专利名称：基因大片段、单拷贝缺失检测芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测芯片及其应用，更具体地说涉及一种基因大片段、单拷贝缺失检测芯片及其应用。
背景技术：
遗传学、分子生物学理论和技术的发展给医学带来的直接成果之一是疾病的基因诊断、特别是遗传性疾病的基因诊断成为可能。
90年代之前，由于受到分析技术和分析目标的限制，大多数实验室在开展医学遗传学分析时主要围绕细胞遗传学和分子细胞遗传学技术，观察染色体异常与疾病发生的关系。光镜下可见的染色体改变可能是Mb大小、涉及一个或多个基因的DNA片段。而对于单基因遗传病，DNA的微小改变即可能导致基因功能的丧失，从而引起疾病的发生，因此染色体水平的遗传学分析极大地限制了遗传性疾病的基因诊断。进入90年代，随着人类基因组计划的开展和不断取得进展，愈来愈多的疾病相关基因得到分离；与此同时多种敏感性较高的基因突变分析技术的出现和完善，使遗传性疾病发病相关基因的突变分析和基因诊断逐步得到推广。人类绝大多数遗传性疾病发病相关基因一般没有突变热点，即病理性突变可以出现在基因的各个位点；发病相关基因的全基因筛查是准确作出基因诊断的基础。目前实验室常用的突变基因分析技术包括分子杂交技术、变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)、单链构象多态性技术(SSCP)、变性高效液相色谱技术(DHPLC)、实时定量PCR技术、DNA序列分析技术等。这些技术具有足够的敏感性，可以检出绝大多数单个碱基的改变。然而这些技术单次实验可分析的DNA片段较短，在检测未知突变时，须对某一病例的一个或多个疾病相关基因的每个外显子进行突变筛查，分片段完成整个基因的分析。这样需要的时间较长，工作量很大。临床常规开展基因诊断，迫切需要分析效率较高、样本通量较大、敏感性较强的突变基因分析技术。
近年兴起的建立在分子杂交原理上的基因芯片技术是自90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值。同时，这项技术可开发多种商业化的芯片应用于基础研究和临床诊断，具有明显的产业化前景。基因芯片技术作为一种高度平行、大规模、快速的生物信息检测方案，将大量的探针通过点样或原位合成固定到基底材料上，通过分子标记和分子杂交实现高通量的样本检测。根据点于芯片上的核酸序列来源，基因芯片有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分，包括二种模式一是将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析；二是将大量探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。目前已开发的基因芯片产品可实现基因表达分析、基因微小突变分析、SNP(单核苷酸多态性)位点分析、基因某些特定变异(如甲基化)的分析，这些芯片的开发和推广已在生物医学研究和应用中发挥重要作用。
然而基因突变的复杂性给基因诊断技术提出了新的要求。最新研究表明，介于遗传性染色体异常和基因微小突变之间还普遍存在另一类的基因结构异常，即DNA的大片段缺失(Deletion)和复制(Duplication)。这类DNA大片段结构变异(突变)约占基因突变的1/3，且在细胞内多表现为单拷贝的异常(显性遗传病的患病个体；隐性遗传病的突变基因携带者)。完整的突变基因分析系统应包含可有效检出各类突变的分析技术，但目前实验室常用的基因诊断技术难以检出这类突变。目前困扰基因诊断工作的问题之一是某些遗传性疾病发病相关基因突变的检出率不高，其原因可能主要有两个方面①完成诊断需要做到的全基因筛查与现有分析技术的样本通量之间的矛盾；②采用的分析技术是否可以涵盖对各种类型的基因突变分析。为此我们已发展了定量多重PCR技术，这一技术可以有效检出基因组DNA大片段结构变异，但限于它的样本通量，大样本的分析难以在短期内完成。根据我们在发展和完善定量多重PCR技术中得到的启发，结合芯片技术，在设计和检测中引入统计量的概念，研制基因组DNA大片段结构变异检测芯片，用于筛查疾病相关基因的大片段变异(缺失或复制)。
新的基因突变检测类芯片产品的开发和使用将填补目前基因芯片研究中的一个空白，可在遗传性疾病的基因诊断(包括产前诊断)，遗传相关性疾病的防治，肿瘤早期诊断，突变基因携带者和高危发病个体筛查等工作中发挥重要作用，产生良好的社会和经济效益。
发明内容
本发明解决现有技术中受技术方法或样本通量限制而难以临床常规开展遗传性疾病的基因大片段缺失检测的不足和相关基因检出率不高的缺点，提供一种样本能量高、基因检出率高的基因大片段、单拷贝缺失检测芯片及其检测方法。
本发明的技术方案是一种基因大片段、单拷贝缺失检测芯片，其特征在于
1)对于仅有单个候选基因的遗传性疾病，选取不少于3个的检测基因，其中一个为致病基因，其余为参照基因，以基因外显子为单位，根据基因的基因组DNA结构，选择外显子中具有相近Tm值长度为30～50个碱基的序列并合成探针；2)对于具有多个候选基因遗传性疾病，选取不少于3个的疾病相关基因作为检测基因，以基因外显子为单位，互为参照，根据基因的基因组DNA结构，选择外显子中具有相近Tm值长度为30～50个碱基的序列并合成探针。所述的参照基因为基因组内结构序列保守的基因，所述的探针其分布是在玻片上以外显子顺序依次分布，并且各探针重复不少于5次。
一种利用上述检测芯片用于基因遗传性大片段缺失的检测方法，其特征在于步骤如下1)核酸样品的制备提取可疑患者外周静脉血DNA，酸化处理，裂解DNA分子至500-1000碱基，稀释至100ng/ul(待检样本)，随机引物法低度循环扩增待检样本，在扩增过程中加入荧光物质，完成样本DNA的标记；2)杂交荧光标记的样本DNA 95℃变性处理，特定温度下，4×SSC+1％BSA预杂交，杂交，室温下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，双蒸水洗净吹干；3)杂交信号检测荧光扫描仪扫描检测；4)杂交信号的分析及结果判定首先以已知具有基因DNA大片段结构变异的不同阳性样本为先例，以稳定检出单拷贝变异作为标准，编写软件，建立探针点样及芯片杂交后各点信号之间参数的计算模式，以此计算模式进行未知样品分析。
所述的低度扩增为低度8～10个循环扩增。
上述芯片的制备方法，包括如下步骤1)载玻片的修饰；2)针设计、合成及修饰；3)探针的固定。
影响制备获得的DNA大片段缺失检测芯片性能的主要因素1)芯片载体—玻片的处理玻片表面化学修饰状况直接关系到点布的探针能否通过分子手臂有效的结合于玻片表面，使各点的探针结合量稳定。
2)探针设计根据检测目的基因各外显子序列，通过选择探针中(A+T)/(G+C)值，调整探针长度，使各探针杂交条件相近，以保证后续芯片杂交信号的稳定。
3)芯片上参照基因探针选择基因选择单拷贝的保守基因；探针序列设计使其杂交条件与检测目的基因探针相近。
4)芯片上各探针的分布和重复次数根据各探针的杂交稳定性确定各探针的重复次数，使该探针点的杂交信号强度综合处理后样本拷贝数成正相关。
利用DNA大片段缺失检测芯片对待检样品进行分析的条件可在以下方面进行优化1)裂解待检DNA样本PH值(4.0-4.5)及其处理时间的调整，保证裂解后的DNA片段大小在500-1000碱基。
2)DNA样本的低度扩增，通过调整DNA浓度、寡核苷酸引物量及DNA合成的循环次数，在保证DNA样本中各基因片段拷贝数原有比值不变的前提下，各基因片段拷贝数的增加可以使芯片的杂交获得明确的信号。
3)芯片杂交温度，杂交后漂洗缓冲液的离子强度及漂洗时间，尽可能的去除杂交背景信号，保证杂交信号的清晰，使各探针杂交信号综合处理后，其强度与以形成杂交的探针数成正相关。
本发明的有益效果是现有的基因芯片产品多应用于基因点突变，SNP(单核苷酸多态性)位点分析，若干碱基缺失和基因的表达分析等。我们结合医学遗传学、肿瘤发病相关基因突变研究的最新进展，研制了一种普遍存在的基因突变(DNA大片段结构异常)类型的检测芯片，填补目前基因芯片研究中的一个空白，可在遗传性疾病的基因诊断(包括产前诊断)，遗传相关性疾病的防治，肿瘤早期诊断，突变基因携带者和高危发病个体筛查等工作中发挥重要作用，产生良好的社会和经济效益。
1)基因分析中检测序列的“有”和“无”一般容易鉴别，难以鉴别的是DNA大片段结构异常时等位基因拷贝数的变化，特别是等位基因的单个拷贝缺失或单个拷贝复制。为解决这一问题，我们采用①以外显子为单位设计探针，同时以外显子为单位分析基因结构变异；②以不少于3个基因的所有外显子同时分析，并设立参照，完成基因或其部分结构拷贝数的定量分析；③芯片检测中引入统计量的概念，以稳定基因或基因片段拷贝数的定量分析。
2)检出发病相关基因的遗传性突变是基因诊断和遗传咨询的关键，而DNA大片段结构变异约占基因突变的1/3。随着功能基因组研究的深入，愈来愈多的疾病相关基因将得到分离，分子医学和基因诊断在临床上的作用也愈见重要，因此DNA大片段结构变异检测芯片极具临床应用前景。已经知道，除男性性染色体上的基因外，人类体细胞中的基因都呈双拷贝。对于显性遗传性疾病(包括遗传性肿瘤)，遗传获得的发病相关基因的异常为单拷贝的基因突变；而对于常染色体隐性遗传性疾病，除概率较小的纯合型发病个体外，人群中更多的是单拷贝的突变基因隐性携带者。DNA大片段结构变异时基因单拷贝异常的分析，可检出突变基因携带者、高危发病个体、明确诊断患病个体。
3)这种新的基因突变检测类芯片产品的开发和使用将在遗传性疾病的产前、病前诊断，遗传相关性疾病的防治，肿瘤早期诊断，突变基因携带者和高危发病个体筛查等工作中发挥重要作用。
具体实施例方式
实施例1遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)发病相关基因大片段缺失检测芯片的制备1)玻片的清洗及表面化学修饰选择合适尺寸的玻片，1∶1的甲醇盐酸溶液清洗，蒸馏水洗净，浓硫酸浸泡，95％的乙醇充分冲洗，空气干燥。95％的乙醇和硅烷按49∶1的比例配置成硅烷化试剂，玻片置于其中浸泡，双蒸水洗净，立置玻片，自上向下吹干，110℃烘烤。95％的乙醇或异丙醇浸泡，双蒸水洗净吹干，Ph7.0、0.01M的PBS溶液配置5％的戊二醛溶液，玻片置于其中浸泡，0.01M的PBS溶液清洗，蒸馏水洗净，吹干。扫描仪扫描，选择荧光背景较弱的玻片用于下一步实验。
2)探针的合成序列选自MLH1、MSH2、MSH6基因的45个外显子，探针长度30-50个碱基，具有相近的Tm植，氨基化修饰3’末端。
3)探针的固定和分布碳酸盐缓冲液稀释探针，雾化条件下，点于预处理的玻片上。玻片置于封闭环境中，室温放置一小时后转至潮湿小室中37℃水浴两小时。0.1％SDS水溶液浸洗，双蒸水洗净吹干。玻片置于硼氢化钠还原液中浸泡，将表面的醛基还原为羟基。每张芯片上各探针的点样量不少于5，重复次数以满足统计量的要求为准。
实施例2遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)发病相关基因遗传性大片段缺失分析与检测1)核酸样品的制备提取可疑患者外周静脉血DNA，酸化处理，裂解DNA分子至500-1000碱基，稀释至100ng/ul(待检样本)。随机引物法低度8个循环扩增待检样本，在扩增过程中参入荧光物质，完成样本DNA的标记。
2)杂交荧光标记的样本DNA 95℃变性处理，特定温度下，4×SSC+1％BSA预杂交，杂交。室温下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，双蒸水洗净吹干。
3)杂交信号检测荧光扫描仪扫描检测。
4)杂交信号的分析及结果判定首先以已知具有基因DNA大片段结构变异的不同阳性样本为先例，以稳定检出单拷贝变异作为标准，编写软件，建立探针点样及芯片杂交后的计算模式，以此计算模式进行未知样品分析。
实施例3假肥大型肌营养不良症发病相关基因大片段缺失检测芯片的制备探针的合成序列选自DMD致病基因的79个外显子、参照基因β-actin基因的3个外显子及参照基因GAPDP基因的3个外显子，探针长度30-50个碱基，具有相近的Tm植，氨基化修饰3’末端。其余方法步骤同实施例1。
实施例4假肥大型肌营养不良症发病相关基因大片段缺失分析与检测1)核酸样品的制备提取可疑患者外周静脉血DNA，酸化处理，裂解DNA分子至500-1000碱基，稀释至100ng/ul(待检样本)。随机引物法低度9个循环扩增待检样本，在扩增过程中参入荧光物质，完成样本DNA的标记。
其余方法步骤同实施例2。
实施例5苯丙酮尿症相关基因大片段缺失检测芯片的制备探针的合成序列选自PAH基因的13个外显子、参照基因β-actin基因的3个外显子及参照基因GAPDP基因的3个外显子，探针长度30-50个碱基，具有相近的Tm植，氨基化修饰3’末端。
其余方法步骤同实施例1。
实施例6苯丙酮尿症相关基因大片段缺失分析与检测1)核酸样品的制备提取可疑患者外周静脉血DNA，酸化处理，裂解DNA分子至500-1000碱基，稀释至100ng/ul(待检样本)。随机引物法低度10个循环扩增待检样本，在扩增过程中参入荧光物质，完成样本DNA的标记。
其余方法步骤同实施例2。
权利要求
1.一种基因大片段、单拷贝缺失检测芯片，其特征在于1)对于仅有单个候选基因的遗传性疾病，选取不少于3个的检测基因，其中一个为致病基因，其余为参照基因，以基因外显子为单位，根据基因的基因组DNA结构，选择外显子中具有相近Tm值长度为30～50个碱基的序列并合成探针；2)对于具有多个候选基因遗传性疾病，选取不少于3个的疾病相关基因作为检测基因，以基因外显子为单位，互为参照，根据基因的基因组DNA结构，选择外显子中具有相近Tm值长度为30～50个碱基的序列并合成探针。
2.根据权利要求1所述的基因大片段、单拷贝缺失检测芯片，其特征在于所述的参照基因为基因组内结构序列保守基因。
3.根据权利要求1所述的基因大片段、单拷贝缺失检测芯片，其特征在于所述的探针其分布是在玻片上以外显子顺序依次分布，并且各探针重复不少于5次。
4.一种利用上述检测芯片用于基因遗传性大片段缺失的检测方法，其特征在于步骤如下1)核酸样品的制备提取可疑患者外周静脉血DNA，酸化处理，裂解DNA分子至500-1000碱基，稀释至100ng/ul(待检样本)，随机引物法低度循环扩增待检样本，在扩增过程中加入荧光物质，完成样本DNA的标记；2)杂交荧光标记的样本DNA 95℃变性处理，特定温度下，4×SSC+1％BSA预杂交，杂交，室温下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，双蒸水洗净吹干；3)杂交信号检测荧光扫描仪扫描检测；4)杂交信号的分析及结果判定首先以已知具有基因DNA大片段结构变异的不同阳性样本为先例，以稳定检出单拷贝变异作为标准，编写软件，建立探针点样及芯片杂交后各点信号之间参数的计算模式，以此计算模式进行未知样品分析。
5.根据权利要求4所述的基因遗传性大片段缺失的检测方法，其特征在于所述的低度扩增为低度8～10个循环扩增。
全文摘要
本发明公开了一种基因大片段、单拷贝缺失检测芯片及其应用，解决了现有技术中受技术方法或样本通量限制而难以临床常规开展遗传性疾病的基因大片段缺失检测的不足和相关基因检出率不高的缺点，提供一种样本能量高、基因捡出率高的基因大片段、单拷贝缺失检测芯片和检测方法，其特征在于选取检测基因，以基因外显子为单位，根据基因的基因组DNA结构，选择外显子中具有相近Tm值长度为30～50个碱基的序列并合成探针；探针点样固定于玻片，探针的分布符合统计量的要求；待检DNA样本酸化处理，制备成一定大小的DNA片段；待检DNA样本内加引物低度扩增，并标记荧光；待检DNA样本与芯片杂交，专用软件分析各杂交探针点荧光信号，确定待检DNA的目标基因是否存在大片段缺失。
文档编号C12Q1/68GK1483837SQ0313174
公开日2004年3月24日 申请日期2003年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者王亚平, 张晓梅, 李金田, 吴晓柳, 朱明 , 张元颖 申请人:江苏省肿瘤医院