重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。
[0062] 一种利用上述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
[0063] 实施例4
[0064] -种石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0065] (1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢 酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为1〇 9~l〇1()Cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵 母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3: 2: 2:1:1的质量比混合均匀，得 混合菌种；
[0066] (2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发 酵培养基中接种步骤(1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1:12,将 接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、28°C条件下连续发酵55 小时；
[0067] (3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充 分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；
[0068] (4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9 % NaCl溶液和海泥浸出 液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9%NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1:30， 所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1:0.6;
[0069] (5)称取重量份数为15-20份的糯稻根、15-20份的蜂房、10-15份的石榴皮，将称量 好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15_30min，将灭菌后的混合物和步 骤(4)所得的菌体混合溶液按照1:2的重量比混合均匀;于37°C恒温培养2-5天，得到固体菌 剂并在4°C条件下密封保存。
[0070] 所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有6g的酵母粉、6g麦 麸、18g蛋白胨、5g葡萄糖、10g玉米淀粉、0.8g贝壳粉、0.8g膨润土、lg的MgS〇4 · 7H2〇、0.4g的 他2冊〇4、0.28磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1匕
[0071 ]所述海泥浸出液的制备方法为:将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提 取罐中，将质量浓度为50%的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌， 将提取罐置于恒温水浴摇床，在14〇 rpm、7〇-80°C条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤 渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。 [0072] 一种利用上述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
[0073]本发明中，步骤(2)的发酵步骤的作用在于促进混合菌种的再生长，且本发明的液 体发酵培养基能为混合菌种提供充分的营养，有利于发挥各菌株之间的协同作用。步骤(3) ~步骤(5)的操作既可保证菌体的密度又可保证营养物质的摄取;0.9%NaCl溶液、海泥浸 出液、糯稻根、蜂房、石榴皮按照特定的比例与粘稠状菌体细胞混合均匀，既满足了混合菌 株生长所需的营养物质，使本发明的石油降解菌剂投放到石油污染土壤环境后能够暂时得 到养分供给，而且菌剂制备过程简单经济，糯稻根、蜂房、石榴皮均为天然材料，生物可降解 性好，环境友好且安全，不会对环境带来二次污染。因此本发明在石油污染土壤的生物修复 过程中具有广阔的应用前景。此外，本发明所得的固体菌剂运输和贮存方便。
[0074]实验结果
[0075]分别称取5g本发明实施例1-实施例4的石油降解菌剂，分别添加至100ml的受污染 水体(受污染水体采自于2013年11月22日黄岛输油管线发生爆炸后胶州湾岸滩受溢油污染 的水体），置于恒温水浴摇床，在140rpm、18°C条件下培养15天。以受污染水体(受污染水体 采自于2013年11月22日黄岛输油管线发生爆炸后胶州湾岸滩受溢油污染的水体）中加入5g 灭菌后的天然海水的处理组为对照组。
[0076] 对照组以及利用本发明实施例1-实施例4的石油降解菌剂的制备方法制备得到的 石油降解菌剂对石油降解性能的影响见下表：
[0077]
[0078]
[0079]实验结果表明，采用本发明制得的石油降解菌剂的石油降解率可达到67.63%以 上，显著高于惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵 母中的任意一种菌株的石油降解率，说明本发明的菌群降解率高，各菌株之间的协同效果 好。也表明本发明制得的石油降解菌剂在可有效加快溢油污染岸滩环境的恢复进程。
[0080]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保 护范围。
【主权项】
1. 一种石油降解菌剂的制备方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母 菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为1〇9~l〇1()cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗 酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3:2:2:1:1的质量比混合均匀，得混合菌 种； (2) 将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发酵培 养基中接种步骤（1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1:10-15,将 接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、27-30°C条件下连续发酵 48-60小时； (3) 用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充分搅 拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞； (4) 向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9 %NaCl溶液和海泥浸出液， 并混合均匀，得菌体混合溶液，所述〇.9%NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1:(20-40)，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1: (0.5-0.8); (5) 称取重量份数为15-20份的懦稻根、15-20份的蜂房、10-15份的石植皮，将称量好的 糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15_30min，将灭菌后的混合物和步骤(4) 所得的菌体混合溶液按照1:2的重量比混合均匀；于37°C恒温培养2-5天，得到固体菌剂并 在4°C条件下密封保存； 所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有5-8g的酵母粉、5-8g麦 麸、16-20g蛋白胨、4-6g葡萄糖、8-12g玉米淀粉、0.6-lg贝壳粉、0.5-0.9g膨润土、0.8-1.2g 的MgS〇4 · 7H20、0.3-0.6g的Na2HP〇4、0.1-0.3g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L; 所述海泥浸出液的制备方法为:将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提取罐 中，将质量浓度为50%的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌，将提 取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80°C条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回 提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。2. 根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的发酵温 度为28°C。3. 根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤（4)中，所述 0.9%NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1:30。4. 根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于:步骤(4)中，海泥浸出 液与粘稠状菌体细胞的重量比为1: 〇. 6。5. 根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于:所述液体发酵培养基 的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有6g的酵母粉、6g麦麸、18g蛋白胨、5g葡萄糖、10g玉 米淀粉、〇 · 8g贝壳粉、0 · 8g膨润土、lg的MgS〇4 · 7H20、0 · 4g的Na2HP〇4、0 · 2g磷酸二氢钾、余量 的去离子水定容至1L。6. -种利用权利要求1-5中任一项所述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解 菌剂。
【专利摘要】本发明涉及一种石油降解菌剂；还涉及一种上述石油降解菌剂的制备方法。本发明的石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为109～1010cfu/g，并按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；(2)将混合菌种在液体发酵培养基中发酵48-60小时；(3)离心分离得粘稠状菌体细胞；(4)将粘稠状菌体细胞和0.9％NaCl溶液和海泥浸出液混匀；(5)添加营养物质后在4℃条件下密封保存。本发明对石油的降解率高。
【IPC分类】C12R1/06, C12N1/16, C12R1/645, C12R1/01, C12N1/20, B09C1/10, C12R1/72
【公开号】CN105483058
【申请号】CN201610027788
【发明人】赵升, 韩龙江, 耿晓, 潘玉龙, 刘欣禹, 周瑞佳
【申请人】国家海洋局北海环境监测中心
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月9日