专利名称：一种陶珠为载体的固定化微生物颗粒制备方法
技术领域：
本发明涉及污染水体中底泥的修复技术，具体地说是一种陶珠为载体 的固定化微生物颗粒制备方法。
背景技术：
常规环境修复技术主要指化学修复法、物理修复法、生态修复法和 生物修复法(Bioremediation)，后两者常被归为统一的技术，工程上一般采 取原位方式。
污染水体中底泥的特殊性质增加了物理法、化学法修复的困难性。生 物修复是利用植物、动物及微生物对污染物进行富集、吸收降解等，修复 过程可自然、原位地进行。本技术所述的生物修复主要指微生物修复。
2005年11月13曰吉林双苯厂苯胺车间发生爆炸，引发大量硝基苯泄 漏。双苯厂的含硝基苯废水流入松花江，导致江水和底泥污染。松花江硝 基苯污染事故的发生为我们提出了环境中硝基苯治理这一亟待解决的问 题。
硝基苯(Nitrobenzene)是一种致癌物，排在USA EPA 1976年公布的优先 污染物(129种)名单中的第56位。硝基苯的别名为密斑油 (Nitrobenzole;Essence of mirbane; Oil of mirbane), 为无色或浅黄色油状液
体。见光后颜色变深。有苦杏仁味。有吸湿性。能随水蒸气挥发。易溶于 乙醇、苯、乙醚和油类。溶于500份水。
硝基苯在水体和底泥中具有较高的稳定性。其密度-1.205,密度〉水， 进入水体的硝基苯会沉入水底，使底泥遭受污染。硝基苯在水中有一定的 溶解度，随时间延长又会造成水体污染。进入水中的硝基苯， 一般以黄绿 色油状物沉在水底。当浓度为5mg/L时，被污染水体呈黄色，有苦杏仁味。 当浓度达100mg/L时，水几乎是黑色，并分离出黑色沉淀。当浓度超过33mg/L 时可造成鱼类及水生生物死亡。
有的化工厂应用降解性微生物来处理废水中的硝基苯类污染物，并且 已经取得了一定效果。但是在处理过程还发现一些问题，因为投加的降解 菌对环境适应性有限，在新环境中微生物往往发生变异，除不能有效维持 降解菌的生物量外，还可改变活性，降低对目标污染物的降解能力，从而 影响污染物的降解，不能达到去除污染物的目的。为了解决这一难题，人 们开始研究微生物固定化修复技术IMR ( Immobilized Microbe Remediation )。固定化技术，是指利用化学或物理的方法，将游离的细胞(微 生物)或酶，定位于限定的空间区域内，并使其长时间保持活性的一种技 术。 微生物固定化技术的关键是筛选适宜的载体材料和确定优化的固定化 工艺。利用IMR技术修复污染水体已有一些成功的例子，但修复沉积物还
未见报道。松花江一般可看作静止或缓流水体，而底泥基本处于兼性厌氧 状态。因此需用兼性厌氧微生物，另外载体材料的比重必须〉1，才能使底 泥达到生物修复的条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种沉积效果好、应用广泛的陶珠为载体的固定 化微生物颗粒制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是
用陶珠为载体将对数生长期的微生物固定，即为将15-25ml的菌液和 30-40g的陶珠混合加入到含有硝基苯类溶液的培养基中，在兼性厌氧条件 下、恒温培养4-6天，取出40-50ml菌悬液，而后补充相同体积的含有硝 基苯类溶液的培养基，在兼性厌氧条件下、恒温培养2-3天即为增殖一次， 共增殖2-3次，得到固定有微生物的陶珠颗粒。
所述含有硝基苯类溶液的培养基中硝基苯类污染物的浓度为25-35 mg/L。
所述对数生长期的微生物为施氏假单胞菌(i^"^/omo"w他fem')、粪 产碱菌(j/ea//gewes^beca//51 )、 巨大芽孢杆菌(5ac/〃ws weg"fer/w附)和阴沟 肠杆菌(￡"tera6"c/wc/o"a^)其按体积份数比计1: 1: 1: 1，在含有硝基 苯类溶液的培养基中恒温培养4-6天得到的微生物。
所述陶珠为粒度在O. 06-0. 12 cm3，用水洗涤3-5次，浸泡过夜后风 干的陶珠。所述培养基为葡萄糖0.05-0.2%、蛋白胨0.02-0.06 %、酵 母膏0. 03—0, 06 % 、 NaCl 0, 3-0. 6%、 K2HP040. 4-0, 5%、 KH2P04 0. 1-0. 4 % 、 MgS04 . 7H20 0. 02-0. 06 % 、 pH7. 2 ~ 7. 5
原理用于修复污染底泥以无机载体陶珠作为载体材料，采用吸附固 定方法。对选择的高效降解硝基苯的混合微生物进行固定化，制备混合菌 颗粒；将制备的固定化生物产品对硝基苯和苯胺污染的底泥进行修复。
本发明可修复污染底泥中的硝基苯、苯胺类污染物及密度>水的有机 污染物。
本发明具有如下优点
1. 本发明选择陶珠为载体，陶珠平均比重为1.81g/cm3,体积在 0.06-0.12 cm3范围较合适，其孔隙度适合微生物的吸附固定，可对完整的 微生物细胞进行固定，避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性； 增殖速度快、效果好。
2. 本发明选择的微生物为兼性厌氧混合菌，固定化后的微生物能长期 保持活性；固定化细胞颗粒的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物 质对徽生物体的恶性竟争、吞噬和毒害，使其在复杂环境条件下稳定地发 挥高效能。 3. 陶珠为载体的固定化细胞颗粒对于静止或缓流污染水体中的底泥， 可根据污染程度直接投加，搡作简单，无需改变自然环境和修筑大规模构 筑物，不产生二次污染。
4. 陶珠来源丰富，价格便宜。节省投资，简化流程，实践上安全可靠，
经济上费用低廉，工程投资仅为物理法、化学法修复的30-50%。
5. 本发明采用生物修复主要指微生物修复，具体为无机载体陶珠吸附
固定微生物，对混合菌吸附速度快、增殖效果好。将其制备的固定化
细胞颗粒投放到硝基苯类污染水体-底泥环境中，可使底泥中硝基苯和
苯胺得到有效去除，当底泥中硝基苯、苯胺初始浓度为4.41 mg/kg、
37.84mg/kg时，硝基苯的降解率可达100%,苯胺降解率为66%。 附目说B月
图1为本发明陶珠固定化微生物颗粒降解底泥中硝基苯的处理图。 图2为本发明陶珠固定化微生物颗粒降解底泥中苯胺的处理图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。 实施例1
陶珠固定微生物的方法，具体步骤为先制备种子液，同时处理无机 载体陶珠；然后混合菌株在陶珠中进行吸附固定增殖。具体步骤如下
(1) 种子液的制备
在兼性厌氧条件下，将160ml富集培养基加入到250ml厌氧瓶中，灭 菌，冷却后加入18 ml种液，放入28。C的培养箱中恒温静止培养一周，使 其微生物处于对数生长期，备用。
所述厌氧瓶为医用输液瓶；培养基按重量百分比计为葡萄糖0.1%、 蛋白胨0.05 % 、酵母膏0.05 % 、 NaCl 0.5%、 K2HPO40.5%、 KH2P04 0.3 % 、 MgS04'7H20 0.05 % 、 pH7.2。灭菌条件为O.lMpa湿热灭菌30分钟。所述 种液为含有1. 5ml浓度为3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厌氧混合微生物，兼 性厌氧混合微生物包括施氏假单胞菌(i^e^omo"^ )、粪产碱菌
(>eca/& )、巨大芽孢杆菌(Sac/〃"s wegafeWww )和阴沟肠杆菌 (五wtera^cbc/o。cae),(上述菌种均可通过巿购得到)，其体积份数比为1: 1: 1: 1 ，加入的硝基苯溶液使其浓度达到26. 73mg/L。
(2) 载体的预处理
陶珠(购自辽宁省锦州大业陶粒厂，粒度在0. 08cm3)用自来水洗涤3 次，并用自来水浸泡过夜，次日捞出使其自然风干，然后称陶珠30g加入 到100ml具塞的广口瓶中，瓶口用8层纱布包好，放入灭菌锅中灭菌，备 用。灭菌条件为O.lMpa湿热灭菌30分钟。
(3) 混合菌株在陶珠无机载体中的固定
将上述装有30g陶珠的100ml广口瓶中分别加入45ml富集培养基、
0. 45ml硝基苯溶液(硝基苯的浓度为3mg/ml)和20ml种子液，在兼性厌 氧条件下、28X:恒温培养箱内静止培养。所述富集培养基与种子液制备所
用的培养基相同，所述种子液为上述已制备好的兼性厌氧混合菌液。
(4) 固定化细胞的增殖
从上述装有陶珠载体的广口瓶中倒出40ral残余菌体悬浮液，然后加入 同样体积的新鲜培养基及0. 4ml硝基苯溶液，使硝基苯的浓度为26. 73mg/L。 在兼性厌氧条件下、28'C恒温培养箱内培养约3天即为增殖一次，共增殖 三次，分别增殖69 h 、 51 h和4 8h;所述培养基与种子液制备所用的培 养基相同。完成每次增殖时瓶中增殖液呈现浑浊，有气体逸出，苦杏仁味 消失并产生臭味，此时需更换新鲜的培养基即为一次增殖。用上述方法制 得的固定化陶珠-混合菌，空隙合适、表面积大、吸附性好，为混合菌提供 了更多的吸附固定点，提高了固定化效率，使单位质量细胞数量多、密度 大，经过三批增殖后固定化陶珠颗粒吸附固定的微生物细胞数可达到 1.4xl017cfU/g。
(5) 对底泥的修复效果
实验采用3L的广口玻璃瓶，泥水重量份数比为1: 4，所述泥为吉林石 化二苯厂污水排放明渠中的底泥，水为自来水。其处理目标为泥水混合物， 即600g泥，2400g水，共3. OL.投加NaH2P041.5gK2HPO43.0g、MgSO4.7H2O 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后将重量百分比为5 /。固定化陶珠颗粒投入到 上述污染水体和底泥环境中。处理前首先测定底泥中硝基苯的初始浓度为 4.41 mg/kg干泥。而后在兼性厌氧条件，室温(13°C-23°C)静止放置。固 定化陶珠颗粒对底泥中硝基苯的处理效果参见图1。从图l看出经过5天处 理，底泥中硝基苯污染物的浓度从4.41 mg/kg (干泥)降低到1.07mg/kg， 降解率为75.70%。 7天后测定底泥中硝基苯的含量，为未检出，全部被降 解，说明固定化陶珠颗粒对底泥中硝基苯污染物修复效果是另人满意的。 实施例2
与实施例l不同之处在于
(1) 种子液的制备
在兼性厌氧条件下，将180ml富集培养基加入到250ml厌氧瓶中，灭 菌，冷却后加入16 ml种液，放入28。C的培养箱中恒温静止培养一周，使 其微生物处于对数生长期，备用。
所述培养基按重量百分比计为葡萄糖0.2%、蛋白胨0.06%、酵母 膏0.06%、 NaC10.6%、 K2HPO40.5%、 KH2PO40.3%、 MgS04.7H20 0.05 % 、 pH7.2。灭菌，灭菌条件为0. IMpa湿热灭菌30分钟。所述种液为含有2ml 浓度为3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厌氧混合微生物，硝基苯的浓度为 30. 30mg/L。
(2) 载体的预处理
陶珠(购自辽宁省锦州大业陶粒厂，粒度在0.1cm3)用自来水洗涤3次，并用自来水浸泡过夜，次曰捞出使其自然风干，然后称陶珠40g加入
到100ml具塞的广口瓶中，瓶口用8层纱布包好，放入灭菌锅中灭菌，备 用。灭菌条件为.'0. 1Mpa湿热灭菌30分钟。
(3) 混合菌株在陶珠无机载体中的固定
将上述装有40g陶珠的100ml广口瓶中分别加入40ml富集培养基、 0. 40ml硝基苯溶液(硝基苯的浓度为3mg/ml)和20ml种子液，在兼性厌 氧条件下、28'C恒温培养箱内静止培养。
(4) 固定化细胞的增殖
从上述装有陶珠载体的广口瓶中倒出50ml残余菌体悬浮液，然后加入 同样体积的新鲜增殖培养基及0.5ml硝基苯溶液，使硝基苯的浓度为 30.30mg/L。在兼性厌氧条件下、28匸恒温培养箱内培养约2天即为增殖一 次，共增殖三次，分别增殖48hh 、 50 h和60h;所述培养基与种子液制 备所用的培养基相同。完成每次增殖时瓶中增殖液呈现浑浊，有气体逸出， 苦杏仁味消失并产生臭味，此时需更换新鲜的培养基即为一次增殖。用上 述方法制得的固定化陶珠-混合菌，空隙合适、表面积大、吸附性好，为混 合菌提供了更多的吸附固定点，提高了固定化效率，使单位质量细胞数量 多、密度大，经过三批增殖后固定化陶珠颗粒吸附固定的微生物细胞数可 达到1.6xlO"dWg。
(5) 固定化陶珠颗粒使用方法及对底泥的修复效果
实验釆用3L的广口玻璃瓶，泥水重量份数比为l: 2,所述泥为吉林石 化二苯厂污水排放明渠中的底泥，水为自来水。其处理目标为泥水混合物， 1000 g泥，2000 g水，共3. OL.投加NaH2PO4l.5gK2HPO43.0g、MgSO4.7H20 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后将重量百分比为5%固定化陶珠颗粒投入到 上述污染水体和底泥环境中。处理前首先测定底泥中苯胺的初始浓度分别 为37.84 mg/kg干泥。而后在兼性厌氧条件，室温(13°C-23°C )静止放置。 固定化微生物陶珠颗粒对底泥中苯胺的处理效果参见图2。苯胺较难处理， 处理结果见图2，可以看出处理5天后，降解率仅为30.92%。经过2个月 的处理，底泥中苯胺污染物的浓度从37.84mg/kg降低到12.85mg/kg,降解 率为66%。结果说明固定化陶珠颗粒能够抵抗底泥中的不同毒物，在不良环 境中仍能发挥多种菌的协同作用，使底泥中污染物含量不断降低，能够逐 渐达到彻底去除的目标，固定化陶珠颗粒修复底泥中苯胺污染物也是可行 的。
上述详细说明针对本发明的实施例的具体说明，该实施例并非用以限 制本发明的专利范围。
权利要求
1.一种陶珠为载体的固定化微生物颗粒制备方法，其特征在于用陶珠为载体将对数生长期的微生物固定，即为将15-25ml的菌液和30-40g的陶珠混合加入到含有硝基苯类溶液的培养基中，在兼性厌氧条件下、恒温培养4-6天，取出40-50ml菌悬液，而后补充相同体积的含有硝基苯的培养基，在兼性厌氧条件下、恒温培养2-3天即为增殖一次，共增殖2-3次，得到固定有微生物的陶珠颗粒。
2. 按权利要求l所述的陶珠为载体的固定化微生物颗粒制备方法，其 特征在于所述含有硝基苯类溶液的培养基中硝基苯类污染物的浓度为 25-35 mg/L。
3. 按权利要求1所述的陶珠为载体的固定化微生物颗粒制备方法，其 特征在于对数生长期的微生物为施氏假单胞菌、粪产碱菌、巨大芽孢杆 菌和阴沟肠杆菌其按体积份数比计1: 1: 1: 1，在含有硝基苯类污染物的 培养基中恒温培养4-6天得到的微生物。
4. 按权利要求1所述的陶珠为载体的固定化微生物颗粒制备方法， 其特征在于陶珠为用水洗涤3-5次，浸泡过夜后风干的。
全文摘要
本发明涉及污染水体中底泥的修复技术，具体地说是一种陶珠为载体的固定化微生物颗粒制备方法。具体为将制备好的种子液接种到处理过的陶珠载体，并在兼性厌氧条件下、恒温培养4-6天条件下进行吸附、培养和增殖2-3次，得到固定有微生物的陶珠颗粒。本发明具体采用无机载体陶珠吸附固定微生物，对混合菌吸附速度快、增殖效果好，操作简单，无需改变自然环境和修筑大规模构筑物，不产生二次污染。将其制备的固定化细胞颗粒投放到硝基苯类污染水体-底泥环境中，可使底泥中硝基苯和苯胺得到有效去除，当底泥中硝基苯、苯胺初始浓度为4.41mg/kg、37.84mg/kg时，硝基苯的降解率可达100％，苯胺降解率为66％。本发明的陶珠来源丰富，价格便宜。
文档编号C12N11/14GK101168737SQ200610134068
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月27日 优先权日2006年10月27日
发明者张春桂, 张海荣, 李培军, 许华夏, 鞠京丽 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所