多重固相核酸扩增测定的制作方法

专利名称：多重固相核酸扩增测定的制作方法
技术领域：
本发明属于核酸检测领域。
背景技术：
采用与具有5′核酸酶活性的酶联合使用的液相双标记的寡核苷酸探针检测核酸序列的扩增是本领域公知的(参见，例如，美国专利Nos.5,210,015；5,487,972；5,804,375；和Holland，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1988)887276-80)。在本发明之前，还没有在核酸扩增反应中使用携带可以由5′-核酸酶活性释放的标记物部分的固定的双标记的寡核苷酸探针，或者还没有将其用于核酸扩增反应的实时监测。
仍然需要用于同时检测多个核酸序列的扩增的更有效和更方便的方法。本发明满足了该需要和其它需要。

发明内容
一方面，本发明提供了检测靶核酸的方法，该方法包括以下步骤a)提供通过3’末端固定在固体基质上的寡核苷酸探针，该探针包含标记物部分；b)在探针的存在下在含有具有5′-3′核酸酶活性的酶的反应混合物中扩增怀疑含有靶核酸的核酸样品，其中该探针与靶核酸特异性杂交，使得具有5′-3′核酸酶活性的酶从寡核苷酸探针释放标记物部分，并且检测到核酸样品中是否存在靶核酸。
本发明进一步提供了同时检测多个靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤a)提供大量寡核苷酸探针，每个探针通过其3’末端固定在固体基质上，每个探针包含相同的标记物部分；b)在探针的存在下在含有具有5′-3′核酸酶活性的酶的反应混合物中扩增怀疑含有靶核酸的多个核酸样品，其中每个探针与多个靶核酸之一特异性杂交，使得具有5′-3′核酸酶活性的酶从寡核苷酸探针释放标记物部分，并且检测到核酸样品中是否存在靶核酸。在该方法中，从空间上区分代表靶核酸的荧光的检测。采用本方法，可以同时检测至少8、10、12、14、15、16、18、20、50、75、100或更多个靶核酸序列。
在一种实施方案中，标记物部分是与探针的5’末端连接的荧光团部分，由此荧光团部分的释放导致固定的探针上荧光的减少，从而检测到核酸样品中靶核酸的存在。
在一种实施方案中，标记物部分是连接于探针的5’末端的猝灭剂部分，并且，固定的探针进一步包含位于猝灭剂部分3’的、连接于探针的荧光团部分，其中当猝灭剂部分连接于探针时，荧光团部分不发出荧光，并且，固定的探针上荧光团部分的荧光随着靶核酸扩增的增加而增加，这是因为猝灭剂部分释放到溶液中。
在一种实施方案中，标记物部分是连接于探针的5’末端的猝灭剂部分，并且，固定在邻近探针的位置的荧光团部分的荧光随着靶核酸扩增的增加而增加。例如，荧光团部分可以固定在固体基质上，或固定在第二核酸(即，第二探针)上，所述第二核酸固定在固体基质上足以接近携带猝灭剂部分的探针的位置，以便掩盖荧光团的荧光。
在一种实施方案中，扩增是通过聚合酶链反应。在一种实施方案中，具有5′-3′核酸酶活性的酶是具有5′-3′核酸酶活性的DNA聚合酶。
固体基质可以是任何能够承受间歇和重复的核酸变性温度(即，80℃-105℃，通常约95℃)，并且保持与固定的探针结合的材料。优选的基质允许同时检测多个核酸序列。在本发明的不同实施方案中，固体基质可以是，例如，多孔板、显微镜载玻片、聚合酶链反应(PCR)管、或平皿。固体基质可以是任何多边形，如圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、六边形等。
在一些实施方案中，扩增检测是定量的。在一些实施方案中，扩增检测与扩增是同时的(即，“实时”)。在一些实施方案中，扩增检测是定量的并且扩增检测是实时的。在一些实施方案中，扩增检测是定性的(如是否存在靶核酸的终末检测)。在一些实施方案中，扩增检测在扩增后进行。在一些实施方案中，扩增检测是定性的，并且扩增检测在扩增后进行。
在一些实施方案中，荧光团部分选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的镧系元素家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料和BODIPY家族染料。
在一些实施方案中，猝灭剂部分选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的镧系元素家族染料、BODIPY家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料、低荧光猝灭剂部分(即，“暗淡的供体”)和非荧光猝灭剂部分(如，称作“暗猝灭剂”，包括Black Hole QuenchersTM(BHQ))。
在一种实施方案中，荧光团部分是荧光素家族染料，猝灭剂部分是花菁家族染料。在一种实施方案中，荧光团部分是荧光素家族染料，猝灭剂部分是六氯荧光素家族染料。在一种实施方案中，荧光团部分是六氯荧光素家族染料，猝灭剂部分是花菁家族染料。在一种实施方案中，猝灭剂是暗猝灭剂，例如，BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3(BiosearchTechnologies，Novato，CA)。在一种实施方案中，荧光团部分是荧光素家族染料或花菁家族染料，猝灭剂部分是暗猝灭剂。
另一方面，本发明提供了包含以下成分的反应混合物i)通过3’末端固定在固体基质上的寡核苷酸探针，该探针包含标记物部分，该标记物部分由具有5′-3′核酸酶活性的酶释放；ii)用于扩增靶核酸的试剂，其中所述探针与靶核酸内的序列杂交。
另一方面，本发明提供了包含以下成分的试剂盒i)通过3’末端固定在固体基质上的寡核苷酸探针，该探针包含标记物部分，该标记物部分由具有5′-3′核酸酶活性的酶释放；ii)用于扩增靶核酸的试剂，其中所述探针与靶核酸杂交。
本发明进一步提供了包含至少一个通过3’末端固定在固体基质上的寡核苷酸探针的固体基质，所述至少一个探针包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶释放的标记物部分。
本发明也涉及用于进行靶核酸扩增的装置，该装置包含至少一个通过3’末端固定在固体基质上的寡核苷酸探针，所述至少一个探针包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶释放的标记物部分。
本发明进一步涉及用于进行靶核酸扩增的装置，该装置包含用于容纳固体基质的空间，所述固体基质包含至少一个通过3’末端固定在固体基质上的寡核苷酸探针，所述至少一个探针包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶释放的标记物部分。
反应混合物、试剂盒和装置的实施方案与方法的实施方案相同。


图1图示了固体基质平皿阵列。(1)阵列组件；(2)流液口；(3)通道；(4)室；(5)体；(6)密封壁；(7)阵列基质；和(8)光学窗。
图2图示了密封壁上的固体基质平皿阵列。
图3图示了组装的固体基质平皿阵列。
具体实施例方式
1.导言如此处所示，用固定的双标记的探针得到扩增生长曲线，几乎不需要或不需要聚合酶链反应(PCR)的修饰。此外，从固定的双标记的探针得到的循环阈值(Ct)的测量值与用液相的双标记的抗体获得的那些相似。由固定的探针进行的靶核酸的捕获速度可以与液相扩增反应的速度竞争。
如下文所示，寡核苷酸探针的固定使得能够同时进行多个核酸扩增反应的实时分析。目前的多重分析需要使用多种染料和猝灭剂的组合，并且通常由单个仪器上可利用的激发和检测系统限制到每个样品约6个同时的反应。采用本发明，通过二维阵列上双标记的寡核苷酸探针的空间分布，可以用单一的染料和猝灭剂组合实现多重测定。因此，每个样品的分析数目受到进行多重扩增反应和设计具有足够选择性的探针的能力的限制。采用本发明，可以在单一反应中同时监测多个同时进行的反应。
2.缩写在本说明书中通篇使用的缩写是指包含特定核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列是常规的一字母缩写。因此，当包含在DNA中时，天然存在的编码核苷酸的脱氧核糖核苷的缩写如下脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)和脱氧胸苷(dT)。核糖核苷的缩写如下腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)和尿苷(U)。核苷酸碱基的缩写如下腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同样，除非特别指出，以一系列一字母缩写表示的核酸序列是以5′-＞3′的方向列出的。
3.定义“扩增反应”是指任何导致模板核酸序列的拷贝数增加或导致表明模板存在的信号增加的反应(如化学、酶促或其它类型的反应)。扩增反应包括，例如，聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)(参见，美国专利4,683,195和4,683,202；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications(Innis et al.，eds，1990))、链置换扩增(SDA)(Walker，et al Nucleic Acids Res.20(7)1691-6(1992)；Walker PCRMethods Appl 3(1)1-6(1993))、转录介导的扩增(Phyffer，et al.，J.Clin.Microbiol.34834-841(1996)；Vuorinen，et al，J.Clin.Microbiol.331856-1859(1995))、基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton，Nature 350(6313)91-2(1991)、滚环扩增(RCA)(Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)75-99(1999))；Hatch et al.，Genet.Anal.15(2)35-40(1999))和Q-Beta复制酶(Lizardi et al.，Bio/Technology 61197(1988))。
本文用到的“用于扩增的试剂”或“扩增试剂”可互换使用，是指本领域技术人员通常在扩增反应的反应容器中包括的试剂。例如，典型的聚合酶链反应中位于引物上游和下游的试剂可以包括，但不限于，至少一个模板、脱氧核糖核苷三磷酸(包括dATP、dCTP、dGTP、TTP、dUTP)、聚合酶、缓冲液、金属阳离子和盐。基于核酸序列的扩增(NASBA)反应可以包括引物、逆转录酶、RNA酶H和DNA聚合酶。转录介导的扩增(TMA)反应可以包括引物、逆转录酶和RNA聚合酶。链置换扩增(SDA)反应可以包括修饰的核苷酸和限制性内切核酸酶。某些扩增反应也可以包括脱氧尿苷N-糖基化酶(UNG)作为辅助的扩增试剂(如Amperase，Roche Molecular Sciences，Alameda，CA)(参见，Kleiboeker，Virol J(2005)1129)。
本文使用的“样品”是指任何含有或推断含有靶核酸的物质。样品可以是天然或合成来源，并且可以通过本领域技术人员公知的任何方法获得。样品可以是分离自一个或多个个体的组织或体液的样品，所述组织或体液包括，但不限于，例如，皮肤、血浆、血清、全血、脑脊液、精子、精液、淋巴液、滑液、尿、泪、血细胞、器官、肿瘤、支气管-肺泡灌洗液，所述样品也指体外细胞培养成分(包括，但不限于细胞培养基中的细胞生长导致的条件培养基、重组细胞和细胞成分)的样品。可以通过本领域公知的任何程序从生物样品获得核酸。
本文使用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指引物、探针、待检测的寡聚物片段、寡聚物对照和未标记的封闭寡聚物，通常指多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)的线性聚合物，以及嘌呤或嘧啶碱基，或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的其它任何N-糖苷类似物。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可含有磷酸二酯键或经过修饰的键，包括，但不限于磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲酯、acetamidate、氨基甲酸酯、硫醚、桥联氨基磷酸酯、桥联亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥联硫代磷酸酯或砜，以及这些键的组合。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括5个生物学存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除了这5个碱基以外的其它碱基。这些碱基可能具有多种用途，例如，使杂交稳定或不稳定；促进或抑制探针降解；或者充当连接可检测部分或猝灭剂部分的连接点。例如，本发明的多核苷酸可含有一个或多个修饰的、非标准或衍生的碱基部分，包括但不限于N6-甲基-腺嘌呤、N6-叔丁基-苄基-腺嘌呤、咪唑、取代的咪唑、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-Dmannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine，2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶(即胸腺嘧啶)、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶。修饰的、非标准或衍生的碱基部分的其它实例可参见被完整引入本文作为参考的美国专利Nos.6,001,611、5,955,589、5,844,106、5,789,562、5,750,343、5,728,525和5,679,785。
此外，核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括一个或多个经过修饰的糖部分，包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
本发明不希望受限于核酸、多核苷酸或寡核苷酸的来源。核酸、多核苷酸或寡核苷酸可来源于人类或非人类的哺乳动物，或其它任意生物体，或者来源于体外合成或通过化学方法合成的任意重组来源。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、杂合体或它们的任意混合物，并可能以双链、单链或部分双链形式存在。核酸还可以是美国专利5,696,248所描述的衍生核酸。本发明的核酸包括纯化或未纯化形式的核酸及其片段，包括诸如微生物，例如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉、真菌、植物、动物、人类等的生物学材料的基因、染色体、质粒，基因组。
术语核酸、多核苷酸和寡核苷酸的长度无特定的差别，且这些术语均可互换使用。这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。本发明的寡核苷酸可以用作引物和/或探针。
本文所用术语“残基”指上文所定义核酸内的核苷酸或碱基。不加限制的话，残基可以是本领域技术人员已知的任意核苷酸，包括上述所有生物学存在的核苷酸和非生物学存在的核苷酸。
术语“引物”指能够在特定条件下，沿模板核酸链充当多核苷酸合成起始点的寡核苷酸，所述特定条件即允许合成与所述模板链互补的引物延伸产物。该引物可从重组来源中获得，形式为纯化的限制片段，或者通过合成方法制备而得。引物延伸条件典型地包括在合适的温度下，在合适的缓冲液(“缓冲液”可以包括本身是辅因子或影响pH、离子强度等的替代物)中含有四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和具有聚合活性的试剂，诸如DNA聚合酶或逆转录酶。该引物优选在扩增中效率最高的单链。本发明的引物可能含有，例如5-500个核苷酸，在某些实施方案中，将含有至少10、20、30、25、30、40、50、75或100个核苷酸和/或含有少于500、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、25或20个的核苷酸。
术语“杂交”指单链核酸或双链核酸的局部单链区域与具有互补序列的另一个单链核酸或双链核酸的局部单链区域的结合。就本领域技术人员所知，两条核酸链并不需要完全互补便可彼此杂交。根据杂交条件，核酸可与其互补序列杂交，即使两条链或其中的一条链中存在较少、若干或许多错配、缺失或添加的情况也可杂交。在某些实施方案中，正如下文所定义的，本发明的引物和探针可以选择性地与至少部分互补的核酸杂交。在某些实施方案中，本发明的引物和探针可在下文定义的严格条件下与至少部分互补的序列杂交。
本文所用术语“严格”或“严格条件”正如本领域所熟知的，指低离子强度和高温度的杂交条件；参见，例如Maniatis等人于1989年出版的第2版分子克隆实验室手册；J.Wiley & Sons publ.，NewYork 1988年出版的Ausubel等人编辑的Current Protocols inMolecular Biology和Tijssen在1993的生物化学和分子生物学方面的技术-与核酸探针的杂交中的“杂交原理综述和核酸试验方案”。通常，所选严格条件比特定序列在定义的离子强度和pH条件下的热解链温度(Tm)低大约5-30℃。可选地，所选严格条件比特定序列在定义的离子强度和pH条件下的热解链温度(Tm)低大约5-15℃。Tm指在与靶互补的探针中，处于平衡状态时有50％的探针与靶序列杂交的温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度条件下)(即当靶序列过量存在时，在Tm条件下，处于平衡状态时50％的探针被占用)。例如，严格杂交条件可以如下，其中在大约pH 7.0到大约pH 8.3的条件下，盐浓度小于大约1.0M钠(或其它盐)离子，典型地为大约0.01到大约1M钠离子浓度，且对短探针(例如具有10-50个核苷酸)而言，温度至少为大约25℃，对长探针(例如具有多于50个的核苷酸)而言，温度至少为大约55℃。严格条件还可通过加入诸如甲酰胺的杂交去稳定剂而得以改变。
本文所用术语“选择性”或“选择性条件”指适用于本发明引物和/或探针的杂交条件，所述条件可实现对样品中的可检测的靶核酸进行的扩增、检测和/或定量，所述样品可能含有其它非靶核酸。
本文所用的核酸序列的“互补序列”指处于反平行结合状态的寡核苷酸，即当其与所述核酸序列进行比对时，一个序列的5’末端可与另一个序列的3’末端配对。核酸序列的互补序列无需与该序列的每一个核苷酸都准确配对；稳定的双链体可能含有错配碱基对或未配对碱基。核酸技术领域的技术人员可根据经验考虑许多变量，包括例如所述寡核苷酸的长度、该寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度、错配碱基对的发生率的影响，确定双链体的稳定性。
核酸双链体的稳定性是通过解链温度或“Tm”而得以确定的。特定核酸双链体在特定条件下的Tm是一半的潜在碱基对解离的温度。
本文所用术语“探针”指可与靶核酸的一个区域形成双链结构的寡核苷酸，而形成双链结构的原因是该探针的至少一个亚序列与靶核酸中的亚序列具有互补性。优选的探针不包括与引物序列互补的序列。如下所述，该探针可以是标记或未标记的。该探针的3’末端可以被“封闭”，以阻止该探针掺入引物延伸产物中。“封闭”可通过利用非互补碱基或通过将诸如生物素或磷酸基团的化学部分加入最后一个核苷酸的3’羟基中而得以实现，根据所选部分的不同，封闭可能具有双重用途，即还充当标记，可用于后续检测或捕获与该标记相连的核酸。封闭还可通过除去上述3’羟基或通过利用无3’羟基的核苷酸，诸如双脱氧核苷酸而得以实现。
“探针的5’末端”是指由具有5’核酸酶活性的酶消化的本发明的固定的探针的部分。
“探针的3’末端”是指在暴露于具有5’核酸酶活性的酶之后保持连接于固体基质的本发明的固定的探针的部分。
术语“标记物部分”是指在暴露于具有5’核酸酶活性的酶时可以从本发明的固定的探针释放的化合物。如下文所述，标记物部分可以是荧光部分或猝灭剂部分。在某些实施方案中，标记物部分可以是非荧光可检测部分，例如，放射性同位素(如3H、32P、125I)、生物素或生物素结合部分(如亲和素、链亲和素、neutravidin等)。
本文可互换使用的术语“荧光部分”或“荧光团部分”是指可在特定条件下发射光的化学部分，该条件即适用于该特定部分的条件。典型地，特定的荧光部分或荧光团部分可在吸收较短波长的光之后发射特定波长的光。由特定荧光部分发射的光的波长是该部分的特征。因此，可在利用较短波长的光激发特定荧光部分之后，通过检测合适波长的光，以检出该荧光部分。可应用于本发明方法和组合物的荧光部分的实例包括，但不限于荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的镧系元素家族染料和BODIPY家族染料。
本文所用术语“猝灭剂部分”指可在特定条件下吸收荧光部分所发射能量的化学部分，所述特定条件即当该猝灭剂部分充分接近荧光部分，例如当该猝灭剂和荧光部分与同一多核苷酸相连时。该现象在本领域通常被称为荧光共振能量转移(“FRET”)。猝灭剂部分可再次发射从荧光部分吸收的能量，形成该猝灭剂部分的特有信号，因此猝灭剂也可以是“荧光部分”。或者，猝灭剂部分可能在加热时或其它非放射性过程中将从荧光部分吸收的能量散失。可应用于本发明方法和组合物的猝灭剂部分的实例包括，但不限于荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的镧系元素家族染料、BODIPY家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料、低荧光猝灭剂部分(即，“暗淡的供体”)和非荧光猝灭剂部分(如，称作“暗猝灭剂，包括Black HoleQuenchersTM(BHQ))。
本文所定义的“5’-3’核酸酶活性”或“5’核酸酶活性”指可以序贯方式将核苷酸从寡核苷酸5’末端除去的酶活性。该5’核酸酶活性优选是5’-3’外切核酸酶活性，但也可以是5’-3’内切核酸酶活性。例如，许多模板特异性核酸聚合酶表现的是通常与某些DNA聚合酶相关的5’-3’外切核酸酶活性，(即大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活性，而大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段则无该活性)。5’-3’外切核酸酶活性还可从底物核酸的5’末端开始裂解多于一个的磷酸二酯键(核苷酸)。虽然无意受限于任何特定的操作理论，对导致探针释放裂解的寡核苷酸片段这一方面而言，与DNA聚合酶相关的5’-3’外切核酸酶活性仍然被认为取决于所述探针的特定核苷酸组成。例如，在所述寡核苷酸与模板核酸二者的核苷酸之间，尤其是出现在所述寡核苷酸5’末端处的匹配或错配数目可影响该活性，正如例如，Holland et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-80所描述的。5’核酸酶反应基于美国专利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015的描述。
与靶核酸进行的探针和引物杂交内容中的术语“邻近”指所述引物相对于所述探针在模板核酸的相同或互补链上的定位。所述引物和探针可能被多于大约150个的核苷酸、多于大约125个的核苷酸、多于大约100个的核苷酸、多于大约80个的核苷酸、多于大约60个的核苷酸、多于大约50个的核苷酸、多于大约40个的核苷酸、多于大约30个的核苷酸、多于大约20个的核苷酸、大约1到大约20个核苷酸、大约1到大约10个核苷酸分隔开，或者可能直接地彼此相邻而不重叠。在某些实施方案中，探针与引物隔开大约1到大约10个核苷酸。通常，探针可能与待扩增序列任意位置，即引物下游的可靶核酸杂交，从而使引物延伸可以确定聚合酶的位置，进而得以断裂该探针。
在“在邻近固定的探针的位置上固定的荧光团部分”的内容中使用的术语“邻近”是指固定的荧光团部分的位置。在邻近固定的探针的位置上固定的荧光团部分与连接于固定的探针的5’末端的猝灭剂部分足够接近，使得荧光被掩盖。在邻近固定的探针的位置上固定的荧光团部分可以通常通过连接部分连接于例如另一核酸或固体基质本身，所述另一核酸连接于固体基质。
术语“热稳定核酸聚合酶”指与例如大肠杆菌来源的核苷酸聚合酶相比，对热相对稳定并可催化核苷三磷酸的聚合作用的酶。通常，这种酶是从被本领域技术人员认为嗜热的生物体中获得。该酶通常会在已退火至引物结合序列的引物的3’末端处开始合成，并将继续向模板的5’末端合成新链。如果该聚合酶具有5’-3’核酸酶活性，它可以水解已退火至模板的间插探针，以释放已标记和未标记的探针片段，直到聚合作用终止或所有探针片段与待检测的核酸解离为止。美国专利4,889,818描述了分离自栖热水生菌(Taq)的代表性热稳定酶，Saiki etal.，1988，Science 239487-91描述了将其应用于常规PCR的方法。另一种代表性的热稳定酶包括栖热菌种Z05 DNA聚合酶。参见例如美国专利5,674,738。
Taq DNA聚合酶具有DNA合成依赖型链置换5’-3’外切核酸酶活性(参见Gelfand在Stockton Press，N.Y.(1989)出版和Erlich编辑的“PCR技术原理及其在DNA扩增方面的应用“第2章中的“TaqDNA聚合酶”)。因此，当探针未与模板DNA结合时，Taq DNA聚合酶不会降解该探针。
为确定两个核酸序列的“互补性百分率”或“同一性百分率”，对这两个序列进行比对，以获得最优比较结果(例如，可将空位导入第一个核酸序列中，用于与第二个核酸序列进行最优比对)。接着比较相应核苷酸位置上的核苷酸。当第一个序列中的一个位置被与第二个序列中相应位置上的核苷酸互补的核苷酸占据时，这两个分子在该位置上是互补的。同样，当第一个序列中的一个位置被与第二个序列中相应位置上的相同核苷酸占据时，则这两个分子在该位置上是一致的。这两个序列的互补性百分率(或同一性百分率)是被比较的总位置数目除这两个序列所共有的互补位置(或一致位置)数目后所获结果的函数(即％互补性＝互补重叠位置数目/较短核苷酸的总位置数目×100％；和％同一性＝一致重叠位置数目/较短核苷酸的总位置数目×100％)。
对两个序列之间的同一性百分率的测定还可利用数学算法实现。被用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin和Altschul于1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.872264-2268公开的算法，以及Karlin和Altschul于1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.905873-5877公开的改良算法。这种算法被合并进Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215403所公开的NBLAST程序中。
如无另外指明，本发明的实践将应用到属于本领域技术范畴的常规分子生物学、微生物学技术和重组DNA技术。这些技术在文献中得到了完整阐释。参见例如Sambrook et al.，2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；和a series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)。
“大量”是指两个或多个。
4.寡核苷酸探针另一方面，本发明提供了包含用于检测靶核酸的可以释放的标记物部分的固定的探针。该探针可以不受限制地是能够用于鉴定本领域技术人员公知的靶核酸的存在的核酸探针。典型地，探针包含与靶核酸的区域杂交的核苷酸序列，所述区域与引物杂交的区域不同。典型地，探针通过其3’末端固定于固体基质。
所述探针的核苷酸序列可具有任意长度，该长度足以特异性结合待检测的靶核酸。在某些实施方案中，所述探针具有至少大约6个核苷酸。在某些实施方案中，所述探针具有少于大约140个的核苷酸。在某些实施方案中，所述探针的长度可以是大约18到大约45个、大约25到大约35个或大约25到大约30个核苷酸。可对该探针的长度和组成进行选择，以提供充分的热动力学稳定性，进而确保该探针与靶核酸在合适反应条件下的杂交，该反应条件则取决于待实施的检测方法。通常设计的探针具有比引物的解链温度(Tm)高的Tm。具有修饰的、非标准或衍生核苷酸的探针可能比具有常规核苷酸的探针长或短，却仍具有类似的热动力学杂交特性。这种非标准碱基的实例可参见美国专利6,320,005、6,174,998、6,001,611和5,990,303。另一个实例是，与具有富含A/T序列且长度相似的探针相比，具有富含G/C序列的探针可能在较高温度下退火至靶序列。
在所述探针的核苷酸序列中，与可检测核酸杂交的部分典型地与该可检测核酸中被所述探针杂交的区域一致或互补。不过，探针的该部分与可检测的靶核酸中被该探针杂交的区域的序列同一性或互补性可小于100％。在本发明的某些实施方案中，所述探针中与可检测的靶核酸杂交的部分的核苷酸序列可以与可检测的靶核酸中被该探针杂交的区域具有大约99％、大约98％、大约97％、大约96％、大约95％、大约90％、大约85％或大约80％的互补性或同一性。本发明的固定的探针特别适于基因型分析、单核苷酸多态性和其它碱基对错配分析。采用固定的、标记的探针，使得能够进行与常规线性阵列相比高度灵敏的单碱基区分，这是因为错配碱基对和内部标记物部分的累积的去稳定作用。
本发明的核酸探针可额外包括并非来源于靶核酸并且/或者不与靶核酸杂交的其它核酸序列。本领域的技术人员可对这些额外核酸序列进行选择，使所述探针具有预期的功能性。例如，所述核酸探针可包括能使检测方法改进的额外序列。可包括额外核酸序列或可通过其它方法被调整用于本发明探针、方法和试剂盒的探针实例可参见美国专利6,323,337、6,248,526、6,150,097、6,117,635、6,090,552、5,866,336和5,723,591。
除了上述探针核苷酸序列，所述探针还可包括不抑制本发明方法的额外核苷酸序列或其它部分。在本发明的简便实施方案中，所述探针可包括有助于实施本发明方法的额外核苷酸序列。所述探针内可存在特定部分，以使该探针或探针片段与所述核苷酸序列的杂交稳定或不稳定。例如，寡聚T接头可以用于促进杂交。本发明的探针还可包括上文定义的修饰的、非标准或衍生的核苷酸。
可以通过本领域技术人员公知的任何方法制备本发明的核酸探针，不受任何限制。具体地，上文所述的制备本发明的核酸引物的方法也可以用于制备本发明的核酸探针。
可通过多种技术使一个或多个标记物部分与探针直接或间接相连。在一些实施方案中，标记物部分位于探针的5’末端(即，探针的被具有5’核酸酶活性的酶消化的末端)、位于探针的核苷酸序列内部、或连接于多种大小的间隔臂或组合物，以促进信号相互作用。典型地，标记物部分是通过非核苷接头连接，而不是连接于核苷碱基。利用通过商业渠道获得的亚磷酰胺试剂，可借助于经过适当保护的亚磷酰胺制备在任一末端具有官能团(例如硫醇或伯胺)的寡核苷酸，并可采用例如PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，ed.byInnis et al.，Academic Press，Inc.，1990中描述的方法使其连接标记物部分。
美国专利4,914,210描述了导入寡核苷酸官能化试剂的方法，可将一个或多个巯基、氨基或羟基部分导入所述寡核苷酸探针序列中，典型地导入在该序列的5’末端。使包括荧光部分在内的标记物部分猝灭剂部分或非荧光可检测部分与探针相连的其它方法可参见美国专利5,118,802。当然，将标记物部分连接或缀合于探针的方法依赖于使用的标记物部分的类型和标记物部分在探针上的位置。
在某些实施方案中，一个或多个标记物部分可与探针的5’末端相连。在另一些实施方案中，一个或多个标记物部分可在探针的5’末端内，例如，距探针5’末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大约35或大约40个残基内的残基位置上与探针相连。在某些实施方案中，一个或多个标记物部分可与探针的3’末端相连。在另一些实施方案中，所述一个或多个标记物可在探针的5’末端内，例如，距探针3’末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大约35或大约40个残基内的残基位置上与探针相连。该一个或多个标记物部分可与探针残基的任意部分相连。例如，一个或多个标记物部分可与探针中核苷酸的糖、磷酸或碱基部分相连。在另一些实施方案中，所述一个或多个标记物部分可连接在探针的两个残基之间。
在本发明的某些实施方案中，可以用一个以上的标记物部分标记探针。在某些所述实施方案中，可以分别将每个标记物部分与探针的不同碱基连接。在其它实施方案中，可以将一个以上的标记物部分与探针的相同碱基连接。
在某些实施方案中，固定的探针包含荧光部分。不受限制地，荧光部分可以是本领域技术人员已知的任意荧光部分。通常优选具有宽斯托克斯频移的荧光部分，从而可以应用具有滤波器的荧光计，而不是单比色计，并提高检测效率。在某些实施方案中，所述荧光部分可选自荧光素家族染料(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)、多卤荧光素家族染料(ABI，Foster City，CA)、六氯荧光素家族染料(ABI，Foster City，CA)、香豆素家族染料(Tnvitrogen-MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)、罗丹明家族染料(GE Healthcare)、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的镧系元素家族染料和BODIPY家族染料(Molecular Probes，Inc.)。在一种实施方案中，所述荧光部分为6-羧基荧光素(FAMTM)。可应用于本发明探针、方法和试剂盒的其它荧光部分实例可参见美国专利6,406,297、6,221,604、5,994,063、5,808,044、5,880,287、5,556,959和5,135,717。用于本发明的荧光部分可以购自例如Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR。
在某些实施方案中，固定的探针包含猝灭剂部分。猝灭剂部分可选自荧光素家族染料、多卤荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的镧系元素家族染料、BODIPY家族染料、低荧光猝灭剂部分和非荧光猝灭剂部分。在某些实施方案中，非荧光猝灭剂部分可以是BHQTM家族染料(包括WO01/86001所述的猝灭剂、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3)(BioSearchTechnologies，Novato，CA)、Iowa BlackTM或Dabcyl(Integrated DNATechnologies，Inc.)。其它特异性猝灭剂部分的实例包括但不限于，例如TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明)(Invitrogen-Molecular Probes，Inc.)、DABCYL(4-(4’-二甲基氨苯基偶氮)苯甲酸)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Technologies，Inc.)、Cy3TM(GEHealthcare)或Cy5TM(GE Healthcare)。在一种优选实施方案中，猝灭剂部分为BHQ-2。可应用于本发明探针、方法和试剂盒的其它猝灭剂部分的实例可参见美国专利6,399,392、6,348,596、6,080,068和5,707,813。用于本发明的猝灭剂部分可以购自例如Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR。
在本发明的某些实施方案中，探针可以包含荧光部分和猝灭剂部分。在这样的实施方案中，荧光部分可以是上文所述的本领域技术人员公知的任何荧光部分。此外，猝灭剂部分可以是本领域技术人员公知的任何猝灭剂部分，不受任何限制。典型地，猝灭剂部分将连接于探针的5’末端，并且荧光部分将连接于探针上连接猝灭剂部分3’的位置。
虽然不想受限于任何特定的理论或作用机制，当探针完整时，荧光部分发射的光子仍被认为可以被猝灭剂部分吸收并猝灭。该猝灭剂部分接着以不同波长光子的形式或热形式释放光子的能量。因此，猝灭剂部分也可以是荧光部分。如上所述，该现象被称为荧光共振能量转移(“FRET”)。探针在荧光部分与猝灭剂部分之间的裂解导致猝灭剂部分对荧光部分所发射荧光的猝灭的减少。
通常，荧光部分与猝灭剂部分之间的能量转移取决于该荧光部分与猝灭剂部分之间的距离和特定的荧光部分-猝灭剂部分对的临界转移距离。该临界转移距离是与已知猝灭剂部分配对的已知荧光部分的特征和常数。此外，当荧光部分-猝灭剂部分对的临界转移距离接近该荧光部分与猝灭剂部分之间的距离时，便可更灵敏地确定荧光部分与猝灭剂部分的空间关系。相应地，熟练的实施者可以选择荧光部分和猝灭剂部分，以具有特定的临界转移距离，该距离与探针上荧光部分和猝灭剂部分的分隔距离相近。特定的荧光部分-猝灭剂部分对的临界转移距离是本领域熟知的，可参见例如，Wu和Brand在1994，Anal.Biochem.2181-13中的论文。
对特定荧光部分-猝灭剂部分对而言的其它标准包括例如，荧光部分发射的荧光的量子产率；荧光部分发射的荧光的波长；猝灭剂部分的消光系数；猝灭剂部分发射的荧光的波长，如果有的话；以及猝灭剂部分发射的荧光的量子产率，如果有的话。此外，如果猝灭剂部分也是荧光部分，可优选地对该猝灭剂部分和荧光部分进行选择，以易于将其中一个部分发射的荧光与另一个部分发射的荧光区分开。与选择特定荧光部分-猝灭剂部分对有关的进一步指导可参见被完整引入本文作为参考的Klostermeier和Millar在2002，Biopolymers 61159-179中的综述论文。
可应用于本发明的荧光部分和猝灭剂部分的典型组合包括，但不限于，6-羧基荧光素(FAM)荧光团部分和Cy5TM猝灭剂部分；选自FAM、TET、JOE、HEX、Oregon Green的荧光团部分和BHQ-1猝灭剂部分；选自FAM、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5，、CAL Red、Red 640的荧光团部分和BHQ-2猝灭剂部分；选自Cy5和Cy5.5的荧光团部分和BHQ-3猝灭剂部分。可被应用于本发明探针、方法和试剂盒中的其它荧光部分-猝灭剂部分对实例可参见美国专利6,245,514。
可作为荧光和猝灭剂部分应用于FRET的分子实例包括荧光素、6-羧基荧光素、2’7’-二甲氧基-4’5′-二氯-6-羧基荧光素、罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基-X-罗丹明和5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光部分究竟是供体还是受体是根据其激发和发射光谱以及与其配对的荧光部分确定的。例如，FAMTM是由波长为494nm的光最为有效地激发的，并发射光谱为500-650nm的光，且最大发射波长为525nm。因此，FAMTM是适合与作为猝灭剂部分且最大激发波长为555nm的TAMRA一起应用的荧光部分。
在某些实施方案中，标记物部分是非荧光可检测部分，例如，放射性同位素、生物素部分或生物素结合部分(如亲和素、链亲和素、neutravidin)。当非荧光可检测部分是生物素或生物素结合部分时，可以用分别连接于第二生物素结合部分或生物素的本领域公知的可检测标记物检测靶核酸。例如，可以将放射性同位素、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)或荧光团连接于第二生物素结合部分或生物素、
探针通常是通过其3’末端连接于固体基质。典型地，探针是共价结合的，但也可以非共价连接于基质。固定的探针和固体基质之间特定的键对本发明的成功不是关键的，只要该键可以承受扩增反应所需的条件。例如，在PCR反应中，键应该承受间歇和重复暴露于使核酸序列变性的温度(80℃-105℃，通常约95℃)。在一些实施方案中，探针可以通过在探针3’末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大约35或大约40个残基的范围内的残基上与固体基质连接。典型地，探针将通过其3’末端连接于固体基质。可以修饰探针，使其在3’末端含有亲核基团(即，氨基)或亲电基团。通常可以采用本领域公知的亚磷酰胺化学法修饰探针。例如，可以从GlenResearch of Sterling，Virginia购买核苷氨基酸修饰剂亚磷酰胺。或者，探针可以连接于与寡核苷酸结合的固体基质上的活化的化学基团，例如，羧酸酯、醛部分、环氧化物部分、包括N-羟基琥珀酰亚胺的NHS酯、氨基部分、硝基部分、羟基部分、异硫氰酸酯部分、二氯三嗪基部分。典型的活化的化学基团包括环氧化物部分、羧酸酯部分、NHS酯、醛部分。包含用于捕获寡核苷酸的活化的化学部分的固体基质可以购自Telechem International，Inc.，Sunnyvale，CA，NalgeNunc，Intl.，Rochester NY和Exiqon，Vedbaek，Denmark。用于固定本发明的探针的额外的连接部分可以购自Pierce Biotechnology，Rockford，IL。
5.固体基质固体基质可以包括任何能够承受扩增反应所需条件的材料。例如，在PCR中，固体基质应该承受间歇和重复暴露于使核酸序列变性的温度(80℃-105℃，通常约95℃)。用于固体基质组成的示例的材料包括，但不限于，玻璃、硅组合物、塑料、合成聚合物(即聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯等)、金属、陶瓷等。固体基质通常具有平坦的表面，在其上连接寡核苷酸探针，并且可以是适于用于实施本发明的方法的特定测定或装置的任何性状。固体基质的示例的形状包括圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形，和任意其它多边形。固体基质可以是平皿、多孔板、测定管(即PCR管)、显微镜载玻片的形式。用于本发明的方法的平皿的表面积通常是大约1.0mm2-1.0cm2，例如，大约1.0mm2、2.0mm2、3.0mm2、4.0mm2、5.0mm2、6.0mm2、7.0mm2、8.0mm2、9.0mm2、1.0cm2、2.0cm2、3.0cm2、4.0cm2、5.0cm2。本发明的平皿的厚度是大约0.5mm-大约1.0cm，更通常是大约1.0mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm、5.0mm、6.0mm、7.0mm、8.0mm、9.0mm。适用于本发明的微孔板包括可以从例如Corning Lifesciences，Acton，MA(DNA binding Thermowell板)和Nalge Nunc，Intl.(ArrayCoteTM板)购买的那些。用于本发明的显微镜载玻片包括可以获自例如Telechem International，Inc.，Sunnyvale，CA(即SuperEpoxide和SuperAldehyde载玻片)、Asper Biotech，Tartu，Estonia(即3-氨基丙基三甲氧基硅烷+1，4-亚苯基二异硫氰酸酯活化的载玻片)、Nalge Nunc，Intl.，Rochester NY(即NucleolinkTM微阵列载玻片)、Grace Bio-Labs，Bend，OR(即Hybriwell chamber载玻片)和Bio-Rad Laboratories，South San Francisco，CA(即Frame-Seal system)的那些。
具有平坦表面的固体基质通常具有反应室，例如，可密封的凹孔或可密封的凸出的容器，以容纳用于扩增反应的扩增试剂。凹孔或凸出的容器应该密封，使得用于扩增反应的预定体积的液体不会蒸发。任选地，凸出的反应容器任选可以从具有平坦表面的固体基质上除去。反应室可以用例如适于密封的盖子或用橡胶或硅垫圈密封。可以通过用胶水或填缝材料密封闭合处，或通过将反应室维持在压力下而使漏液或漏气最少或不发生。
6.检测和/或定量靶核酸的方法概言之，本发明的方法包括在通过3’末端固定于固体基质并且在5’末端包含标记物部分的寡核苷酸探针的存在下，通过扩增靶核酸而检测靶核酸。这些方法通常包括在扩增试剂存在下，使与靶核酸杂交的固定的探针与具有5’核酸酶的酶接触。然后，具有5’核酸酶的酶在5’核酸酶反应中使与靶核酸杂交的固定的探针断裂，从而释放与5’末端连接的标记物部分。可用用于检测探针断裂的标记物部分标记该探针。这种方法是基于美国专利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015所描述的方法。
不加限制，在5′核酸酶反应中，所述核酸、引物和固定的探针可与本领域已知具有5′-3′核酸酶活性的任意酶接触。优选条件可使聚合酶裂解固定的探针的5’末端并从所述核酸释放探针的多个片段。具有5′核酸酶活性的优选酶包括模板依赖型核酸聚合酶。已知天然和重组形式的这种聚合酶包括例如，大肠杆菌DNA聚合酶I(Fermentas，Inc.，Hanover，MD)、嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶和Thermococcuslittoralis DNA聚合酶。
在优选的实施方案中，具有5′核酸酶活性的酶是热稳定性和热活性的核酸聚合酶。这种热稳定聚合酶包括但不限于来源于真细菌属，即栖热菌属、栖热袍菌属和栖热腔菌属的多个菌种的天然和重组形式的聚合酶。例如，可应用于本发明方法的栖热菌属菌种的聚合酶包括美国专利5,405,774、5,352,600、5,079,352、4,889,818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和5,795,762所述的水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、栖热菌种Z05(Z05)DNA聚合酶和栖热菌种sps17(sps17)。可应用于本发明方法的栖热袍菌属聚合酶包括例如海栖热袍菌DNA聚合酶和那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶，而可被采用的一个栖热腔菌属聚合酶实例是非洲栖热腔菌DNA聚合酶。国际专利申请PCT/US91/07035其
发明者D·波拉特, S·G·威尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司