYGKMINSFKD YRLYYFD
捕获的断裂功能基因其编码产物皆为分泌型蛋白如下其中该序列中 大写部分为分泌信号序列
G26
BUG1:
tttccagttgccgttgtcaatcaagataagggtgctagcttagataataaatccatcaacgtcggaaatgagatggtggacacactgtcaaaaaataaggactt
gga加catttcgtttctgaaaaaacagctcaagaaaaacttgatgctgggaaatactatatgattatcactttcccagataatttttcaagtaaagttgcctctgtg
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BUG2:
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通过检测可得本发明构建的载体捕获的分泌序列皆为编码分泌型蛋白
的序列(参见图2)。 实施例3
采用捕获载体PBU从革兰氏阴性菌哈氏弧菌7. /Mireyi (T4)在5ml TSAYE培养基(其成分为peptone 1. 7%， polypeptone 0. 3%，yeast extract0. 6%,NaCl 1.5%,K2HP04 0.327%, glucose 0. 25%, agar 1.5%)中过夜培养 K /Mireyf菌株T4，用Omega Bacterial DNA试剂盒提取基因组DNA, ^ 5ug基因组DNA用限制性内切酶Sau3AI部分酶切后在0. 8%的琼脂凝胶中 电泳，用Omega Gel Extraction试剂盒回收4 - 6kb DNA片段，将飾g 回收的DNA与200ng BamHI线性化并经小牛碱性磷酸酶(CIP)处理过的质 粒pBU连接，连接混合液用Hanahan方法转化大肠杆菌DH5oc后在含Kn (50ug/ml )的LB琼脂培养基上筛选转化子。从转化平板上随机挑取7个 周边培养基凹陷的转化子，将挑取的转化子在含Kn (50ug/ml)的LB培养 基中过夜培养，用Omega Plasmid Mini Kit试剂盒提取质粒并对其所含插 入DNA片段用引物UAR6 (5， -CTCATCACTTTGCCAATAGG-3，)进行测序。测序 结果经生物信息学分析后发现所有7个重组质粒中都含有一个具信号肽序 列的断裂功能基因如下，其中信号肽通常由约15 —35个氨基酸所组成， 位于分泌蛋白的N端或C端，其组成氨基酸多为疏水性和非极性氨基酸， 但其N端附近的几个氨基酸通常为碱性氨基酸，括号内划线氨基酸为信号 肽特征性强碱性氨基酸。
BUSl
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捕获的断裂功能基因其编码产物皆为分泌型蛋白如下其中该序列中大 写部分为分泌信号序列中筛选分泌序列和分泌蛋白基因。 T4
BUSl:
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通过检测可得本发明构建的载体捕获的分泌序列皆为编码分泌型蛋白 的序列(参见图3)。
实施例2和实施例3结果表明pBU可以作为一种广谱性(general )筛 选工具，快速、高效地从革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中筛选功能性分泌序 列以及分泌蛋白基因。
本发明实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明 进行限制。
(1) SEQ ID No:2的信息(参见序列表)
(a) 序列特征
*长度4577碱基对 *类型核酸 *链型双链 *拓扑结构环状
(b) 分子类型DNA
(c) 假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源人工合成
序列表
SEQUENCE LISTING <110〉中H科学院海洋研究所
<120〉 一种捕获分泌序列的载体及其构建方法和应ffl
<130>
〈160〉 2
<170> Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211〉 1359
<212> 隱
〈213> Vibrio sp.
〈220〉
〈221> gene
<222> (1).. (1359)
〈223>
〈400〉 1 atgaaatccata_atta.a_a.actctgacattgctaccaatatttttaact 3gcacgacgtta60
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〈211〉 4577
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t.tcgagagtagttggCd457权利要求
1.一种捕获分泌序列的载体，其特征在于具有序列表SEQ ID No2中碱基序列，含有去信号序列的琼胶酶基因agaV，外源基因插入位点以及筛选标记。
2. —种按权利要求1所述的分泌序列捕获载体的构建方法，其特征在于 1)设计质粒pBK:a. 以质粒pACYC177为模板，用分别含有BamHI位点和HincII位点的卡 那霉素基因引物，PCR扩增卡那霉素基因，PCR产物纯化后用限制性内切 酶BamHI和HincII双酶切；其中PCR条件为:94。C60s预变性模板DNA，然后94°C 40s， 45。C 60s, 72"C 60s, 5个循环后改为94nC 40s， 58°C 60s, 72°C 60s, 25个循环后再 在72°C延伸反应10min;b. 将质粒pBR322用BamHI和Seal酶切，电泳回收3471 bp DNA片段， 将该片段与a步骤中得到酶切处理过的PCR产物连接，连接液转化大肠杆 菌DH5cc,在含有卡那霉素LB培养基中过夜培养，筛选出抗卡那霉素的转 化子，从转化子中提取重组质粒，即为PBK;2 )设计质粒p面:a.将agaV的操纵子克隆到质粒pUC19,构成重组质粒pBUAl，而后以 质粒pBUAl为模板，用分别含有BamHI位点和Xhol位点的引物，进行PCR 扩增，得到去信号序列的agaV的PCR产物，将PCR产物纯化，而后与载体 pBS - T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5 a ，在含有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG的LB固体培养基上培养筛选白色转化子；其中PCR条件94°C 60s预变性模板DNA,然后94"C 40s， 46°C 60s， 72°C 60s, 5个循环后改为94°C 40s, 59°C 60s， 72°C 60s， 25个循环后再 在72"C延伸反应lOmin;b.从挑取的白色转化子中提取重组质粒，即为pUALS; 3)设计分泌序列捕获载体a. 将步骤1 )中得到的质粒pBK用限制性内切酶BamHI和BsaBI酶切， 得到3. 2kbDNA片段；将步骤2)中的质粒pUALS用限制性内切酶BamHI和 Smal双酶切，得到1. 3kb DNA片段，将其与前3. 2kb DNA片段相连接，连 接液转化入大肠杆菌DH5cx后在含有Kn的LB固体培养基上條选抗卡那霉 素的转化子；b. 从抗卡那霉素的转化子中提取重组质粒，即为分泌序列捕获载体pBU。
3. 按权利要求2所述的分泌序列捕获载体及其构建方法，其特征在于: 所述步骤1 )a中的引物为KnF2 5， - ATGGATCCACGGTTGATGAGAGC -3， , KnR3 5， — GCCGTCGACCAATTAACCAATTC —3'。
4. 按权利要求2所述的分泌序列捕获载体及其构建方法，其特征在于 所述步骤2 )a中的引物为UAF5 5， -ATGGATCCGAAGACTGGCGAGAAATC-3， UAR3 5， -CACTCGAGTTGTATAAATTTCAATCGC-3'。
5. 按权利要求2所述的分泌序列捕获载体及其构建方法，其特征在于 所述步骤2)得到去信号序列的agav的PCR产物纯化后，与载体pBS - T 于室温连接2-4小时。
6. —种按权利要求l所述的分泌序列捕获载体的应用，其特征在于所 述载体可捕获原核生物中分泌蛋白基因。
全文摘要
本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种捕获分泌序列的载体及其构建方法和应用。该捕获载体含有去信号序列的琼胶酶基因agaV，外源基因插入位点以及筛选标记。利用成熟琼胶酶基因agaV作为报告子，可以迅速、高效地从革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中筛选出功能性信号序列以及分泌蛋白基因，本发明不仅可以从未知基因组中筛选分泌蛋白基因，而且还可以对假定分泌信号的验证、启动子以及SD序列的功能检测、人工强力信号肽的大规模筛选等。本发明操作简单，只需常规的连接、转化以及颜色筛选；所捕获的基因无假阳性，100％具有典型的分泌蛋白基因特征。从而为病原微生物疾病防治提供候选疫苗抗原和药物靶点。
文档编号C12N15/65GK101191133SQ20061013444
公开日2008年6月4日 申请日期2006年12月1日 优先权日2006年12月1日
发明者黎 孙, 张卫卫 申请人:中国科学院海洋研究所