一种石油降解菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于石油降解技术领域，尤其涉及一种石油降解菌剂;本发明还涉及一种 上述石油降解菌剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着石油开发、船舶运输及石油工业的日益发展，海上溢油事故频繁发生，石油污 染给海洋环境和海洋生态系统带来了严重的危害，并能直接或间接的影响着人类的生存和 可持续发展。据联合国环境规划署报告，每年流入海洋的石油为200万吨至2000万吨，石油 污染已成为一个世界性的污染问题。2010年发生在墨西哥湾的泄油事件是美国历史上最严 重的海洋污染事件之一，其所造成的生态损伤和经济损失不可估量。
[0003] 溢油多发生在海上，随着风浪漂移至海岸线的油品不仅造成严重环境污染，而且 由于石油烃类污染物的潜在毒性和生物积累效应会导致近岸海域环境质量和生物种类多 样性指数严重下降，海洋生态系统遭受严重破坏，也会对水产业和旅游业造成巨大损失。
[0004] 生物修复(Bioremediation)指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物， 减小或最终消除环境污染的受控或自发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环 保技术。早在1972年，美国利用生物修复技术清除宾夕法尼亚州的Ambler管线泄露的汽油； 之后1989年，美国大规模应用生物修复技术成功处理了阿拉斯加海滩的石油污染，从此生 物修复技术开始成为环境科学的研究热点与前沿。
[0005] 生物修复的机理是依靠微生物细胞的吸收氧化作用，对污染物进行分解同化，将 污染有机物转变为细胞的组成部分，或者转变成H 20和C02排出体外，从而实现对有机污染的 修复。与动物和植物相比，微生物具有比表面积大、繁殖快、适应性强、使用范围广等优点， 具有强大的降解与转化能力。目前，利用微生物进行污染环境的修复倍受国内外研究学者 的重视，具体工作主要集中在寻找高效降解菌、提高污染物的可利用性以及为微生物提供 更合适的环境三方面。该技术分为生物促进（biostimulation)和生物强化 (bioaugmentation)两大类型。生物促进法是通过添加营养物或改变环境因子，以促进微生 物的代谢能力。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，并提供一种石油降解菌剂及其制备方 法，旨在通过生物修复方式对海底石油污染进行有效修复，提高石油降解能力，为解决石油 污染问题提供突破点。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢 酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为1〇 9~l〇1()Cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵 母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3:2: 2:1:1的质量比混合均匀，得 混合菌种；
[0010] (2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发 酵培养基中接种步骤（1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1:10-15,将接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、27-30°C条件下连 续发酵48-60小时；
[0011] (3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充 分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；
[0012] (4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9 % NaCl溶液和海泥浸出 液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9 %NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1: (20-40)，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1: (0.5-0.8);
[0013] (5)称取重量份数为15-20份的懦稻根、15-20份的蜂房、10-15份的石植皮，将称量 好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15_30min，将灭菌后的混合物和步 骤(4)所得的菌体混合溶液按照1:2的重量比混合均匀;于37°C恒温培养2-5天，得到固体菌 剂并在4°C条件下密封保存。
[0014]进一步地，所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有5_8g的 酵母粉、5_8g麦麸、16-20g蛋白胨、4-6g葡萄糖、8-12g玉米淀粉、0.6-lg贝壳粉、0.5-0.9g膨 润土、0.8-1.2g的MgS〇4 · 7H20、0.3-0.6g的Na2HP〇4、0.1-0.3g磷酸二氢钾、余量的去离子水 定容至1L。
[0015] 进一步地，所述海泥浸出液的制备方法为:将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛 后加入提取罐中，将质量浓度为50%的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开 启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80°C条件下提取30min，100目过滤取滤 液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出 液。
[0016] 本发明中，步骤(2)的发酵步骤的作用在于促进混合菌种的再生长，且本发明的液 体发酵培养基能为混合菌种提供充分的营养，有利于发挥各菌株之间的协同作用。步骤(3) ~步骤(5)的操作既可保证菌体的密度又可保证营养物质的摄取;0.9%NaCl溶液、海泥浸 出液、糯稻根、蜂房、石榴皮按照特定的比例与粘稠状菌体细胞混合均匀，既满足了混合菌 株生长所需的营养物质，使本发明的石油降解菌剂投放到石油污染土壤环境后能够暂时得 到养分供给，而且菌剂制备过程简单经济，糯稻根、蜂房、石榴皮均为天然材料，生物可降解 性好，环境友好且安全，不会对环境带来二次污染。因此本发明在石油污染土壤的生物修复 过程中具有广阔的应用前景。此外，本发明所得的固体菌剂运输和贮存方便。
[0017] 优选地，步骤(2)中的发酵温度为28°C。
[0018]优选地，步骤⑷中，所述0.9%NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1:30。
[0019] 优选地，步骤(4)中，海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1:0.6。
[0020] 优选地，所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有6g的酵母 粉、6g麦麸、18g蛋白胨、5g葡萄糖、10g玉米淀粉、0.8g贝壳粉、0.8g膨润土、lg的MgS〇4 · 7出0、0.48的似2即〇4、0.28磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1匕
[0021] -种利用上述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
[0022] 本发明中的菌种均为公众商业渠道可以买到的生物材料。其中，惰性柄杆菌，拉丁 名称:Caulobacter segnis，可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，CGMCC菌种 编号NO. 4.1475,可用于处理石油污染；
[0023] 近平滑假丝酵母，拉丁名称:Candida parapsilosis，可购自中国工业微生物菌种 保藏管理中心((：10：)，(：10：菌种编号为从).1693，能发酵分解石油；
[0024] 抗酸小短杆菌，拉丁名称：Brachybacterium phenoliresistens，可购自中国工业 微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为N0.23825，革兰氏阳性菌，可用于处理石 油污染；
[0025] 球形节细菌，拉丁学名Arthrobacter globiformis，属于细菌界Bacteria，放线菌 门Actinobacteria，放线菌纲Actinobacteria，放线菌目 Actinomycetales，微球菌科 Micrococcaceae，节细菌属Arthrobacter，能消耗掉石油经类化合物；
[0026] 鲑色锁掷孢酵母，拉丁名称:Sporidiobolus salmonicolor，可购自中国工业微生 物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为N0.31636,可利用烷烃为碳源，可用于处理石 油污染。
[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0028] (1)本发明中使用惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及 鲑色锁掷孢酵母菌种作为高效石油降解菌群，该菌群降解率高，各菌株之间的协同效果好， 环境适应性强。
[0029] (2)本发明中，步骤(2)的发酵步骤的作用在于促进混合菌种的再生长，且本发明 的液体发酵培养基能为混合菌种提供充分的营养，有利于发挥各菌株之间的协同作用。步 骤(3)~步骤(5)的操作既可保证菌体的密度又可保证营养物质的摄取;0.9%NaCl溶液、海 泥浸出液、糯稻根、蜂房、石榴皮按照特定的比例与粘稠状菌体细胞混合均匀，既满足了混 合菌株生长所需的营养物质，使本发明的石油降解菌剂投放到石油污染土壤环境后能够暂 时得到养分供给，而且菌剂制备过程简单经济，糯稻根、蜂房、石榴皮均为天然材料，生物可 降解性好，环境友好且安全，不会对环境带来二次污染。因此本发明在石油污染土壤的生 物修复过程中具有广阔的应用前景。本发明所得的固体菌剂运输和贮存方便。
[0030] (3)本发明操作简单、修复效果好、成本费用低、无二次污染、易于产