专利名称：鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制品技术领域,具体涉及鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法。
背景技术：
鲤鱼carpio),又称鲤拐子、鲤子,隶属于鱼纲,鲤形目，鲤科。其种类多，有红鲤、团鲤、草鲤、荷色鲤、锦鲤、火鲤、芙蓉鲤、荷包鲤等。鲤鱼对水体环境适应性强，是我国淡水养殖传统的优良品种。鲤鱼肠上皮细胞刷状缘膜上的钠/葡萄糖共转运载体(Na+/glUC0Secotransporter, Sgltl)是协助葡萄糖跨膜吸收的主要蛋白，在动物的生命活动中具有重要意义。Sgltl载体蛋白结合I mol葡萄糖和2 mol钠离子,形成Na+-载体-葡萄糖复合物，顺Na+浓度梯度进入细胞，随后由位于基底膜的葡萄糖易化转运载体2 (Glut2)将葡萄糖协助转运至血液。为了研究sWil基因表达和转运活性的调控因素及调控机理，需要高特异性的Sgltl抗体。Sgltl抗体可为Sgltl的组织定位、细胞定位、表达定量、鱼类糖代谢障碍等系列研究奠定物质基础。获得大量有活性的Sgltl蛋白作为免疫抗原是制备高活性抗体的关键。由于鲤鱼Sgltl蛋白是典型的跨膜蛋白，组织含量低，具有14个跨膜域，且其N端和C端位于胞外一侧，因此，不能有效地分离纯化及体外表达超量具有生物活性的Sgltl抗原蛋白成了制备Sgltl抗体的瓶颈。与本发明相关的现有技术一的技术方案是通过蛋白质分离纯化的方法，从组织中直接分离纯化Sgltl蛋白作免疫抗原。其缺点是细胞内蛋白一般含量很低，提取方法复杂，得到的蛋白量相对较少，含杂质多，需要复杂的纯化过程，成本高。与本发明相关的现有技术二的技术方案是通过构建工程菌体外表达外源蛋白作免疫抗原。其缺点是通过构建原核或真核表达系统来表达抗原蛋白，虽然体外表达的效率和表达量比较高，但是这种方法有很多的局限性，很多特殊结构异源基因如富含AT碱基和一些跨膜蛋白的基因很难在微生物中表达或者表达量很低，有的即使表达了但是没有活性。与本发明相关的现有技术三的技术方案是通过无细胞表达系统表达外源蛋白，无细胞表达系统是指以细胞裂解液为基础，加之外援的RNA模板、氨基酸和能量所构成的细胞外表达体系。其缺点是无细胞表达系统可以表达一些跨膜蛋白，但是这项技术在国内外还处于实验室研究水平，技术难度大，成本高，目前还无法实际应用。国内外已经完成了对鲤鱼Sgltl全长的测序工作，包括5'端非翻译区(5' UTR),3'端非翻译区(3' UTR)，一个2000bp左右的开放阅读框(0RF)。经序列同源性分析显示，Sgltl氨基酸序列具有高度保守性，鲤鱼Sgltl氨基酸序列和斑马鱼的相似性最高达90%以上，与兔子的Sgltl氨基酸序列相似性最低(低 于70%)。鲤鱼肠道I基因全长1977 bp,其Sgltl蛋白具有14个跨膜域，所以重组表达sgltl基因全长存在一定的困难。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法。本发明的技术方案是:鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤:(1)克隆鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sgltl的基因，通过分析膜蛋白Sgltl的三维结构、跨膜区和抗原决定簇，利用原核表达具有抗原决定簇的部分Sgltl基因片段作为免疫抗原蛋白代替表达全长基因；(2)构建糖转运载体蛋白Sgltl的基因工程菌；
(3)糖转运载体蛋白Sgltl基因工程菌的诱导表达与鉴定；(4)制备糖转运载体蛋白Sgltl抗原；(5)免疫兔子；(6)采血样测定鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sgltl的效价；(7)颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sgltl的兔抗血清；(8)免疫组织化学方法检测。本发明所述的制备糖转运载体蛋白Sgltl抗原的具体步骤为:将步骤(3)诱导表达的菌液离心，弃上清，按照湿重I g的菌体加6 ml蒸馏水，吹打混匀，再加入与上述菌体混合液等体积的2 X SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴10 min,使蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将分离胶放于0.3 M KCl溶液里染色，显示目的条带，切下分离胶上的目的蛋白条带，放入ddH20里清洗，将胶条剪碎放入塑料培养皿中，冷冻干燥I d，放入研钵中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理盐水溶解蛋白，离心，取上清，用超微量分光光度计检测蛋白浓度。本发明所述的免疫兔子的具体步骤为:按注射要求将蛋白溶液稀释；乳化:耳缘静脉注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，漩涡震荡，皮内注射:1 ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐剂，漩涡震荡；注射方法:第一、二次采用耳缘静脉注射法，第三、四次采用皮内多点注射法；每隔10 d加强免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐齐U，以后加强免疫时用不完全弗氏佐剂。
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本发明所述的颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sgltl的兔抗血清的具体步骤为:步骤(5)中第四次免疫后8 d颈动脉采血，兔子在采血前禁食I d，采集血样收集于经灭菌并不含抗凝剂的离心管中，室温放置2 h，待血液凝块后，4 °C保存使之凝固，析出淡黄色抗血清，将抗血清转移至另一管中，血凝块以1500 rpm离心10 min，吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分装冷冻干燥保存，部分放于4 °C备用。本发明采用表达跨膜蛋白的具有抗原决定簇部分基因片段作为抗原蛋白代替全长基因，解决了跨膜蛋白无法表达的难题，并且该方法简单易行，快速，稳定，成本低，周期短，表达量高，制备的抗体特异性强，效价高。
图1是本发明制备方法的流程图，图2是鲤鱼全长Sgltl基因PCR扩增产物的电泳分析图，图3是鲤鱼部分Sgltl基因Sgltl-P PCR扩增产物的电泳分析图，图4是重组Sgltl-P SDS-PAGE电泳分析图，图5是鲤鱼肠道Sgltl表达的免疫组织化学检测结果图(100 X)。
具体实施例方式结合附图详细描述实施例。
1.鲤鱼肠道Sgltl的克隆与表达 (I) PCR引物设计
利用Primer Primern 5.0设计两对引物,基于本实验室已获得的鲤鱼肠道5^7(7基因的全长序列，设计一对特异性引物sgltl - F和sgltl - R:sgltl - F:5’-ATGGGTGAAGAATATTTTGG-3’sgltl - R:5，-TTAGCCAAAGAAACCATGG-3’
另一对为含I RHindlll双酶切位点的特异性引物5^/i7-F2和5^7i7_G2: Sgltl-VZ:5’-GGAATTCAAACCCATTGACGACAAA-3’ sgltl-G2:5’-CCCAAGCTTGTTTCTCCATAGCGGT-3’ 划线部分分别为IRHindUl的酶切位点。(2)全长基因的克隆与序列分析
采用Trizol法提取鲤鱼前肠组织总RNA，用Oligo (dT) 18引物进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用sgltl - F和sgltl - R引物进行PCR扩增，反应条件为95°C 3 min, 94°C50s, 52.4°C 50s, 72 °C 2min 10s，30 个循环，72°C lOmin，14°C 保温。PCR 产物进行 L0% 琼脂糖凝胶电泳分析。扩增到了大约2000bp左右的DNA片段(图2)，将sgltl PCR扩增产物与pGEM_TVector连接,构建pGEM-T- sgltl重组质粒,连接载体转化至大肠杆菌iE.coli JM109)感受态细胞中，蓝白斑筛选出阳性克隆，将阳性克隆的菌液送至中美泰和生物技术(北京)有限公司测序。结果表明，该核酸片段长度为1977 bp，经序列比对显示，该DNA片段即为鲤鱼肠道的ORF区。采用在线服务器TMHMM Server v.2.0.对5^7 7进行结构分析，具有14个跨膜区域。用BepiPred 1.0在线服务器预测抗原表位发现:Sgltl蛋白有两个抗原决定簇，第I个位于第9-10跨膜区胞外端(396-424)，长度为19个氨基酸(402-420);第2个位于第13-14跨膜区胞外端(546-637)，长度为51个氨基酸(546-596)。本实验采用原核表达系统，表达第13-14跨膜区胞外端，长度为92个氨基酸、具有一个抗原决定簇的多肽。(3)抗原决定簇部分Sgltl基因SglU-P的克隆及重组质粒pMD I^-Tsgltl-P的构建
采用sgm-Y2和Sgiu-G2引物，以PGEM-T- 5^7 7质粒为模板进行PCR扩增，反应条件为 95 0C 3min，94 °C 50s, 52.4 °C 50s, 72 °C lmin，30 个循环，72 °C lOmin, 14。〇保温。在250 bp附近获得一条特异性条带(图3)(实际大小为276 bp)。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与pMD 19-T载体连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，选取阳性克隆菌株扩大培养，用Plasmid Mini Kit I 质粒提取试剂盒提取 pMD 19-T- sgltl-PJ^M.。(4)重组表达质粒ρΕΤ-5^/ 7-Ρ的构建、鉴定
将阳性克隆pMD I^-rXsgltl- 与原核表达质粒pET-32a(+)分别用及^7 !,Hindlll,37 °C双酶切，用凝胶回收试剂盒回收sgltl-P片段和线性化pET-32a(+)质粒，按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系，构建表达质粒pET-sgltl-P,并转化F.coJi'Rosetta,筛选阳性克隆，进行单双酶切鉴定。(5) Sgltl蛋白的诱导表达及鉴定将构建的基因工程菌按1%接种量接种于新鲜的含有AMP的TB培养液中，37 °C, 200rpm振荡培养至菌液OD600达到0.5-0.6，加入IPTG (终浓度I mmol/L), 37 V，200 rpm振荡诱导培养8 h-10 h。诱导表达后的菌液5000 rpm离心3min得到菌体，弃上清，加适量(1(1!120水，与2X上样缓冲液1:1在1.5 ml Eppendorf管中混合。沸水浴10 min, 5000 rpm离心30 S。取35 μ I样品进行SDS-PAGE电泳分析，以未经IPTG诱导的对照菌体样品和诱导的含有空载体pET-32a(+)表达菌体为对照。SDS-PAGE电泳显示I条特异性表达条带，大小约30 kDa (图4)，而阴性对照组在此位置没有特异性条带。2.鲤鱼肠道Sgltl抗血清的制备 (I)融合蛋白的获得、纯化
将诱导表达的菌液离心，弃上清，按照I g菌体(湿重)加6 ml蒸馏水，吹打混匀，再加等体积的2 X SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴10 min,使蛋白变性。进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将分离胶放于0.3 M KCl里染色几分钟，显示目的条带。切下胶上的目的蛋白条带，放入ddH20里清洗。将胶条剪碎放入塑料培养皿中，冷冻干燥I d，放入研钵中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理盐水溶解蛋白，离心，取上清，用超微量分光光度计检测蛋白浓度。( 2 )免疫新西兰长耳兔与采血
将蛋白溶液稀释一定的比例，使终蛋白浓度维持在一定浓度；乳化:耳缘静脉注射:0.8 ml蛋白溶液(约375 μδ/πι1)+0.4 ml完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，漩涡震荡；皮内注射:1 ml蛋白溶液(约200 μδ/πι1)+1 ml不完全弗氏佐剂，漩涡震荡；注射方法:第一、二次采用耳缘静脉注射法，第三、四次采用皮内多点(4-6点)注射法；每隔10 d加强免疫I次(第I次免疫加完全弗氏佐剂，以后加强免疫时用不完全弗氏佐剂)。④第四次免 疫后8 d颈动脉采血(兔子在采血前禁食I d)。采集血样收集于经灭菌并不含抗凝剂的离心管中，室温放置2 h，待血液凝块后，放4 °C过夜，使之凝固，析出淡黄色抗血清，将抗血清转移至另一管中，血凝块以1500 rpm离心10 min,吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分装冷冻干燥保存，部分放于4 °C备用。3.鲤鱼肠道Sgltl抗血清的检测
(1)抗血清效价的测定
采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):将抗原(纯化过的Sgltl融合蛋白)稀释于包被缓冲液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)中，终浓度为10 Pg/ml，每孔加100 μ ，并设立空白对照(只加包被缓冲液)，4°C包被过夜后，用IXPBST[I XPBS + (0.05%)Tween 20]，于室温下洗涤3次，每次3min，然后每孔加100 μ 封闭液(0.5% BSA)，37 °C孵育2 h，IXPBST洗涤3次，加入一抗，血清样品按IO2-1O9倍比稀释于IXPBST中，每孔100 μ1，37 °C孵育I h，I X PBST洗涤3次，加入羊抗兔酶标二抗，酶标二抗按1: 1000稀释于IXPBST中，每孔100 μ1，37 °C，1 h，I X PBST洗涤3次，每孔加100μ 显色液(TMB溶液)，室温放置10-15 min，加入50 μ1，2 mol/L H2SO4终止，酶标仪上判读结果。抗血清效价测定结果见表I。A、B、C三行分别是不同稀释倍数抗血清(序号1-8)的三个平行试验；D行为正常兔子的血清；F行是没有包被抗原的阴性对照。通过酶标仪测定Sgltl抗血清OD450值，采用终点“滴度”表示法判断结果，Sgltl抗血清的效价为1:105。表I ELISA测定抗体效价序号 |l |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8
稀释倍 ο2 ο3 Tot ο5 ~ ο6 To7 ο8 —109
A—0.91001.03200Γ§4730.6173~0.2021 ~1077 0.107Γ 0.0887
B—0.91201.04130 85700.6258~0.2022 ~1099 0.1075~0.0886
C—0.92660.9957(1 85430.6196~0.1991 (Γ 089 0.1073~ 0.0886
P—0.14150.09250Γ07950.0762~0.0813 ~0769 0.0748~ 0.0760
F |θ.0803 |θ.0802 I I I I I I
(2)Sgltl抗体的免疫组化检测
采用石蜡包埋法包埋鲤鱼的前肠，进行石蜡切片，片厚5 Mffl, 1%的蛋清展片，进行脱蜡复水，免疫组织化学染色，苏木精伊红复染，脱水透明及树胶封片。免疫组织化学染色的步骤是:内源性过氧化物酶阻断、羊血清封闭、一抗孵化、二抗孵化、DAB显色、终止。研究表明，Sgltl主要在小肠绒毛刷状缘细胞表达。免疫组织化学方法鉴定，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗进行染色，显微镜下观察Sgltl抗体在鲤鱼的前、中、后肠中的结合情况(图5，a肠道，b肠道的阴性对照染色)。Sgltl主要定位于肠刷状缘，明显区别于阴性血清染色的细胞。本发明采用表达跨膜蛋白的具有抗原决定簇部分基因片段作为抗原蛋白代替全长基因，解决了跨膜蛋白无法表达分难题，该方法简单易行，快速，稳定，成本低，周期短，表达量高，制备的抗体特异性强，效价高。
SEQUENCE LISTING〈110〉河南师范大学
〈120〉鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl的兔抗血清制备方法 〈160〉 I
<170> Patentin version 3.3
〈210〉 I
〈211〉 833
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360 catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420 ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480 gctgatatcg gatccgaatt caaacccatt gacgacaaac atctgtacag gctctgctgg 540 agtttgagga acagcactga ggagaggatt gatctggaaa aagatgactg gactgaaaat 600 caggattcag attctgtgca aacagaagag gtgcgcaagg atccaagctg ttggaagaag 660 gcctataact ggttctgcgg ttttgatcaa ggcaatgcac ctaaactgac taaagaagag 720gaggcagagt tgaatttgaa gctcacagac accactgaga aaccgctatg gagaaacaag 780cttgcggccg cactcgag ca ccaccaccac caccactgag atccggctgc taa83权利要求
1.鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤:(I)克隆鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sgltl的基因，通过分析膜蛋白Sgltl的三维结构、跨膜区和抗原决定簇，利用原核表达具有抗原决定簇的部分Sgltl基因片段作为免疫抗原蛋白代替表达全长基因；(2)构建糖转运载体蛋白Sgltl的基因工程菌；(3)糖转运载体蛋白Sgltl基因工程菌的诱导表达与鉴定；(4)制备糖转运载体蛋白Sgltl抗原；(5)免疫兔子；(6)采血样测定鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sgltl的效价；(7)颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sgltl的兔抗血清；(8)免疫组织化学方法检测。
2.根据权利要求1所述的鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中制备糖转运载体蛋白Sgltl抗原的具体步骤为:将步骤(3)诱导表达的菌液离心，弃上清，按照湿重I g的菌体加6 ml的蒸馏水，吹打混匀，再加入与上述菌体混合液等体积的2XSDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴10 min，使蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将分离胶放于0.3 M KCl溶液里染色，显示目的条带，切下分离胶上的目的蛋白条带，放入ddH20里清洗，将胶条剪碎放入塑料培养皿中，冷冻干燥I d，放入研钵中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理盐水溶解蛋白，离心，取上清，用超微量分光光度计检测蛋白浓度。
3.根据权利要求1所述的鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法，其特征在于所述的步骤(5)中免疫兔子的具体步骤为:按注射要求将蛋白溶液稀释；乳化:耳缘静脉 注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，漩涡震荡，皮内注射:1ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐剂，漩涡震荡；注射方法:第一、二次采用耳缘静脉注射法，第三、四次采用皮内多点注射法；每隔10 d加强免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐剂，以后加强免疫时用不完全弗氏佐剂。
4.根据权利要求1所述的鲤鱼糖转运载体蛋白Sgltl兔抗血清的制备方法，其特征在于所述的步骤(7)中颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sgltl的兔抗血清的具体步骤为:步骤(5)中第四次免疫后8 d颈动脉采血，兔子在采血前禁食I d，采集血样收集于经灭菌并不含抗凝剂的离心管中，室温放置2 h，待血液凝块后，4 °C保存使之凝固，析出淡黄色抗血清，将抗血清转移至另一管中，血凝块以1500 rpm离心10 min,吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分装冷冻干燥保存，部分放于4 °C备用。
全文摘要
本发明公开了一种鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法。本发明的技术方案要点为鲤鱼糖转运载体蛋白Sglt1兔抗血清的制备方法，包括以下步骤(1)克隆鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的基因；(2)构建糖转运载体蛋白Sglt1的基因工程菌；(3)糖转运载体蛋白Sglt1基因工程菌的诱导表达与鉴定；(4)制备糖转运载体蛋白Sglt1抗原；(5)免疫兔子；(6)采血样测定鲤鱼肠道糖转运载体蛋白Sglt1的效价；(7)颈动脉采血制备糖转运载体蛋白Sglt1的兔抗血清；(8)免疫组织化学方法检测。本发明采用表达跨膜蛋白的具有抗原决定簇部分基因片段作为抗原蛋白代替全长基因，解决了跨膜蛋白无法表达的难题。
文档编号C07K16/18GK103204932SQ20131008452
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者聂国兴, 张建新, 王俊丽, 侯彩霞, 闫潇, 张新胜 申请人:河南师范大学