专利名称：禽腺病毒复制非必须片段的筛选及其基因工程产品的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗药物的技术领域。
背景技术：
腺病毒最早发现于1953年，由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒(Adenovirus，Adv)。腺病毒属于腺病毒科(Adenoviridae)，在自然界中分布广泛。根据其形态结构、免疫学特性和宿主范围可划分为两个属哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和禽腺病毒属(Aviadenovirus)。
腺病毒结构简单，在感染过程中可以产生大量的病毒DNA，是真核基因表达调控机制研究的良好模型，腺病毒宿主范围广泛，感染率高，易于培养和纯化；在腺病毒基因组特定区域插入外源基因，不影响病毒复制而能使外源基因良好表达；腺病毒作为活疫苗使用，比较安全。目前腺病毒基因组结构、复制、转录的特征也已研究得相当清楚，特别是一些人腺病毒和动物腺病毒载体的构建成功及其在临床上的成功应用，使得腺病毒作为载体的研究更受到普遍的重视。
构建腺病毒载体包括将外源DNA插入腺病毒基因组中，通常插入的同时缺失E1区或E3区。人腺病毒E1区缺失病毒能在293细胞中增殖，对于病毒的存活而言，E1或E3区的缺失并不影响包装信号。此外，在相应细胞系的辅助下，还出现了纤维蛋白基因的缺失性载体，甚至是缺失所有的病毒编码基因的载体。由于腺病毒的复制能力具有较强的种类特异性，因此为了避免应用不适合的载体，需要构建不同种类的腺病毒载体。动物腺病毒载体的构建主要基于人腺病毒载体的构建。目前研究得较多的动物腺病毒主要有牛、犬、鼠、猪等。其中猪腺病毒3型(PAV-3)为基础的载体已在临床中得到应用。Monteil等将含有伪狂犬病病毒保护性抗原基因的复制缺陷腺病毒重组子临床应用于新生仔猪，结果证实能产生中和抗体，且不受母抗的影响，对仔猪的保护达16周之久。Hammond JM等将含有猪瘟gp55(E2)的重组猪腺病毒(rPAV)用一剂量免疫新生仔猪后，也能产生有限的保护作用。
禽类腺病毒至少有10个血清型，其中鸡胚致死孤儿病毒(CELO)即禽腺病毒1型、禽腺病毒10型、鹅源腺病毒、产蛋下降综合症病毒等均已完成物理图谱的构建、全序列分析或重要序列的分析，为构建禽类腺病毒表达性载体打下了基础。代表血清I型禽腺病毒的CELO病毒是研究得相对比较透彻的，其基因组全长为438048bp，目前已完成了全序列的测定工作。
Anne-Isabelle Michou等利用病毒在E.coli内的同源重组技术构建了CELO病毒载体。其研究结果鉴定了一系列的病毒复制必需区和右末端的一个复制非必需区，筛选出了AIM46 CELO载体，该载体应用于禽类疫苗的研究开发，更重要的是鉴定了起反式作用的区域，为建立辅助细胞系提供了实验基础。同样，CELO载体也与Ad5载体一样能转导哺乳动物细胞，因此也表明了发展CELO载体用于人类基因治疗的潜力。Francois A等利用点突变技术确定了CELO病毒的复制非必需区，在此基础上构建了复制型CELO病毒载体。该载体可携带编码IBDV蛋白的cDNA，并能作为鸡的疫苗使用。Sheppard M等将IBDV的VP2基因置于FAV-10主要晚期启动子(MLP)的下游，然后插入病毒基因组右末端99.5mu处的NotI位点(该位点在基因组上是唯一的)，构建成了基因组无缺失、含有外源基因的重组FAV-10病毒。该重组病毒接种SPF鸡可产生抗体反应，能有效抵抗IBDV的感染。
技术内容本发明的目的在于研究开发我国适于家禽免疫的可复制性病毒活载体，研制相关基因工程疫苗，以期在控制禽类重要传染病方面发挥作用。
本发明以中国鸡群分离的I群禽腺病毒为材料，通过PCR方法将该病毒基因组的两个末端L片段和r片段、ITR片段扩增出来，克隆进pHC粘粒载体中，并以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因为报告基因，插入设计好的r片段和ITR片段之间，构建转移质粒载体pFAV-eGFP，然后转染已被野生病毒感染了的鸡胚肾细胞，进行同源重组，通过无限稀释法筛选重组病毒，获得表达增强型绿色荧光蛋白的重组禽腺病毒。从而确定位于基因组右末端r片段和ITR片段之间的位点为病毒复制非必需区，并以此为载体开发研制相关基因工程产品。
本发明还在于筛选获得表达外源基因的重组禽腺病毒。
本发明还在于上述筛选获得表达外源基因的重组禽腺病毒用于生产基因工程疫苗。
具体实施例1.FAVI的扩增与病毒DNA的提取将病毒原液进行100倍稀释后接种9日龄SPF鸡胚，37℃孵化6天后取尿囊液，做适当处理后负染，观察病毒形态，然后取尿囊液用蛋白酶K消化，按常规方法提取病毒基因组DNA备用。
2 引物设计根据已发表的FAVI病毒全基因组序列，设计了三对引物，它们分别是PL15’ggggcggccgcgatgatgtataataacct3’；PL25’gggtctagactcacgcgacatgactgtct3’
Pr15’gcgtctagaccagaaccattcttcagccg3’Pr25’gcggaattcgtaccggactgttgtgcgga3’PITR15’gcggaattcacacacggacaacttcaaag 3’PITR25’gcggtcgacgatgatgtataataacctc 3’分别扩增I群禽腺病毒基因组左末端L片段、右末端r片段和右ITR片段。
3 PCR扩增取0.1μg的病毒DNA进行PCR扩增，采用50μl的PCR体系DNA 0.1μg，10×PCRbuffer 5μl，25mM MgCl2 3μl，10mM dNTP 1μl，上游引物和下游引物各25pmol，Taq酶0.5U，加灭菌超纯水至50μl，并按以下程序进行①94℃ 5min，②94℃1min，③56℃1min，④72℃ 2min，⑤重复②-④步30个循环⑥72℃ 10min⑦4℃forever⑧end。
4.PCR产物的回收、连接及测序将PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，取回收产物按3∶1的比例与pGEM-Teasy载体于4℃连接8hr以上，转化DH5α感受态细菌，通过X-Gal板筛选白斑，酶切鉴定，三个片段的阳性质粒pGEM-T-L、pGEM-T-r、pGEM-T-ITR用于下一步的克隆并测序。
5 含eGFP基因FAVI转移质粒载体的构建首先将pGEM-T-r用EcoRI、SpeI酶切，回收2kb的r片段，克隆进已用相应酶酶切的PHC载体中，然后再将pGEM-T-ITR中的ITR片段以EcoRI、SalI插入到已含有r片段的pHC-FAVI-r载体中，获得载体pHC-FAVI-r-ITR，在该载体的EcoRI位点插入含CMV启动子和SV40 polyA的eGFP表达盒，获得含有报告基因的pHC-FAVI-r-ITR-eGFP转移质粒载体，为了利于细胞内的同源重组，最后还在pHC-FAVI-r-ITR-eGFP插入FAVI的L片段。
6 含eGFP基因重组FAVI的构建在60mm培养皿中培养原代CEK至形成80％单层，以100个TCID50wt-FAVI感染CEK，37℃作用2h；同时，在2个eppendorf管中各加入100μl无血清的DMEM，然后分别加入7-8μl Lipofectin和1.5-4μg的FAVI转移质粒DNA，置室温45min，将2管混合，室温作用15mins，加入800μl无血清的DMEM，轻轻将此转染混合液转移到已感染FAVI的CEK上，在37℃，5％CO2作用6h，吸去转染液，加入含8％小牛血清的DMEM，37℃培养2-3天，每天观察荧光直至出现重组病毒荧光斑。
7 荧光细胞的收获及含eGFP基因重组FAVI的传代在出现荧光的培养皿中覆盖营养琼脂(2×细胞培养维持液与1.6％琼脂等体积混合，5ml/dish)，待琼脂凝固后翻转培养皿，37℃、5％CO2继续培养24-48hr。将细胞核中出现荧光的细胞及细胞集落在荧光显微镜下作好标记，然后用吸管将其吸出，置于1ml细胞培养维持液中，冻融3次后，取上清，以不同的稀释倍数感染24孔细胞培养板上的CEK，待出现荧光后，再进行荧光挑斑。
权利要求
1.禽腺病毒复制非必须片段的筛选，其特征在于主要由以下步骤完成1)以中国鸡群分离的I群禽腺病毒为材料，通过PCR方法将病毒基因组的两个末端L片段和r片段、ITR片段扩增出来，克隆进载体，并以报告基因插入设计好的r片段和ITR片段之间，构建转移质粒载体；2)将构建的禽腺病毒转移质粒载体转染已被野生病毒感染了的鸡胚肾细胞，进行同源重组，筛选重组病毒。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于以PCR分别对禽腺病毒基因DNA基因组左末端L片段、右末端r片段和右ITR片段进行PCR扩增。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于扩增基因组左末端L片段的上、下游引物分别是PL15′ggggcggccgcgatgatgtataataacct3′；PL25′gggtctagactcacgcgacatgactgtct3′。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于扩增基因组右末端r片段的上、下游引物分别是Pr15′gcgtctagaccagaaccattcttcagccg3′；PL25′gcggaattcgtaccggactgttgtgcgga 3′。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于扩增基因组右ITR片段的上、下游引物分别是PITR15′gcggaattcacacacggacaacttcaaag 3′；PITR25 gcggtcgacgatgatgtataataacctc 3。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤1)中载体克隆构建转移质粒载体的方法是首先将2kb的r片段克隆进已用相应酶酶切的PHC载体中，然后再将ITR片段插入到已含有r片段的pHC-FAVI-r载体中，获得载体pHC-FAVI-r-ITR，在该载体的EcoRI位点插入含CMV启动子和SV40polyA的eGFP表达盒，获得含有报告基因的pHC-FAVI-r-ITR-eGFP转移质粒载体，为了利于细胞内的同源重组，最后还在pHC-FAVI-r-ITR-eGFP插入FAVI的L片段。
7.如权利要求1所述筛选获得表达外源基因的重组禽腺病毒。
8.如权利要求1所述筛选获得表达外源基因的重组禽腺病毒生产基因工程疫苗。
全文摘要
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗药物的技术领域。以中国分离的I群禽腺病毒为材料，通过PCR方法将该病毒基因组的两个末端L片段和r片段、ITR片段扩增出来，克隆进pHC粘粒载体中，并以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因为报告基因，插入设计好的r片段和ITR片段之间，构建转移质粒载体pFAV－eGFP，然后转染已被野生病毒感染了的鸡胚肾细胞，进行同源重组，筛选重组病毒，获得表达增强型绿色荧光蛋白的重组禽腺病毒。从而确定位于基因组右末端r片段和ITR片段之间的位点为病毒复制非必需区，并以此为载体开发研制相关基因工程产品。
文档编号C12N15/861GK1462804SQ03131899
公开日2003年12月24日 申请日期2003年6月13日 优先权日2003年6月13日
发明者秦爱建, 何秀苗, 刘岳龙, 金文杰 申请人:扬州大学