专利名称：云南红梨PybHLH基因及其原核表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨花青素生物合成、毛状体发生发育及盐胁迫调控蛋白基因及其原核表达和原核表达载体在制备PybHLH蛋白和特异性抗体中的应用。
背景技术：
红色果皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨I号四个栽培品种。但生产中除云红梨I号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究较多，而对植物中的bHLH和WD40蛋白研究较少。在拟南芥中LDOX基因启动子直接包括EGL3和TT8在内的不同的MYB-BHLH-TTG1转录复合物的调控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突变体试验也表明了 egl3和tt8是拟南芥幼苗花青素累积的必要条件。在拟南芥中JAZ( Jasmonate ZIM-domain)蛋白与WD-repeat/bHLH/MYB 转录复合物中的 bHLH (Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer ofGlabra3 [EGL3])和R2R3 MYB转录因子(MYB75和Glabral)互作，抑制了 JA调控的花青素的累积和毛状体的发生，而JA诱导的JAZ蛋白的降解能够解除这种抑制。在大丽花(DahI iavariabilis)中，bHLH 转录因子 DvIVS 通过调控 DvCHSl, DvF3H, DvDFR 和 DvANS 的转录来参与其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH转录因子MYCAl可能通过调控ANR和UFGT基因的表达来调控其花青素的生物合成。在龙胆花(G.triflora)中，GtMYB3和GtbHLH参与花青素的生物合成。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和 MYB 蛋白(GLl, PAPl、PAP2、CPC、TRY)组合，形成 MYB/bHLH/WD40 复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形 成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、误表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获_耗尽机制:在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTGl来耗尽临近细胞中的TTGl，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因TTGl的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了 TTGl，GL3，GLl和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。另外，植物中的bHLH转录因子也参与植物抗逆性机制，拟南芥中过表达0rbHLH2或OrbHLHOOl基因增强拟南芥的抗盐和抗冷的特性。在云南红梨着色机理研究方面，本实验室研究了光照对云南红梨着色的影响、构建了光诱导果皮差异表达基因的SSH文库，进行了着色相关基因的分离和表达分析。前期研究结果表明云南红梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40调控的。前期分离克隆的基因的部分片段(Λ构建的原核表达载体，由于该载体只含有PybHLH基因的一段序列而不是全长序列，获得的PybHHL抗体特异性不是很理想，不能准确的用于分离与PybHLH蛋白相互作用的蛋白质和DNA片段；在前人研究基础上，针对云南红梨栽培品种早白蜜、满天红、美人酥着色不稳定、在国内外尚未见有关云南红梨果皮红色着色机理方面研究报道，本研究选择着色最好且稳定的‘云红梨I号’作为实验材料，克隆了 ‘云红梨I号’中基因的全长序列，并且进行了序列分析、原核表达和蛋白纯化抗体制备的研究，这将为研究云南红梨转录因子PybHLH的结构和功能奠定了基础，并为作物花卉育种提供有利的科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种云南红梨基因，该基因主要是对云南红梨花青素生物合成、毛状体发生发育及盐胁迫调控蛋白起作用，/>况￡//基因来源于云红梨I号，云南红梨基因含有两个相连的基本亚区，即富含碱性氨基酸BASIC区域及其下游的HLH区域，其中碱性氨基酸基序与DNA的结合有关，对基因的转录发挥调控作用。本发明另一目的是提供云南红梨/基因的原核表达载体V從奶-PybHLH,该载体含有基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，基因的N端含有GST标签。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨色素合成特异性调控蛋白 PybHLH 中。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备PybHLH特异性抗体中，PybHLH特异性抗体应用在检测其在转基因植物中的表达情况、PybHLH蛋白的亚细胞定位检测、PybHLH蛋白的纯化并且在蛋白相互作用分析以及用于Far Western Blot和免疫沉淀(IP)及染色质免疫共沉淀(ChIP)中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
1、原核表达载体的构建
(I)根据苹果MdbHLH33基因(GenBank登录号为DQ266451.1)编码框，设计I对特异引物 PybHLH-F:5’ -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3 和 PybHLH-R:3’:CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc,在上下游引物的5'端分别加入BamHI和XhoI酶切位点(下划线部分为酶切位点)。以云红梨I号总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PybHLH-F和PybHLH-R进行扩增；
基因全长片段的回收；
基因的T/A克隆和测序；
(4)/>从^7基因的生物信息学分析及GenBank登录号的获得；
(5)构建原核表达载体:使用BamHI和XhoI对pMD-lST-Zy/yK"质粒和pGEX_4T_l进行双酶切，分别获得5’和3’末端带有分别带有BamHI和XhoI酶切位点的/基因片段和PGEX-4T-1载体，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16 h，获得原核表达载体认^l-M-PybHLH ；
2、PybHLH基因的原核表达
使用热刺激法将pGEX-4T-/^^yZ"质粒转入大肠杆菌Rosetta (DE3)中，在IPTG诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；3、PybHLH蛋白纯化及抗体制备
收集菌体，进行超声破碎，过GST琼脂糖亲和层吸柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于制备PybHLH蛋白特异性抗体、PybHLH蛋白表达检测。本发明的有益效果:
本发明获得了基因的全长序列以及重组原核表达载体pGEX-4T-/y^K仏通过
表达获得纯化蛋白，制备特异性较强的PybHLH抗体，与前期制备的抗体相比，本次发明获得载体与抗体的优势更强，减少了在GST pull down和免疫共沉淀实验中出现的非特异性条带，使实验结果更加精 确，并且得出更好的结论。本发明制备的抗体可用于检测PybHLH蛋白，弥补了目前没有专门检测PybHLH蛋白、蛋白相互作用分析的缺陷，另外，本发明的抗体还含有谷胱甘肽S转移酶(GST)标签,该抗体还可用于GST pull down>Far Western Blot和免疫沉淀(IP)及染色质免疫共沉淀(ChIP)中，研究与PybHLH蛋白相互作用的蛋白质和DNA片段，并且，该抗体含有的GST标签，也方便了后续实验。
图1为本发明中云红梨I号的总RNA电泳示意 图2为本发明/基因的PCR结果示意图，图中:1是DNA MarkerIII ;2和3为PybHLH纖PCR的结果；
图3为本发明中原核表达载体pMD18T-/y^K#的酶切结果示意图；图中:1是DNAMarkerIII ;2、4、6 为 pMD18T_/y^K"质粒；3、5、7 分别为泳道 2、4、6 中 pMD18T_PybHLH质粒的BamHI和XhoI双酶切结果；
图4为本发明中PybHLH蛋白在16°C、IPTG终浓度为I mM条件诱导下的表达情况示意图，图中:1是转化PGEX-4T-1空载体的Rosetta菌体总蛋白；2_6是工程菌在16°C、IPTG终浓度为I mM条件下诱导0、2、4、6和8 h后的表达情况；M是蛋白质分子量标准M0431 ;7_8是工程菌在16°C、IPTG终浓度为I mM条件下诱导8 h，总蛋白破碎后目的蛋白在上清和沉淀中的表达情况；
图5为本发明中PybHLH蛋白的割胶纯化示意图，图中:I的割胶回收后的PybHLH蛋白样品；2是蛋白质分子量标准M0441 ；
图6为本发明中PybHLH蛋白的Western Blot检测结果示意图；图中:1是是PybHLH蛋白，2是GST蛋白负对照；
图7为本发明中使用PybHLH抗体检测35S::转基因烟草叶片PybHLH蛋白表
达结果示意图，图中:1，2，3，4是转基因株系，5是野生型对照；
图8为本发明中免疫共沉淀分析结果示意图，图中:1-3是免疫沉淀的PybHLH蛋白；4是用ant1-GST进行免疫沉淀的负对照；
图9为本发明中Far Western blotting分析结果示意图，图中:1和3是PybHLH蛋白，2是GST为负对照；
图10为原核表达载体pGEX-4T-/y^K"的构建策略示意图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。实施例中使用的试剂主要为分子生物学试验试剂:各种限制性内切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连，Takara)产品，反转录酶购于Promaga公司的，PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工生物技术有限公司，大肠杆菌办Miia (DE3)菌株和大肠杆菌DH5 α感受态细胞为北京Transgene公司产品，其余试剂均为国产分析纯。使用的仪器为GST琼脂糖凝胶柱子，其它仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器设备。所有引物序列合成在上海杰瑞生物科技股份有限公司进行，所有基因测序在北京六合华大基因科技股份有限公司进行。实施例1:本发明云南红梨/基因的克隆、原核表达、纯化和抗体制备，具体步骤如下:
(1)引物设计
根据苹果MdbHLH33基因(GenBank登录号为DQ266451.1)编码框，设计I对特异引物PybHLH-F:5’ -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3’ 和 PybHLH-R:5，-CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc-3’，在上下游引物的5'端分别加入BamHI和XhoI酶切位点(下划线部分为酶切位点)。(2)总RNA的提取
a、用液氮将0.1 g云红梨I号红色果皮充分研磨成粉末以后，加入1 ml RNA提取缓冲液(4 M异硫氰酸胍，25 mM柠檬酸钠，0.5 % (w/v)十二烷基肌氨酸钠，2 %(w/v) PVP,β-巯基乙醇)，转入2 ml离心管中，再研磨均匀后，再加入1/10体积2 M醋酸钠(pH 4.2)；
b、颠倒离心管数次，混匀之后，接着加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧离心管盖，剧烈摇动5 min,冰上静置15 min后，4°C离心15 min (12000 g/min)；
C、离心结束后取上清于新离心管中，加入等体积的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动5min,冰上静置 15 min 后,4 °C离心 15 min (12000 g/min)；
d、取上清，加入等体积异丙醇，在_20°C沉淀RNA30 min，再次4°C离心15 min (12 000g/min),让RNA沉淀在管壁；
e、RNA沉淀经75%乙醇清洗两次后抽真空干燥，然后加入20μ l无RNase的DEPC处理水彻底溶解RNA ；
f、使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA (见图1)。(3) RT-PCR
以云红梨I号总RNA为模板,用M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA,具体步骤如下:
a、在EP管中加入以下组分:总RNA2 μ g ;oligo (dT) 18 0.5 μ g ;无RNase的水补足15
μ l ;
b、70°C5 min后，迅速冰上静置2 min ；
C、离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集离心底部；
d、再向离心管中加入以下组分:5XM-MLV反应缓冲液5 μ 1、dNTP (IOmM)U.25 μ 1RNase 抑制剂 0.5 μ 1、RTase M-MLV(200 U) 1 μ 1，无 RNase 的水补足 25 μ 1 ;e、42°C保温60 min, -20 1:保存备用；
以反转录合成的云红梨I号cDNA后使用PybHLH-F和PybHLH-R进行PCR扩增，反应体系如下:
反应体系:ddH20 17.8 μ I, Taq Plus DNA Polymerase IOXBuffer 2.5 μ 1,10 mMdNTP 0.4μ 1，10μΜ 的 5’ 引物 1μ 1，10 μΜ 的 3’ 引物 I yl，cDNA 模板 2 μ 1,5 U/μ I的 Taq Plus DNA Polymerase 0.3 μ I ;反应条件为:94 °C 2 min, (94°C 30 s’ 59°C 30s，72°C 2 min) 30 个循环，72°C 10 min (见图 2)。基因片段的回收:对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段；使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。基因的T/A克隆和测序；将回收的PCR产物，按照pMD18T说明书，进行T/A克隆；转化大肠杆菌感受态DH5 α后，涂固体LB + Amp平板，挑取白色菌落，接种到液体LB + Amp培养基中，37°C、200 rpm摇床过夜，提取质粒，进行酶切检测，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。基因测序和生物信息学分析及GenBank登录号的获得:PybHLH基因的读码框为1947 bp，该基因编码648个氨基酸，分子量为72925.8 Da，等电点为5.5LDNAMAN比对结果表明，PybHLH与苹果、矮牵牛、拟南芥和玉米等调控花青素生物合成的bHLH转录因子具有很高的同源性，尤其是与苹果中的MdbHLH33在同一进化枝，故将该序列命名为PybHLH 荖里。 (7 )原核表达载体的构建(构建策略见图1O ):使用BamHI和Xho I对pMD \m~PybHLH和载体pGEX-4T-l按照说明书进行双酶切(见图3)，分别获得5’端带有BamHI和3’端带有XhoI的/基因片段和PGEX-4T-1载体，跑电泳后分别进行胶回收，按照摩尔比目的基因:载体=3:1加样,然 后加入Ligation Solution I,16°C连接16 h ;将感受态大肠杆菌E.coli DH5 α 100 μ I加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30 min, 42°C热刺激45s后，冰浴2 1^11;加入90(^1液体培养基30(:，371:摇床200 rpm 60min使菌体复苏；培养结束后，常温8000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取白色菌落，接种于LB液体+ Amp的培养基，37°C、180 rpm培养12 h后，提取质粒；进行酶切验证后，再送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序进行测序验证插入基因的正确性，最后获得原核表达载体认&\-M_PybHLH。(8)PybHLH蛋白的原核表达:使用热刺激法将重组质粒ρ6ΕΧ_4Τ-/>/ ^7转化入大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中，涂LB+Amp固体平板，挑取V-M-PybHLH的重组菌落于LB + Amp液体培养基中37°C、200 rpm振荡培养过夜，按1:100的比例接种于相同的LB培养基上培养至0D600为0.6-0.8，加IPTG至终浓度为I禮，在16°C下培养0、2、4、6和8 h后收集菌液用于分析总蛋白；4°C、12 000 rpm离心I min,弃上清液,沉淀用100 μ ISDS 凝胶加样缓冲液(Tris-HCl 50 mM,pH 6.8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚蓝 0.1 % ;甘油10 %)重悬，煮沸5 min后，12 000 rpm离心I min，取20 μ I上清液进行SDS-PAGE检测。用考马斯亮蓝R-250染色液(0.1 %考马斯亮蓝R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脱色液(25 %甲醇，6 %冰乙酸)进行脱色后，使用凝胶成像系统进行拍照；结果显示插入有外源片段的重组质粒pGEX-4T-PybHLH经IPTG诱导后，在预期的蛋白分子量约98.9 kD (包括载体上GST蛋白)左右有I条蛋白条带，而未诱导的转化重组质粒和PGEX-4T-1对照质粒未出现这条蛋白带(见图4),表明重组质粒pGEX-4T_PybHLH在大肠杆菌Rosetta (DE3)中诱导表达了 PybHLH蛋白，超声破碎后，SDS-PAGE检测后，发现该蛋白主要在包涵体表达。(9) PybHLH蛋白纯化:包涵体蛋白的割胶纯化，具体内容如下:
1、重组蛋白的大量表达及包涵体的洗涤
a、最优条件大量表达重组蛋白，超声波破碎；
b、离心12000rpm,4°C,30分钟，收集沉淀；
c、3M尿素洗涤沉淀，离心12000rpm，4°C，20分钟，加入适量8M尿素冰上溶解沉淀。2、透析袋电洗脱法纯化蛋白
a、透析袋的预处理:剪取适当长度(10-20cm)的透析袋(截留范围为8 000-12 000Da);置于大体积的2 %(ff/V)碳酸氢钠和I mM EDTA(pH8.0)中，煮沸10 min ;蒸馏水彻底清洗透析袋；置于ImM EDTA(pH8.0)溶液中再次煮沸10 min ;冷却后4 °C保存；
b、取已溶解的蛋白沉淀，加1/5体积5X蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳；
C、电泳结束后将胶放在0.25 M预冷的KCl中，4°C浸泡5分钟使蛋白显白色，蒸馏水冲洗蛋白胶，用刀片从SDS-PAGE电泳凝胶上切下目的蛋白，切成I mm X I mm X I mm的碎片，放入预处理好的透析袋中，注入2 ml SDS-PAGE电泳缓冲液，将透析袋前后封口 ；
d、电泳回收:在水平核酸电泳槽中加入适量SDS-PAGE电泳缓冲液，将装有凝胶的透析袋置入其中，100 V电压，4 °C电泳4-5 h，直至凝胶变透明，说明目的蛋白从凝胶中洗脱出来；
e、透析:洗脱完毕，吸出透析袋内溶液，SDS-PAGE检测(以10μ I的BSA标准蛋白定量)电泳结果(见图5)，鉴定后正确的蛋白溶液装入干净的透析袋中，用预冷的IXPBS溶液(I X PBS (IL)KCl 0.2 g、NaCl 8 g、Na2HP04 1.42 g、KH2P04 0.27 g)添加尿素8M(96 g)、6 M(72 g)、4 M(48 g)、2 M(24 g)、0 Μ于 4 °C下分别透析 3-5 h，其间换透析液2-3次；纯化后的蛋白溶液送抗体制备公司制备PybHLH蛋白特异性抗体，可用于PybHLH蛋白表达水平检测及进行免疫沉淀(IP)、Far Western blotting和染色质免疫共沉淀(ChIP)试验。实施例2 =PybHLH蛋白特异性抗体的Western blotting和转基因烟草的检测 为检测PybHLH蛋白特异性抗体的有效性，使用PybHLH蛋白抗体检测诱导的PybHLH原
核表达蛋白和转基因烟草，具体过程如下:
本实施例使用的仪器为垂直蛋白电泳仪、PVDF膜(millipore), Sem1-Dry TransferCell(BIO-RAD)转膜系统；
试剂为丙烯酰胺、二甲叉丙烯酰胺，10 %APS，TEMED, I X甘氨酸Buffer，I XPBS,I XPBT,脱脂奶粉，Whitman 3MM滤纸等SDS-PAGE和Western试验试剂。、
A、PybHLH原核表达蛋白的Western blotting检测
蛋白样品制备:蛋白样品和1/5体积5X蛋白上样缓冲液(Tris-Cl (pH 6.8)250 mM,SDS 10 %，溴酚蓝0.5 %，甘油50 %，β-巯基乙醇5 %)，95°C加热5 min后置于冰上5_10min,常温，13 000 rpm 离心 I min ；
一、SDS-PAGE
1、75 %酒精清洗玻璃胶板，组装电泳装置；按表I配制分离胶和浓缩胶，倒胶，小心用正丁醇或异丙醇覆盖；
表1:分离胶和浓缩胶的配方
权利要求
1.云南红梨/基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQID N0:3所示或编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白质。
2.权利要求1所述云南红梨基因的原核表达载体pGEX-4T-/^^yZ仏其特征在于:该载体含有/基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，基因的N端含有GST标签。
3.权利要求2的所述云南红梨基因的原核表达载体在制备云南红梨色素合成特异性调控蛋白PybHLH中的应用。
4.权利要求2的所述云南红梨PybHLH基因的原核表达载体在制备PybHLH特异性抗体中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种云南红梨花青素生物合成、毛状体发生发育及盐胁迫调控蛋白PybHLH基因及其原核表达载体，本发明利用RT-PCR技术从云南红梨云红梨1号红色果皮中克隆PybHLH基因，然后构建了原核表达载体pGEX-4T-PybHLH，pGEX-4T-PybHLH载体在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达PybHLH蛋白，纯化后，获得云南红梨PybHLH纯化蛋白，本发明还将PybHLH基因原核表达载体应用在制备PybHLH特异性抗体中，获得的PybHLH特异性抗体还用于研究蛋白质与蛋白质以及蛋白质与DNA的相互作用以及对PybHLH转基因植物的检测，本发明获得的PybHLH特异性抗体中含有谷胱甘肽S转移酶(GST)，获得的PybHLH特异性抗体运用于FarWesternblotting和免疫共沉淀实验研究蛋白质相互作用以及准确分离获得与PybHLH相互作用的蛋白质和DNA片段。
文档编号C07K16/16GK103146709SQ20131008570
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者李昆志, 崔道雷, 张晓东, 樊磊, 陈丽梅, 舒群, 苏俊 申请人:昆明理工大学