专利名称：一种小分子核糖体失活蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及南瓜籽中一种小分子核糖体失活蛋白及其制备和应用。
在本文中，小分子核糖体失活蛋白可被定义为至少具有下列活性之一的蛋白质RNA-N糖苷酶活性，引产蛋白活性，抗肿瘤或抗病毒活性。该蛋白是寡聚的单肽链的简单蛋白或糖蛋白，且分子量小于15KD。
一般说来；来源于高等植物的核糖体失活蛋白，主要分为两类，类型I是单肽链蛋白，例如，天花粉蛋白(Trichosanthin)，丝瓜籽蛋白(Luffin)，八棱丝瓜蛋白(Luffaculin)，肥皂草素(Saporin)等。类型II是双肽链蛋白，例如，蓖麻毒素(Ricin)和相思子毒素(Abrin)。类型I蛋白以及类型II蛋白的A链都是通过裂解核糖体内28SrRNA的4324位腺嘌呤的N-糖苷键而使真核细胞核糖体60S亚基失活(Endo and Tsaragi1987，J.Biol.Chem.2628128-8130，Stirpe，F.et al.，1988，Nacl.AcidRes.161349-1357)。关于类型I和类型II的核糖体失活蛋白已经有很多的专利和文献报道。
南瓜(Cucurbita moschata)是葫芦科南瓜属的一种品种，南瓜及其种籽均是常见蔬菜和干果。钟雪梅等人(1994，生物化学杂志，10397-401)从笋瓜籽(Cucurbita maxima)中分离到一种核糖体失活蛋白Maximin，其分子量为28KD，IC50为4.0×10-10Mol/L，与天花粉蛋白活性相似。Yoshinari，S；et al从西葫芦(Cucurbita pepo)中分离出一种核糖体失活蛋白Pepocin，其分子量为26KD，IC50为1.54×10-11Mol/L。该属植物中其它的核糖体失活蛋白未见报道。
目前，已从葫芦科植物中分离出两种小分子核糖体失活蛋白。一种是从苦瓜籽中分离到的r-momorcharin(Zheng pu et al.，1996，Biochem.Biophys.Res.Com.229287-294)，一种是从丝瓜籽中分离到的一组丝瓜籽小分子核糖体失活蛋白LuffinS(熊长云，张祖传，1998，生物化学与生物物理学报，30142-146)。
本发明的目的是从南瓜属植物南瓜籽中分离出一种小分子核糖体失蛋白，SDS-PAGE显示它的分子量为10KD，蛙卵活性测试(熊用周等，中国科学B辑587-594，1992)表明其具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成活性。
本发明采用二种简单、温和的分离纯化方法一种是缓冲溶液抽提，硫酸铵沉淀，CM-Sephadex C25离子交换层析。另一种是稀酸溶液抽提，硫酸铵沉淀，CM-纤维素离子交换层析。二种方法均可获得高产率、高纯度和高活性的蛋白。
南瓜籽中r-Cucurmosin蛋白的分离纯化流程见附图3，具体操作如下方法(一)[1]粗提取若干成熟的南瓜种籽粉碎后，加磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，匀浆二次，置4℃过夜。预处理用双层纱布或离心去掉粗渣得粗提液，用盐酸或醋酸调pH，静置(多于)2小时，高速离心得上清液，加固体硫酸铵沉淀静置后离心得硫酸铵沉淀，对流水透析24小时后，冷冻离心，得黄色上清液。上CM-Sephadex C25柱洗脱上清液上CM-Sephadex C25阳离子交换柱，用含0.3M NaCl的平衡缓冲液洗脱，通过280nM实时检测蛋白，当洗至基线后，改用含1M NaCl的磷酸缓冲液洗脱，合并该洗脱组分。冻干由[3]所得合并组分溶液，经充分透析后，冷冻干燥得冻干粉即为r-Cucurmosin。方法(二)[1]粗提取若干成熟南瓜种籽粉碎后，加3％醋酸浸泡匀浆后，再加1.5％醋酸浸泡，匀浆，过滤或离心得抽提液。预处理用NaOH调pH，然后加固体硫酸铵，静置后离心得硫酸铵沉淀，沉淀对缓冲液透析，冷冻离心得黄色上清液。上CM-52纤维素柱由[2]上清液上CM-52纤维素阳离子交换柱。其它洗脱和样品收集过程同方法(一)。
使用本发明的分离纯化方法，可以从葫芦科其它种属植物的成熟的种籽(如八棱瓜种籽、冬瓜种籽、甜瓜种籽等)中分离出小分子核糖体失活蛋白，其分子量在10KD左右，并具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。
本发明的小分子核糖体失活蛋白与天花粉蛋白相类似，可以用作引产药物或抗肿瘤抗病毒制剂使用。
本发明的小分子核糖体失活蛋白对细胞内蛋白质生物合成有强烈抑制作用(活性比天花粉蛋白略强)，但分子较小，分子量只有天花粉蛋白的1/3到1/2，因此更适合于作免疫毒素的“弹头”材料。
本发明的小分子核糖体失活蛋白可以作为RNA M-糖苷酶用于分子生物学和免疫学研究。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果(1).南瓜籽是民间常用食物；(2).本发明的方法不使用有机试剂脱脂，而采用温和的提取方法可获得一种新的小分子核糖体失活蛋白(蛙卵活性测试)；(3).本发明与本属植物中分离的笋瓜籽蛋白和Pepocin均不同，后两者都属于类型I核糖体失活蛋白，分子量大约26～28KD，而本发明是一种小分子核糖体失活蛋白，分子量只有10KD。
现在对附图作图面说明
图1.显示南瓜籽的小分子核糖体失活蛋白的阳离子交换层析图；图2.显示南瓜籽的小分子核糖体失活蛋白的SDS-PAGE图；图3.显示r-Cucurmosin蛋白的分离纯化流程，其中(1)粉碎、(2)匀浆、(3)抽提、(4)离心、(5)硫酸铵沉淀、(6)透析、(7)离子交换层析、(8)冻干。
下面结合附图通过实施例来进一步描述本发明实施例1.从南瓜籽中纯化r-Cucurmosin，用方法(一)取200g的干的南瓜籽，经粉碎机粉碎后，加PBS匀浆二次，置4℃抽提后，用几层纱布过滤或离心得抽提液，加1N HCl调pH4，静置(多于)2h，用滤纸过滤或离心得清液，加固体硫酸铵至40％饱和度，过滤去掉残渣，滤液续加固体硫酸铵至95％饱和度，静置后离心得硫酸铵沉淀，沉淀溶于少量缓冲液，对流水透析24h后，再对5mM磷酸钠缓冲液透析(置4℃)，冷冻离心后，得淡黄色上清液，加样上CM-Sephadex C25柱(Pharmacia产品)(预先用5mM磷酸钠缓冲液pH6.5平衡好)，经洗脱两个柱床体积后，用含0.3MNaCl的5mM磷酸钠缓冲液洗脱，洗脱液通过实时测量于280nM吸收率而检测蛋白，当洗脱曲线达到基线后，改用含1M NaCl的5mM磷酸钠缓冲液洗脱，合并洗脱组分(见图1)，冷冻保存或对蒸馏水彻底透析除盐后冷冻干燥。合并的洗脱组分即r-Cucurmosin。它的SDS-PAGE图见附图2。
实施例2.从南瓜籽中纯化r-Cucurmosin，用方法(二)取200g的干的南瓜籽，经粉碎机粉碎后，加500ml 3％醋酸浸泡匀浆后，再加200ml 1.5％醋酸浸泡，匀浆，过滤或离心得抽提液，用5N NaOH调pH5.0，然后加固体硫酸铵至40％饱和度，过滤去掉残渣，滤液续加固体硫酸铵至95％饱和度，离心得硫酸铵沉淀，沉淀溶于少量5mM磷酸钠缓冲液pH6.5，并对该缓冲液透析(置4℃，其中换液至少三次)，经冷冻离心得上清液，加样在CM-纤维素(Backman产品)，其它洗脱和样品收集过程同方法(一)。
实施例3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)南瓜籽抽提液和南瓜籽小分子核糖体失活蛋白，在Bio-Rad公司的微量垂直平板电泳仪上进行SDS-PAGE，SDS-PAGE按Leammli的方法进行，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为4％，电泳后按郭尧君方法(1991，生物化学与生物物理进展，1832-37)，用考马斯亮兰染色，以天花粉蛋白(MW～27KD)和溶菌酶(MW～14KD)为分子量标准对照，SDS-PAGE结果见附图2。
实施例4.
本发明的南瓜籽小分子核糖体失活蛋白(r-Cucurmosin)，经蛙卵活性测试(熊用周等，中国科学B辑587-594，1992)表明具有强烈抑制细胞核糖体蛋白质合成活性，其活性比天花粉蛋白略高；可以作为天花粉蛋白或其它核糖体失活蛋白治疗药剂的替代物.
权利要求
1.一种小分子核糖体失活蛋白(r-Cucurmosin)，其特征在于，该蛋白是从南瓜籽中分离纯化而得到，它的分子量(用SDS-PAGE检测)为10KD。
2.如权利要求1所述的小分子核糖体失活蛋白，其特征在于，它具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成活性。
3.一种权利要求1的小分子核糖体失活蛋白的分离纯化方法，包括盐或稀酸溶液抽提、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose C25或CM-纤维素离子交换层析等步骤，其特征在于，通过CM-Sepharose C25或CM-纤维素离子交换层析。
4.一种权利要求3的小分子核糖体失活蛋白的分离纯化方法，其特征在于，用相似的方法可以从葫芦科其它种属植物的成熟的种籽(如八棱瓜种籽、冬瓜种籽、甜瓜种籽等)中分离出小分子核糖体失活蛋白，其分子量在10KD左右，并具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。
5.一种权利要求1的小分子核糖体失活蛋白的应用，其特征在于，它能作为引产蛋白用于引产，治疗相关肿瘤病和病毒性感染疾病，以及开发用作制备免疫毒素的“弹头”材料。
全文摘要
本发明涉及一种小分子核糖体失活蛋白－r－Cucurmosin,是从葫芦科植物南瓜种籽中分离出来的,其分子量为10KD(用SDS－PAGE检测)。采用了简单、温和的提取方法,获得了高产率、高纯度、高活性的蛋白。该蛋白可以作为引产药物和抗肿瘤制剂的商业应用,并可用作免疫毒素的“弹头”材料。
文档编号C07K1/00GK1263106SQ99102289
公开日2000年8月16日 申请日期1999年2月11日 优先权日1999年2月11日
发明者陈明晃, 叶晓明 申请人:中国科学院福建物质结构研究所