专利名称：使用核糖体蛋白提取物(rpe)的寄生虫病如利什曼病的诊断的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用核糖体蛋白提取物(RPE)的寄生虫病如利什曼病 (Leishmaniasis)的诊断方法。
背景技术：
犬内脏利什曼病(Canine Visceral Leishmaniasis, CVL)是一种重要的在地中海盆地、中东和拉丁美洲国家00)出现的人畜共患病。这种严重疾病在地中海地区、中东和亚洲国家是由Leishmania infantum引起的，而在拉丁美洲是由L. chagasi引起的00， 21)。由于它们的基因型相关性，这两个在不同的洲引起CVL的物种可以认为是相同的 (26)。感染后的犬可能发展为不同形式的疾病；无症状(asymptomatic)，轻症状 (oligosymptomatic)或有症状(symptomatic) (4)。有症状的感染导致死亡，它的临床表现包括皮肤改变，如脱发，皮炎，甲弯曲(onychogryphosis) (3，11)，以及具有肾，肝和脑改变的内脏表现(18二8)。一些受感染的犬保持无症状或发展为轻微的温和症状而被划分为多症状(4)。由于感染的犬(即使是无症状的)是人类感染的寄生虫的主要的作为宠物饲养的携带者(1)，所以CVL不能被仅仅认为是一种兽医病。因此，为了减少Leishmania从犬到人的传播，有必要尽早对犬利什曼病进行诊断。在无症状、轻症状及有症状的感染的犬0，9，34)中，抗Leishmania的特异性抗体的存在使包括免疫荧光抗体检测(IFAT)、免疫印迹、免疫色谱检测，和酶联免疫吸附检测 (ELISA)的血清学检测得以发展(在中综述)。使用基于天然的可溶性Leishmania 抗原(SLA)的ELISA分析对CVL的诊断具有较高的敏感性，但由于Leishmania和其它病原性原生动物(16)之间的抗原相关性，因而具有较低的特异性。作为发展用于CVL的特异性血清学检测的策略，以重组蛋白的形式获得了不同的寄生虫抗原(5，10二4)。然而，由于观测到单个的感染的犬对不同的寄生虫抗原在体液免疫反应(19，31)中存在高可变性，因此基于重组蛋白的有效诊断可能需要一个重组蛋白的混合物或含有若干个非相关的寄生虫抗原(6，31，36)的人工设计的蛋白(chimerical protein)。可以通过由免疫印记杂交分析的天然寄生虫的碎片或从所述寄生虫纯化出的制品的使用来发展CVL的特异性诊断。例如，以及开发了基于可溶性Leishmania抗原(SLA)的ELISA检测07，31)。但是，这种基于SLA的检测对诊断无症状利什曼病还不够特异。此外，来自患有不同于利什曼病的其它寄生虫病的受试者的血清，会在基于SLA的检测中产生假阳性反应。因此，仍需要对寄生虫病如利什曼病的不具有现有方法的缺陷的改进的诊断方法。
发明内容
本发明中，我们展示了 RPE，尤其是Leishmania的RPE (LRPE)，可以方便地用于寄生虫病如利什曼病的诊断这种新的诊断方法比已知的诊断方法如示例中证明的基于SLA
3的方法更特异。这种新方法允许了利什曼病症状前诊断，为了预防或减少利什曼原虫从犬到人的传播，这是至关重要的。本发明进一步说明如下。用途第一方面，提供了核糖体蛋白提取物(RPE)在诊断受试者中的寄生虫病中的用途。根据本文所定义的，核糖体蛋白提取物是使用出现于受试者中时引起寄生虫病的寄生虫细胞，通过进行如下步骤得到的a.将寄生虫细胞与裂解缓冲液混合， b.将所得混合物离心，得到细胞质提取物，c.从得到的细胞质提取物中制备核糖体蛋白提取物。在步骤a中，寄生虫优选是指原生动物。优选的寄生虫在本文中随后有定义。更优选地，原生动物处于前鞭毛体阶段(promastigote stage) 0技术人员公知用于制备所需数量的RPE大概需要的寄生虫细胞的数量。典型地，为了制备500微克的RPE，要使用3X109 个寄生虫细胞。裂解缓冲液是可以分解至少部分的寄生虫细胞的缓冲液。至少部分优选是指至少50 %的细胞，或至少60 %，70 %，80 %，90 %或100 %。一种优选的裂解液含有非离子表面活性剂。用Nonidet P 40 (NP40)作为非离子表面活性剂可以得到好的效果。然而， 其他非离子表面活性剂也可以使用。一种优选使用的裂解液(缓冲液A)如下10mM Tris HCl，pH 8. 0,150mM NaCl, 1. 5mM MgCljP 0. 5% NP40 (Roche)，以及优选添加蛋白酶抑制剂， 如 PMSF ImM, Leupeptin 8 μ g/ml, Aprotinin 4 μ g/ml 禾口 Pentatin 8 μ g/ml)。典型地，用印pendorf移液器轻轻地将适量的寄生虫细胞(IO9个细胞/ml缓冲液A)与该裂解缓轻轻混合ο在步骤b中，至少对步骤a得到的混合物施加一个步骤的离心。通常地，第一个离心步骤在3000g下进行2分钟。优选将得到的上清液在4°C下再次进行13000g下15分钟的离心1次或2次。在步骤c中，将得到的上清液用于制备如05)中所述的RPE。简言之，将得到的上清液于在4°C下90000rpm下高速离心30分钟。使用的转子优选为Beckman TL100. 3转子。 得到的沉淀为粗核糖体颗粒，将沉淀在合适的缓冲液如缓冲液B(20mM Tris-HCl, pH 7.4， 500mM AcNH4, IOOmM MgCl2, 5πιΜβ -巯基乙醇)中重悬浮，并且通过合适的缓冲液如缓冲液A 中不连续的蔗糖梯度00/40% )在4°C下90000rpm下离心。这里同样地，使用的转子优选TL100.3转子。获得的沉淀含有核糖体。优选将这种沉淀溶解在PBS (磷酸盐缓冲液) 中，超声处理并在-70 0C下保存。核糖体蛋白是保守的细胞质蛋白。因此，根据本文所定义的RPE可以从任何真核生物中制备，所述真核生物可以为植物或动物，所述真核生物可以为哺乳动物、爬行动物、 鱼类、昆虫或任何其它携带染色体的生物，如原生动物。RPE优选从与疾病密切相关的生物中得到，优选从在进化树中的引起寄生虫病的生物中得到。因此，特别注意的是，用于寄生虫病治疗的RPE的来源为原生动物，如疟原虫，以及具体地为锥虫科的成员，更具体地为锥虫原生动物Leishmania或Trypanosoma中的不同的种。有20多个已知的Leishmania 中的种，包括Leishmania亚属和Viania亚属；Leishmania亚属包括L. major复合组、
4L Donovani 复合组禾口 L. mexicana 复合组；L. major 复合组包括 L. major ；L Donovani 复合组包括 L. chagasi、L. donovani 禾口 L. infantum ；L. mexicana 复合组包括 L. amazonensis 禾口 L. mexicana ；Viania 亚属包括 L. braziliensis 复合组禾口 L. guyanensis 复合组； L. braziliensis 复合组包括 L. braziliensis 禾口 L· peruviana ；L. guyanensis 复合组包括 L. guyanensis 禾口 L· panamensis0 Plasmodium 的种中特别注意的是Plasmodium falciparum 和Plasmodium vivax。在一种优选实施方式中，RPE是从Leishmania的种中得到的，优选是从Leishmania major和/或Leishmania infantum中得到的。在另种优选实施方式中， PRE是从Plasmodium的种中得到的。技术人员知晓，RPE也可以通过将来自本文所述的若干不同生物的RPE来得到。由于RPE含有大量的不同抗原，本发明的RPE诊断方法中的用途相比给定蛋白的用途是极有很吸引力的。这些蛋白中的每一种都能潜在地诊断出受试者中的免疫反应的存在。此外，也存在与抗原A有反应，但与抗原B没反应的个体，反之亦然。 因此，由于既然包含了大量不同的抗原，本文中所用的RPE是用来在广泛的受试者群体中使用的。在一种优选的实施方式中，RPE含有至少一种核糖体蛋白，和/或核糖体蛋白的至少一种抗原，和/或核糖体蛋白的至少一个蛋白片段。在一种更优选的实施方式中，RPE含有至少两种核糖体蛋白，和/或核糖体蛋白的至少两种抗原，和/或核糖体蛋白的至少两个蛋白片段。本文中所定义的蛋白片段是指相应的核糖体蛋白的含有至少2、3、5、7、10、15、 20、25、30或更多个的连续的氨基酸的片段。在另一种实施方式中，本文中所定义的RPE不含有Leishmania infantum的酸性核糖体蛋白PO和/或来源于Leishmania braziliensis 的核糖体抗原LbeF4A，或不由Leishmania infantum的酸性核糖体蛋白PO和/或来源于 Leishmania braziliensis的核糖体抗原LbeF4A组成。在另一种实施方式中，本文中所定义的RPE不含有如EP 824699所公开的来源于Leishmaniasis chagasi的酸性核糖体蛋白抗原LcPo的抗原决定簇或不由如EP 824 699所公开的来源于Leishmaniasis chagasi的酸性核糖体蛋白抗原LcPo的抗原决定簇组成。更优选地，RPE不含有LcPo的C末端的17 个氨基酸或不由LcPo的C末端的17个氨基酸组成=LcPo的C末端的17个氨基酸为EP824 699的SEQ ID NO 2所示的LcPo的氨基酸306-322，LcPo的C末端的17个氨基酸也如序列表中的SEQ ID NO 1所确定。本发明的一个优点是它实现了对广泛的寄生虫病谱的特异性和早期的诊断。其中，寄生虫病的一个实例为利什曼病。在一种优选的实施方式中，寄生虫病为利什曼病或疟疾。更优选地，寄生虫病是由Leishmania的种或Plasmodium的种引起的。在进一步优选的实施方式中，引起寄生虫病的种不同于RPE来源的种。详细地，由Leishmania属的一个种引起的利什曼病可以通过基于来源于另一个Leishmania的种的RPE的组合物的使用而得到诊断。在一种实施方式中，由L. major引起的利什曼病用含有来源于L. infantum的RPE 组合物得到了成功地诊断。备选地，其它寄生虫病，如疟疾，可以用基于其它种的RPE组合物得到成功地诊断，例如基于L. infantum的RPE。在本发明的文本中，受试者(subject)是指人或动物。本发明范围内的动物包括哺乳动物，优选为人或犬。原则上，使用本发明可以诊断任意的受试者。诊断方法可在受试者中按需要经常地使用。优选地，受诊断的受试者为疑似有曾经感染引起所述寄生虫病的所述寄生虫的风险的受试者。疑似有曾经感染所述寄生虫的风险的受试者可能生活在疫区或曾经到过疫区。疫区包括从阿尔及利亚到沙特阿拉伯、肯尼亚、苏丹、埃塞俄比亚的北非国家。疫区还包括欧洲南部地中海沿岸国家、西班牙、法国、希腊等。还包括美洲中部(所有国家)和南部巴西、委内瑞拉、秘鲁、玻利维亚、哥伦比亚、阿根廷北部、巴拉圭、乌拉圭； 亚洲中部到西南部印度、伊朗、伊拉克、蒙古、尼泊尔、孟加拉国。在本发明的文本中，在此所定义的用途优选是指体外或体内的用途。用途优选是指在来自所述受试者的样品上进行的用途。优选的样品包括血液，血清，血浆，唾液，脑脊液或尿。更优选地，所述样品是从受试者中得到的血液或血清样品。在一种优选的实施方式中，在所述寄生虫病的症状出现之前得到诊断结论，即所谓的症状前诊断或无症状受试者的诊断。在本文中，“症状前”优选是指在首次症状出现前的至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少 9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天或更长时间。与寄生虫病如利什曼病相关的首次症状或首次临床表征可以选自下列发热、脾肿大、肝肿大、淋巴结病变、结膜炎、皮炎、甲弯曲、角膜结膜炎、情感冷漠和精神萎顿。这些症状大多数可以通过外部体检得到初步检查。结膜炎、皮炎、甲弯曲、角结膜炎各自为皮肤改变的表现形式。与利什曼病相关的首次症状优选为淋巴结病变。它可以通过外部体检如触诊得到检查。在另一种优选的实施方式中，在所述寄生虫病的症状部分出现之前得到诊断结论，即所谓的轻症状受试者的诊断。在本文中，“轻症状”优选是指具有如上所定义的症状中的至多3个的受试者。在另一种优选的实施方式中，在所述寄生虫病的症状全部出现之前得到诊断结论，即所谓的有症状受试者的诊断。在本文中，“有症状”优选是指具有如上所定义的症状中的至少4个的受试者，如上所定义的症状包括如上所定义的皮肤改变的表现形式。技术人员知晓，最重要的诊断类型是无症状受试者的诊断，这是因为如果他们在这一阶段得到诊断结论，将有助于防止疾病的进一步蔓延，无症状的受试者也可以得到更有效地帮助和治疗。方法在第二个方面，提供了一种用RPE诊断受试者中的寄生虫病的方法，该方法包括测定在从受试者得到的样品中是否存在识别RPE的抗体。本发明的优选方法是本发明优选在体外或体内进行的优选用途。在前文中已经给出了定义。在一种优选的方法中，RPE为组合物。RPE在前文中已有定义。在优选的实施方式中，在所述组合物出现其它化合物。备选地，在所述组合物不出现其它化合物。在一种优选的实施方式中，其它化合物与RPE—起依次或同时使用，以提高该方法的特异性。例如，可以方便地使用能够区分无症状、轻症状或有症状的受试者以及接种疫苗的受试者的其它化合物。更优选地，在单一的组合物中，这些化合物不会与RPE—起出现。例如，可以使用引起寄生虫病如利什曼病的寄生虫的其他的非相关抗原(31)。另一个例子是使用含有若干寄生虫抗原(6，36)的多蛋白。优选的抗原包括组蛋白或它的片段或编码所述组蛋白的核酸分子。更优选地，组蛋白为如EP 1 687 023中所确定的H2A，H2B， H3和H4。组蛋白H2A，H2B, H3和H4是高保守的核蛋白，其序列在本领域是公知的，例如参见Requena等，Trends in Parasito 1. QOOO) 16 :对6。优选地，所述组蛋白来自在进化树中与致病生物较近的生物。因此，用于治疗寄生虫病如利什曼病的组蛋白的特别优选的来源为原生动物，特别是锥虫科的成员，例如疟原虫，更具体地是锥虫原生动物Leishmania的不同的种。在更优选的诊断方法中，当出现了可检测到的量的识别RPE的抗体时和/或当出现了所述抗体的数量的升高时，诊断结论为寄生虫病。在对照或健康的受试者中，所述抗体一般无法检测到。检测所述抗体存在时通过使用是本领域技术人员公知的的方法进行的，例如 ELISA。优选的检测方法在标题为试验的部分有描述。识别RPE的抗体是指存在至少一种抗体，该抗体至少能够识别出一种在RPE中存在的化合物。所述化合物可以为核糖体蛋白或核糖体蛋白片段或核糖体蛋白的核糖体抗原。检测法在第三个方面，提供了用于诊断受试者中的寄生虫病的一种检测装置或一种检测法，其中所述装置或所述检测法包括RPE。特异性地识别RPE的抗体可以通过本领域技术人员公知的任意的标准方法得到检测(例如，参见，Harlow和Lane，Antibodies =A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988,通过弓|用并入至Ij本文)。合适的方法包括亲和层析共电泳(ACE)检测法和(酶联免疫吸附检测法)ELISA。优选地，所述检测法包括ELISA。以下更展开地描述了若干中检测法。在一种优选的实施方式中，检测法包括用固定在固体支持物的RPE来结合或去除样品中的抗体。然后可以通过使用与抗体/RPE复合体结合并含有检测报告基团的检测试剂来检测该结合的抗体。合适的检测试剂包括可以结合抗体/RPE复合体的抗体，和标记有报告基团的自由多肽(如在半竞争检测法中)。备选地，可以使用竞争检测法，在竞争检测法中，同RPE结合的抗体用报告基团标记，并且在RPE与样品孵育后可以同固定化的RPE结合。样品成分对标记抗体同RPE结合的抑制程度指示了样品与固定化RPE的反应。RPE可以附着在固体支持物上，所述固体支持物可以为本领域技术人员公知的任何材料。例如，支持物可以为微孔板中的检测孔或硝酸纤维素膜或其它合适的膜。备选地， 支持物可以为珠或盘，如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持物也可以为磁颗粒或光纤传感器，例如那些已公开的支持物，例如，在美国专利号5，359,681 中公开的。RPE可以使用本领域技术人员公知的各种技术结合在固体支持物上。在本发明的文本中，术语“结合”既指非共价联合，如吸附，又指共价结合(即，抗原和在支持物上的功能基团的直接结合，或通过交联剂的方式的结合)。优选通过在微孔板中的孔的吸附或膜的吸附的结合。这种情况下，可以通过在合适的缓冲液中，使RPE与固体支持物接触合适的固定时间来达到吸附。所述接触时间随温度而变化，但典型地为1小时到1天。在一般情况下，将塑料微孔板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)中的孔与10纳克到1克，优选100纳克的 RPE接触，就足够结合合适数量的RPE。RPE—般可以通过与支持物和双功能试剂的第一反应实现与固体支持物的共价结合，该双功能试剂同支持物和功能基团都反应，功能基团如多肽上的羟基或氨基基团。例如，RPE可以通过苯醌的使用，或通过支持物上的醛基与多肽上的胺和活性氢的缩合来结合到具有合适的聚合物包被的支持物上(例如，参见Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook (1991)，A12-A13)。在特定的实施方式中，检测法为酶联免疫吸附检测法(ELISA)。该检测法可以通过如下方式进行将固定在支持物上的RPE与样品进行第一接触，以使样品中对RPE特异的抗体与固定化的RPE结合，支持物通常为微孔板。然后将未结合的样品从固定的RPE中去除， 加入能够与固定的抗体-RPE复合物结合的检测试剂。然通过使用适用于特定检测试剂方法，测定与固体支持物结合的检测试剂的数量。一旦RPE被固定在支持物上，通常将支持物上剩余的蛋白结合位点封闭。可以使用本领域技术人员公知的任何合适的封闭试剂，如牛血清白蛋白(BSA)或吐温20(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州)。然后将固定的RPE同样品一起孵育，从而使得抗体(如果样品中存在)同RPE相结合。在孵育前，可以用合适的稀释剂如磷酸盐缓冲液(PBQ来稀释样品。 在一般情况下，适当的接触时间(即孵育时间)是足够允许检测样品中抗体是否存在的时间。优选地，接触时间足以达到结合和未结合之间至少有95%的平衡的结合的水平。本领域普通技术人员公知，达到平衡所需的时间，可通过检测发生在一段时间内的结合的程度来容易地确定。室温条件下，约30分钟的孵化时间是足够的。然后可以通过用合适的缓冲液清洗所述固体支持物来去除未结合的样品，所述缓冲液例如含0. 吐温20tom的PBS。然后可以将检测试剂加到固体支持物上。合适的检测试剂为能够结合固定抗体-RPE复合体并能够通过本领域公知的多种方法检测出来的化合物。优选地，所述检测试剂含有与报告基团连接的结合剂(如，例如，Protein A.Protein G、免疫球蛋白、凝集素或自由抗原)。优选的报告基团包括酶(如辣根过氧化物酶)、底物、 辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。结合剂与报告基团的连接可以通过使用本领域普通技术人员公知的标准方法来实现。常规的连接多种报告基团的结合剂可以从多种渠道购买得到(例如，Zymed实验室，San Francisco, CA和Pierce， Rockford, IL)。然后将所述检测试剂同固定的抗体RPE复合物孵育足够的时间，以检测固定的抗体。合适的检测时间通常可由制造商的使用说明得到，或由通过分析一段时间内发生的结合的水平来测定。然后去除未结合的检测试剂，结合的检测试剂通过报告基团得到检测。检测报告基团的方法依赖于报告基团的属性。对于放射性基团，一般适用的是闪烁计数或放射自显影方法。光谱方法可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以通过耦合了不同的报告基团(通常是一个放射性的荧光基团或是酶)的亲和素的使用得到检测。这些被。酶报告基团可以通过底物的添加(通常维持一段特定的时间)，和随后的光谱或对反应产物的其它分析得到检测。为了确定样品中寄生虫病如利什曼病的特异性的抗体是否存在，将从仍然结合在固体支持物上的报告基团检测而来的信号，与对应于预先确定的截点值进行比较。在一种优选的实施方式中，所述截点值优选为当固定化的RPE与来自未感染的受试者的样品孵育时得到的平均信号。一般地，认为产生比预先确定的截点值高出标准偏差的三倍的信号的样品是阳性的(即，与RPE反应)。在另一种备选的优选实施方式中，根据Mckett等人 Clinical Epidemiology :A Basic Science for Clinical Medicine, p. 106-7(Little Brown and Co. , 1985)中的方法,所述截点值通过使用Receiver Operator Curve法来确定。简要地说，在这种实施方式中，截点值可以通过配对应于每个可能的用于诊断检测结果的截点值的真阳性率(即，敏感性)和假阳性率(100% -特异性)的作图来确定。图上的最接近左上角的截点值(即，包括了最大区域的值)的截点值是最精确的截点值，当样品产生高于通过这种方法确定的截点值的信号时，可以认为该样品为阳性。备选地，截点值可以沿着图移动到左边，以减小假阳性率，或是移动到右边，以减小假阴性率。在一种相关的实施方式中，检测法以流体或条带检测方式来进行，其中，RPE固定在膜例如硝酸纤维素膜上。在流体检测方式中，随着样品经过膜，样品内的抗体与固定的RPE结合。然后在含有所述检测试剂的溶液流过膜的时候，检测试剂(例如，Protein Α-colloidal gold)与抗体-RPE复合体结合。然后可以按照如上所述进行结合的检测试剂的检测。在条带检测方式中，膜的结合RPE的一端浸入到含有样品的溶液中。样品沿膜穿过含有检测试剂的区域并向固定多肽的区域移动。RPE的检测试剂的浓度指示了抗体的存在，该抗体对样品中可以引起寄生虫病如利什曼病的寄生虫抗原有特异性。典型地，检测试剂的浓度在那个位置中可以产生图案，比如线形，并且是肉眼可读的。这种图案的缺失指示阴性结果。一般地，如上所述，选择固定在膜上的RPE的量，以使得当样品含有足够在ELISA 中产生阳性信号的水平的抗体时，能产生肉眼可见的图案。优选地，在膜上固定的RPE的量为25ng到500ng。这种检测可以典型地使用极小量的受试者的血清或血液来进行。任何受试者或医生都能在办公室/家庭使用这种装置，并可以按需要经常地重复使用这种装置和测试法。通常地，在测试法中使用另外的分子作为阳性或阴性对照。一种典型的阳性对照可以为识别已知在待检测样品中存在的分子的抗体。典型的阴性对照可以为识别已知在待检测样品中不存在的分子的抗体。在本文件和它的权利要求书中，动词“含有”和它的变化形式以它的非限制性含义使用，意思是下面是文字是被包括的，但并不排除没有具体提到的项目。此外，动词“组成” 可以被“基本上组成“取代，意思是本文中定义的产品、检测装置、方法或用途可能分别包括额外的组件、额外的步骤、额外的成分、这些不改变本发明的独有特性。此外，不定冠词“一个”并不排除超过一个或多个元素的可能性，除非文意需要有一个并只有一个元素。因而不定冠词“一个”通常意味着“至少有一个”。在本说明书中所引用的所有的专利和文献参考均以它们整体引用的方式并入本文。本发明通过下列实施例进一步说明，这些实施例并不构成对本发明的范围的限制。
图1、(A)L. infantum核糖体蛋白在线性10-14%梯度SDS-PAGE凝胶中电泳，转移到硝酸纤维素膜上然后和健康犬的血清(条带1-3)、自然感染L. infantum并有症状CVL犬的血清(条带4-13)杂交。血清各自1 200稀释稀释后使用。(B)L. infantum核糖体蛋白的2D-PAGE。左图的为代表性的银染色凝胶。将相似的凝胶转移至硝酸纤维素膜上，并与 (A)中使用的CVL血清(1 200)的混合物进行杂交。图2、LRP和SLA诊断的敏感性比较。(A)有症状CVL犬的血清和对照血清对LRP
9和SLA的ELISA反应性。(B)轻症状CVL犬的血清和无症状CVL犬的血清对LRP和SLA的 ELISA反应性。展示了 CVL血清的平均值。虚线表示截点值，该截点值定义为平均光密度值加上健康对照血清的标准误差值的三倍值。图3、LRP和SLA诊断的特异性比较。(A)感染T. gondii或者T. cruzi的犬的血清对LRP和SLA的ELISA反应性。(B)注射了 Leishmune疫苗@或Leishtec 疫苗后犬的血清对LRP和SLA的ELISA反应性。展示了 CVL血清的平均值。虚线表示截点值，该截点值定义为平均光密度值加上健康对照血清的标准误差值的三倍值。
具体实施例方式实施例材料和方法寄生虫 Leishmania chagasi (M0M/BR/1970/BH46)和 L. infantum(MCAN/ES/1996/ BCN/150，MON-1)在和pH值为7. 4的条件下在添加了 20%热灭活胎牛血清(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，美国)，20mM的L-谷氨酰胺，200U/mL的青霉素，100g/mL的链霉素和50克/毫升的庆大霉素的khneider’ s培养基(Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，美国)
中培养。抗原的制备如已经描述过的(12)，SLA是从在液体培养基中传代若干次后的 L. chagasi和L. infantum的稳定期前鞭毛体中制备的。简单地说，将5毫升的2 X IO8个/每毫升的前鞭毛体用冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBQ洗3次。经过重复6个循环的冻融后38MHz 下超声(超声波处理器，GE)(600)处理5个循环，每个循环30秒，悬浮液在4°C和8，OOOg下离心30分钟，收集含有SLA的上清。用Bradford法(7)测定蛋白浓度，并将500 μ L的分装在-70°C下存储。LRP是从前文所述的L. infantum的对数期前鞭毛体中制备的。简单地说，收获 IXlO9的前鞭毛体，用预冷的PBS洗两次，重悬于1毫升NP40裂解液(IOmM Tris HCl，pH 8. 0，150mM NaCl，1. 5mM MgCl2JPO. 5%NP40)用移液器上下吹打10次。裂解后，样品在4°C 和3000 Xg条件下离心2分钟，沉淀细胞核。上清在4°C和13000 Xg条件下离心15分钟共两次。经过纯化细胞质上清液通过贝克曼TL100. 3转子在4°C和90，OOOrpm条件下高速离心 30 分钟。粗核糖体沉淀在缓冲液 AQOmM Tris-HCl,pH 7. 4,500mM AcNH4, IOOmM MgCl2, 5mM β-巯基乙醇)中重悬浮，并通过TL100. 3转子在4°C和90000rpm条件下离心通过缓冲液A中的不连续蔗糖梯度00/40% )。血清样品血清样品是在西班牙和巴西收集的。来自西班牙的CVL血清样品采集于埃斯特雷马杜拉地区的观只临床上有症状的犬。L. infantum感染的动物在西班牙卡塞雷斯地埃斯特雷马杜拉大学兽医学院寄生虫学系进行临床和分析评估。当出现三种或多种以下症状时，认为动物是有症状的体重减轻、脱毛、淋巴结肿大、甲弯曲、肝肿大、结膜炎以及鼻子、尾巴和耳朵边缘的剥脱性皮炎。当用间接免疫荧光法进行测试时，所有血清都呈阳性，通过在腿弯部和肩胛骨前的淋巴节点直接观察证实了寄生虫的无鞭毛体形式的存在。 对照血清取自埃斯特雷马杜拉大学寄生虫学系的8只健康动物。使用的血清标本取自巴西米纳斯吉拉斯贝洛奥里区的58只L. chagasi感染的犬 (44只临床上有症状的，7只轻症状的和7只无症状的)的。如上所述，当出现三种或更多种的临床症状时，认为动物是有症状的；当出现一种或两种症状时，为轻症状；当不出现症状时，为无症状。如上所述，当骨髓抽出物的Giemsa染色涂片中观察到无鞭毛体时，或者当在外周血或骨髓抽出物的培养物中辨认出有前鞭毛体时，VL的诊断得到确认。来自巴西犬的血清由Evaldo Nascimento和Maria Norma Melo (寄生虫学系，米纳斯吉拉斯州联邦大学，贝洛奥里藏特，米纳斯吉拉斯，巴西)提供。取自生活在VL疫区，但没有犬利什曼病的临床症状或疑似，且寄生虫学和血清学检测后呈阴性的47只犬的血清组成了对照组。将具有其它寄生虫感染的犬的14个血清样品用于分析交叉反应，所述其它寄生虫感染如下 Toxoplasma gondii (η = 5)禾口 Trypanosoma cruzi(n = 9)。在实验中使用了血清标本禾口接种Leishmune (η = 18)或Leishtec (η = 23)疫苗的健康犬的血清标本。ELISA法在100 μ L的包被缓冲液和pH为9.6且4°C下，将微孔免疫检测板用 L. infantum 或 Lchagasi 的 SLA，或 L. infantum 的 LRP (每一个 0. 5 微克 / 孔)包被 18 个小时。通过滴定曲线以确定要使用的最优的蛋白浓度和抗体稀释度。空白结合位点通过 PBS-0. 05%的吐温20 (PBST)和3%的酪蛋白溶液在37°C下封闭2小时。经过PBST洗涤三次后，酶标免疫检测板在37°C下用100 μ L的犬血清孵育1小时。血清标本在PBST和 0.3%的酪蛋白中1 200稀释。酶标免疫检测板洗七次后用1 10，000的连接辣根过氧化物酶的抗犬IgG抗体(Sigma公司，美国圣路易斯)孵育。反应是通过pH值为5. 0的过氧化氢，orto-苯二胺和柠檬酸-磷酸缓冲液在黑暗中孵化30分钟，通过添加20 μ L过氧化氢2Ν终止反应来曝光的。光密度通过ELISA微孔板分光光度计(Molecular Devices, Spectra Max Plus. Concord, ON, Canada) ^t 492nmWestern blot 在 SDS-PAGE 中，将 L. infantum 的 LRPs (15 μ g)在 Laemmli，s 的缓冲液中重悬浮，并使用BioRad公司的蛋白电泳minigel系统(Hercules，CA，USA)在带有制备梳的10-14%的梯度的SDS-PAGE凝胶中解析。在2D-PAGE中，L. infantum的LRPs溶解于 200 μ 1 的裂解液(0. 5% Nonidet Ρ40, ImM EDTA，ρΗ8· 0，0. ImM PMSF, IOmM Tris HCl,pH 7. 4，和ImM DTT)并通过同等体积的苯酚萃取。存在于有机相中的蛋白用5倍体积的醋酸铵缓冲液(溶解于甲醇中的0. IM醋酸铵)沉淀，并用80%丙酮洗涤三次。干燥的沉淀重新悬浮于水化缓冲液中(7Μ 尿素，2Μ 硫脲，0. 5% IPG buffer (3-10)，4% CHAPS，40mM 的 Tris HCl，pH 8. 8，0.002%溴酚蓝)，离心除去不溶性物质。蛋白吸附到Immobiline DryStrip, pH3-10，ll厘米(GE医疗集团，瑞典乌普萨拉)上。水化和等电聚焦(IEF)使用IPGphor系统(GE公司)根据制造商的说明进行。IEF后，IPG胶条在添加了 20毫克/毫升DTT的平衡缓冲液(6M 尿素，2% SDS，0. 375M Tris HCl，，pH 8. 8，20%甘油，0. 002%溴酚蓝)中 15 分钟，然后用添加了 25毫克/毫升碘乙酰胺平衡缓冲液再平衡15分钟。将平衡后的IPG 胶条放置在12%的SDS-PAGE凝胶上(BioRad公司)。2D-PAGE凝胶用银染色试剂盒(GE Healthcare公司)进行硝酸银染色。在这两种情况下，电泳后凝胶转移到硝酸纤维素膜(通用电气医疗集团)上。 杂交使用的探针为单个的(SDS-PAGE)或合并的(2D-PAGE)L. infantum感染的犬血清 (1 200)。，从北欧的免疫学实验室(蒂尔堡，荷兰)购买连接辣根过氧化物酶的抗犬IgG 的抗体(1 2000)作为二抗使用。统计分析通过使用非配对Mudent’ s t_检验，对所有数据的比较进行显著性检测，P值< 0. 05被认为是统计学上显著的。
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结果在犬感染中L. infantum的LRP的抗原性为了分析在犬感染中LRP的抗原性，将来自自然感染L. infantum的10只犬的血清与带有从该寄生虫中提取的LRP的硝酸纤维素膜共同孵育。所有受感染的动物血清中都能识别出这种寄生虫纯化的蛋白组分(图1A，泳道 4-13)。健康犬的血清呈阴性或微弱地在粗的核糖体准备物中具有一些多肽的染色(图1A， 泳道1- 。虽然不同的个体犬血清之间识别模式的复杂性和强度不同，但是大部分的CVL 血清都识别出了高数量的蛋白条带。尽管观察的不确定性，但是仍然在杂交中发现了两个免疫优势区域分别为45-36kDa和25_22kDa的多肽。为了在更高的细节上分析蛋白识别的模式，通过高分辨率的2D-PAGE分离LRP的提取物。如图IB右图所示，以制备蛋白上样量(20 μ g)制备的凝胶表现出良好的分辨率， 大部分碱性蛋白仅具有最小的条纹(图1，左图)。当2D-PAGE凝胶和上述相同的合并的血清孵育时，检测到了 20个抗原点(图1B，右图)。CVL的血清学诊断的SLA和LRP的比较为了确定LRP提取物是否可作为CVL的血清学诊断的一种有价值的工具，我们分析了 127犬血清样品对LRP和SLA的反应性。第一血清组由来自感染L. infantum (η = 28)或L chagasi (η = 44)的有症状的犬的72个血清样品组成。第二组由来自阳只健康犬的血清组成。图2A显示有症状的CVL和对照血清的吸光度值。对于这两种蛋白制剂，CVL和对照血清之间的差异都是统计学上显著的(P < 0. 001)。LRP和SLA的吸光度值的谱图是不同的，CVL血清对SLA的反应性(平均值= 1. 79 士 0. 64)要比对LRP的反应性(平均值=0. 90 士 0. 63)更高。如标准差(SD)所指示的， 尽管SLA作为抗原时SD较高，仍观察到了两种抗原制剂在单个血清样品吸光度值中的高可变性。健康血清对SLA的反应性(平均值=0. 38士0. 13)也高于对LRP的反应性(平均值 =0. 0卯4士0. 047)。在材料和方法中所述的ELISA条件中，两种抗原的截点值(定义为健康血清的平均反应性值从加3倍SD值)中，LRP为0. 237，而SLA为0. 774。这些截点值使我们能够识别阳性和阴性的血清，因此能测算ELISA的表现参数(见表1)。由于LRP在ELISA 检测法中表现出与SLA类似的表现(高灵敏度和特异性值)，可以得出结论，Leishmania的核糖体蛋白是合适的用于诊断有症状的CVL的抗原。接下来，对从轻症状(n = 7)和无症状(n = 7)的犬取得的血清进行了检测(图 2Β)。所述两组和健康对照的血清对LRP和SLA的反应性具有显著性差异(P < 0. 001)。虽然使用了有限的血清，但获得的数据表明，来自轻症状的犬的血清能够识别LRP和SLA制剂 (敏感性为100% )，来自30%无症状的犬(3/7)的血清表现出比截点值(图2Β)更高的针对SLA的吸光度值。另一方面，检测的所有无症状的犬血清表现出高于截点值的对LRP的吸光度值。因此，我们的结果表明，使用LRP可以作为一种优秀的CVL血清学诊断工具。LRP和SLA交叉反应由于LRP是由进化保守的蛋白组成的，我们分析了 LRP的提取物与其它单细胞原生动物(Toxoplasma gondii (η = 5)和Trypanosoma cruzi(n = 9))感染的犬血清的潜在的交叉反应。图3所示的是各组中各个血清对LRP的反应性。 T. gondii (平均值=0. 1012士0056)或T. cruzi(平均值=0. 101 士0.06)感染的犬血清没有表现出超过健康血清(见上文)给出的截点值的反应性。作为对照，检测了同一血清针对SLA的反应性。这些血清对SLA的平均反应性(T. gondii感染的犬为0. 6 士0. 21，而 T. cruzi感染的犬为0. 99士0. 29)高于观测到的对LRP的反应性。他们中的一些的反应性高于截点值(T. gondii感染的犬为1/5，而T. cruzi感染的犬为7/9)。检测了从接种两个在巴西获准生产的Leishmania预防疫苗Leishmune (29)和 Leishtec (15)的犬的血清针对LRP和SLA的提取物的反应性。我们发现，在将LRP的提取物用于ELISA检测时，22. 2% (4/18)的接种Leishmune 疫苗的健康犬的血清的光密度值 (0D值)超过了截点值(图3B)。当相同的血清基于ELISA检测对SLA进行分析时，16. 6% (3/18)的血清也超过截点值(图:3B)。接种Leishtec 疫苗的犬的23个血清没有表现出对SLA的反应性。这些血清中只有一个显示出对LRP的反应性，它的OD值接近在图2A中分析的阴性健康对照血清给出的截点值。讨论已将许多细胞内的细胞质的或核的Leishmania蛋白，如组蛋白，半胱氨酸蛋白酶或驱动蛋白确定为在人或犬内脏利什曼病(VL)中是抗原性的0，13，14，30，32，3幻。在这项工作中表明，寄生虫的核糖体蛋白在CVL疾病中也是抗原性的。虽然犬个体之间有一些个体差异，所有的有症状的犬的血清都表明对一些寄生虫核糖体组分有反应性。由于寄生虫的核糖体蛋白的抗原性在两种不同的皮肤利什曼病的小鼠模型中已经得到证实(22)，我们的结果表明，在Leishmania的自然和实验感染中，寄生虫核糖体与脊椎动物宿主免疫系统存在相互作用。由于伴随着与内脏Leishmania的种的感染的强烈的体液免疫反应，基于血清学技术的检测是诊断犬和人的内脏利什曼病(VL)最常见的方法。偶然观察到感染了 CVL的犬的血清对寄生虫核糖体蛋白提取物的高反应性，我们分析了 LRP的提取物的诊断学属性。将寄生虫核糖体蛋白作为ELISA检测的抗原的来源，这是因为对于用于VL疾病的诊断 (16,33)的大量样品的筛选，这种技术被认为是精确且敏感的技术。对前鞭毛体裂解物所得的LRP提取物与总总寄生虫蛋白进行比较分析，这是因为基于粗SLA的ELISA检测法的使用通常表现出VL诊断的高灵敏度(5，25，33)。当分析有症状和轻症状的血清时，LRP的提取物的敏感性和特异性值和SLA的情况相似。SLA与LRP相比具有略高的敏感性(分别为 100%和96% )，且只有来自健康犬的血清对LRP的吸光度值高于作为对照血清的反应性的截点值。因此，可以得出结论，基于LRP的ELISA检测的诊断表现与SLA制剂在诊断有症状的或轻症状的CVL的情况相似。然而，无症状的犬中的疾病的检测在流行病学研究中对控制犬之间，犬和人(3，20)之间传播的疾病起到关键作用。由于基于ELISA的SLA未能检测出较高百分比的无症状的CVL病例⑵’ 31)，我们分析了 LRP提取物在无症状的CVL的诊断中的敏感性。相比LRP的抗原混合物检测到了所有无症状的病例(100%)，使用SLA仅检测到约30%的病例。虽然对LRP的反应进一步确认需要使用数量较多的多症状和无症状样品，我们的数据表明，在所有形式的CVL疾病的诊断中，LRP可以作为比SLA更为敏感的抗原。使用的SLA的ELISA测试特异性很大程度上取决于抗原的制备与假阳性结果，假阳性结果是从患有地方病，如南美锥虫病、疟疾、麻风病或弓形虫病的患者或犬的血清中产生的(16，23，31)。出于这个原因，已将若干个寄生虫重组蛋白单独用做ELISA检测中的抗原，用于更特异的诊断测试的开发04)。在诊断内脏人类05)或犬利什曼病(31)中，当使用单独的重组抗原代替SLA时，比较ELISA检测法一般显示了较高的特异性，但敏感性较低。较低的敏感性值可能与每个受试者或受感染的的犬中观察到的寄生虫蛋白引起的异质体液免疫反应的差异有关。非相关抗原(31)或含多种寄生虫抗原(6，36)聚蛋白的产品的结合，可以进一步提高ELISA检测的表现。备选地，可以采用含有不同的寄生虫抗原的纯化的寄生虫碎片。我们的结果表明，T. cruzi或T. gondii感染的犬的血清并不识别LRP的提取物，而这些血清显示对SLA的高反应性。当血清来自接种疫苗的犬时，也保持了检测的诊断特异性。由于许可的商业疫苗 (15,29)的存在，需要区别于感染的犬和接种疫苗的动物。我们的结果表明，虽然一些接种 Leishmune 疫苗的动物的确显示了针对LRP的一定的反应性，但接种Leishtec 疫苗的动物没有显示了针对LRP的反应性。综合在此展示的结果，证明了 LRP提取物可作为一种用于CVL的ELISA诊断和疫区中无症状的动物的流行病学研究的，有意义的备用选择。表1.使用LRP和SLA的ELISA检测法用于血清学诊断有症状的CLV的敏感性和特异性
权利要求
1.核糖体蛋白提取物在诊断受试者中的寄生虫病中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述核糖体蛋白提取物含有至少两种核糖体蛋白和/或核糖体蛋白的至少两种抗原和/或核糖体蛋白的至少两个蛋白片段。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述蛋白片段为相应的核糖体蛋白的含有至少 2、3、5、7、10、15、20、25、30个或更多个的连续的氨基酸的片段。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的用途，其中，所述核糖体蛋白提取物不含有如EP 824 699所公开的来源于Leishmaniasis chagasi的酸性核糖体蛋白抗原LcPo的抗原决定簇或不由如EP 824 699所公开的来源于Leishmaniasis chagasi的酸性核糖体蛋白抗原LcPo的抗原决定簇组成，更优选地，所述核糖体蛋白提取物不含有LcPo的C末端的 17个氨基酸或不由LcPo的C末端的17个氨基酸组成=LcPo的C末端的17个氨基酸为SEQ ID NO 1所示的LcPo的氨基酸306-322。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的用途，其中，所述核糖体蛋白提取物是使用出现于受试者中时引起寄生虫病的寄生虫细胞，通过进行如下步骤得到的a.将寄生虫细胞与裂解缓冲液混合，b.将所得的混合物离心，得到细胞质提取物，c.从得到的细胞质提取物中制备核糖体蛋白提取物。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的用途，其中，所述核糖体蛋白提取物是从 Leishmania的种中得到的，优选是从Leishmania major中得到的。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的用途，其中，所述寄生虫病为利什曼病或疟疾。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的用途，其中，所述寄生虫病是由Leishmania 的种或Plasmodium的种引起的。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的用途，其中，引起寄生虫病的种不同于核糖体蛋白提取物来源的种。
10.一种使用权利要求1至9中任意一项中所定义的核糖体蛋白提取物来诊断受试者中的寄生虫病的方法，该方法包括测定在从受试者得到的样品中是否存在识别核糖体蛋白提取物的抗体。
11.一种诊断受试者中的寄生虫病的检测法，其中，所述检测法包括核糖体蛋白提取物。
12.根据权利要求11所述的检测法，其中，所述检测法为ELISA。
全文摘要
本发明涉及一种使用RPE的利什曼病的诊断方法。
文档编号G01N33/569GK102483413SQ201080031595
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月13日 优先权日2009年7月13日
发明者C·A·贝达特, E·A·F·科尔贺, L·拉米雷斯加西亚, M·S-阿尔瓦雷斯 申请人:热体实验室有限公司